Factor de Von Willebrand, ADAMTS13, y Púrpura Trombocitopénica Trombótica
El VWF se sintetiza a partir de un gran gen en el cromosoma 12p13.31 que abarca 178 kb y contiene 52 exones.49 El ARN mensajero (ARNm) producido por este gen especifica un polipéptido de 2.813 aminoácidos, que incluye un péptido señal de 22 aminoácidos, un propéptido de 742 aminoácidos y una secuencia de 2.050 aminoácidos que constituye el bloque de construcción monomérico del FVW que se encuentra en el plasma. Tras la escisión del péptido señal en el retículo endoplásmico, los monómeros que contienen el propéptido se disulfuran para formar dímeros mediante enlaces disulfuro entre cadenas que implican residuos de Cys cerca del extremo C de la molécula. Estos dímeros son transportados al aparato de Golgi, donde el propéptido cataliza los enlaces disulfuro interdiméricos entre los residuos del dominio D3, dando lugar a largos multímeros compuestos por dímeros unidos cabeza con cabeza que contienen N-terminales en ambos extremos. A continuación, el propéptido es escindido por una enzima similar a la furina y la mayor parte del FVL resultante se empaqueta en gránulos de almacenamiento para su posterior secreción regulada.
Sólo se conocen dos tipos de células que sintetizan FVL: las células endoteliales y los megacariocitos. En las células endoteliales, el VWF se almacena en gránulos llamados cuerpos de Weibel-Palade; en las plaquetas, se almacena en gránulos α. La mayor parte del FVW en la sangre es de origen endotelial. Muchos estímulos pueden inducir la liberación del FVW endotelial, como la epinefrina, la desamino-vasopresina (DDAVP), la histamina, la trombina, las toxinas Shiga y las citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-8 y la IL-6 (en complejo con el receptor de la IL-6).50 Otros agentes también pueden inducir la liberación endotelial del FVW, lo que proporciona pistas sobre algunos de los factores desencadenantes de la PTT. Estos agentes incluyen virus como el adenovirus51 y oxidantes como el superóxido.52 Los oxidantes no sólo tienen la capacidad de inducir la secreción de FVL, sino que también pueden oxidar el FVL para que no pueda ser eliminado por ADAMTS1353 y sea más adhesivo.54 Además, los oxidantes, especialmente los producidos por neutrófilos y monocitos durante la inflamación, pueden oxidar un residuo de metionina crucial en el dominio catalítico de ADAMTS13 e inactivar la enzima.55
Tanto las células endoteliales como las plaquetas liberan multímeros de FVW que son más grandes que los multímeros del plasma normal.56 Estos multímeros del ULVWF no sólo son mucho más grandes que los que se encuentran normalmente en el plasma; también son mucho más adhesivos y capaces de unirse a la glicoproteína Ib del receptor del VWF de las plaquetas (GPIbα; el polipéptido más grande del complejo GPIb-IX-V) de forma espontánea y con una fuerza de unión mayor que la que se consigue con la unión del VWF plasmático a la GPIbα en presencia de los moduladores ristocetina o botrocetina.57 In vivo, esto se traduce en que el ULVWF es capaz de unirse a las plaquetas con una tensión de cizallamiento nula o baja, mientras que el VWF plasmático procesado requiere un despliegue inducido por una tensión de cizallamiento elevada para unirse a las plaquetas.58
Una parte del FVL recién liberado entra directamente en la sangre circulante mientras que otra fracción permanece unida al endotelio, donde los multímeros del FVL pueden autoasociarse para formar cordones de varios cientos de micrómetros a varios milímetros de longitud que permanecen anclados a la superficie endotelial.59 Los cordones de FVL unidos a la superficie son hiperadhesivos y se unen espontáneamente a las plaquetas para formar cordones decorados con plaquetas con apariencia de «cuentas sobre cordones» en la superficie endotelial. En condiciones de cizallamiento fisiológico, las cadenas de ULVWF decoradas con plaquetas son escindidas por ADAMTS13 y eliminadas de la superficie endotelial. El procesamiento posterior, que aún no está completamente caracterizado, hace que el VWF no pueda unirse espontáneamente a las plaquetas. La acumulación de cadenas de ULVWF decoradas con plaquetas en la superficie endotelial como resultado de niveles reducidos o de la ausencia de ADAMTS13 en la circulación inicia la trombosis microvascular, que conduce a la formación y deposición de trombos hialinos ricos en plaquetas en la microvasculatura, una característica definitoria de la PTT.
Las cadenas de ULVWF consisten en haces de multímeros de VWF, y cada cadena está unida a la superficie endotelial en varios sitios de anclaje. En ausencia (o a bajas concentraciones) de Ca2+ y Mg2+, las cadenas del ULVWF se unen a la superficie endotelial mediante la unión a la P-selectina.60 En presencia de concentraciones fisiológicas de cationes divalentes, las hebras de ULVWF se anclan a la superficie endotelial a través de su interacción con la integrina αvβ3.61 Otras moléculas están indudablemente implicadas en este anclaje de las hebras de VWF, pero todavía no han sido identificadas.
La capacidad del VWF o de los multímeros de ULVWF de autoasociarse en fibras y cables más gruesos se convierte en un mecanismo importante para regular las propiedades adhesivas del VWF. Savage et al. demostraron que bajo tensión de cizallamiento y en presencia de plaquetas, los multímeros del VWF en la fase fluida se asocian de forma homotípica y reversible con los multímeros del VWF inmovilizados en una superficie de colágeno; los multímeros del VWF autoasociados favorecen la adhesión de las plaquetas bajo tensión de cizallamiento.62 Los multímeros de VWF en fase fluida también pueden asociarse con cadenas de ULVWF unidas a la superficie endotelial,63 y la autoasociación se ve facilitada por el desdoblamiento parcial de las moléculas de VWF inducido por la tensión de cizallamiento64,65 o por la unión de ristocetina.66 Los multímeros de VWF autoasociados forman una red de fibras reticuladas en las superficies de colágeno64 o en solución.66 Bajo tensión de cizallamiento, los multímeros de VWF en fase fluida también pueden asociarse con los multímeros de VWF que están unidos a las plaquetas mediante la interacción con GPIbα en las superficies de las plaquetas.67 La autoasociación del VWF en las superficies de las plaquetas puede desencadenar la activación de las mismas, promover su agregación y potenciar el crecimiento del trombo.
La capacidad de autoasociación del VWF le permite producir filamentos que rivalizan o superan la longitud y el grosor de los producidos por la polimerización de la fibrina. En microvasos sintéticos inducidos a secretar VWF mediante la estimulación de un agonista, el VWF secretado por la pared del vaso podría ensamblarse en hebras capaces de abarcar el lumen del vaso, particularmente en las bifurcaciones y curvas.68 La capacidad del VWF para formar filamentos y cables de dimensiones tan enormes y ensartar esos cables a lo largo de la trayectoria del flujo no sólo aumenta las posibilidades de que los filamentos capturen plaquetas, sino que también aumenta su capacidad para desmenuzar los eritrocitos hasta convertirlos en esquistocitos.
La propia autoasociación del VWF está regulada no sólo por la tensión de cizallamiento, sino por factores plasmáticos, que probablemente pueden cambiar el curso y la gravedad de los episodios de PTT. La autoasociación del FVW se ve atenuada por las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y por la apoliproteína (Apo) A-I, el principal componente proteico de las HDL. Ambos reducen significativamente la longitud y el grosor de las fibras de VWF inmovilizadas en la superficie endotelial. La adhesión de las plaquetas a estas estructuras hiperadhesivas también se reduce en proporción a la reducción del VWF autoasociado. En un modelo de MAT en ratones knockout en ADAMTS13, las HDL también atenuaron significativamente la trombocitopenia inducida por la infusión de altas dosis de FVW humano.69 En consonancia con la capacidad de la ApoA-I de modular la autoasociación del FVW, su concentración plasmática se correlaciona inversamente con el nivel de FVW hiperadhesivo en pacientes con PTT y sepsis. Estos resultados sugieren que la interferencia con la autoasociación del VWF podría ser un nuevo enfoque para tratar los trastornos trombóticos asociados con el VWF hiperadhesivo, incluida la PTT.
La metaloproteasa que rompe el VWF es el decimotercer miembro de una familia de 18 enzimas distintas del tipo ADAMTS identificadas hasta la fecha que comparten similitudes estructurales.16,17 La ADAMTS13 se compone de un dominio metaloproteico de tipo reprolysin (M) en su extremo N, seguido de un dominio de desintegración (D), un dominio similar a la trombospondina-1 (T), un dominio rico en cisteína (C) que contiene una secuencia de arginina-glicina-aspartato, un dominio espaciador (S), siete dominios adicionales similares a la trombospondina-1 (T2-8) y dos dominios no idénticos de tipo CUB (CUB1-2) en el extremo C-terminal de la molécula (Fig. 24.2). Los dominios CUB contienen secuencias peptídicas similares a los subcomponentes del complemento C1r/C1s, a la proteína del erizo de mar embrionario egf y a la proteína morfogénica ósea-1.70 ADAMTS13 es una glicoproteína de 190.000 daltons que requiere Zn2+ y Ca2+, cuyo gen reside en el cromosoma 9q34 y se produce predominantemente en las células estrelladas del hígado.71,72 El ADAMTS13 es inhibido por el EDTA; por lo tanto, los ensayos funcionales de la enzima se realizan mejor en plasma citratado.12,14-17,73-77 El plasma anticoagulado con heparina, clorometilcetonas (por ejemplo, clorometilcetona de fenilalanina-prolina-aspartato), hirudina y otros inhibidores directos de la trombina (IDT) también sería satisfactorio para las pruebas. El suero tratado adecuadamente con inhibidores de la proteasa también es adecuado para las pruebas.78
La escisión del VWF por ADAMTS13 depende de los cambios conformacionales del VWF provocados por la tensión de cizallamiento, una fuerza que cambia la conformación de los multímeros del VWF de globular a abierta.79 A esta transición conformacional le sigue el desdoblamiento de uno o más dominios A2 dentro del multímero del VWF, exponiendo el enlace peptídico Tyr1605-Met1606 a la escisión por ADAMTS1379 o a la oxidación de Met1606 por hipoclorito.54 Además de la fuerza de cizallamiento, la transición a la conformación accesible también se ve facilitada por cambios en la estructura del dominio A2 causados por la unión de carbohidratos,80 sustituciones de aminoácidos en la VWD de tipo 2A que desestabilizan el plegado del dominio A2,81 y mutaciones en la VWD de tipo 2B82 y la unión de ristocetina,83 que exponen simultáneamente el dominio A1 para la unión de plaquetas y el sitio de escisión de ADAMTS13.
El reconocimiento y la escisión del VWF por ADAMTS13 se han estudiado ampliamente. Pruebas recientes demuestran que en la molécula nativa de ADAMTS13, los dominios C-terminal T8-CUB están en contacto con los dominios N-terminal MDTCS, una interacción intramolecular que inhibe parcialmente la capacidad de los dominios MDTCS para unirse y escindir el péptido sustrato VWF-78. En esta conformación nativa, la ADAMTS13 está parcialmente autoinhibida.84,85 La capacidad de la ADAMTS13 para plegarse en esta conformación está aparentemente facilitada por la flexibilidad conferida por cuatro secuencias putativas de enlace localizadas entre los dominios T1 y T2, T2 y T3, T4 y T5, y T8 y CUB1.86 La autoinhibición se alivia cuando los dominios C-terminales están truncados o unidos por anticuerpos o VWF multimérico, lo que permite el compromiso de los dominios MDTCS con el sustrato.
Basado en análisis de mutaciones, estudios de unión, análisis cinéticos y el uso de sustratos de péptidos sintéticos, se han identificado múltiples sitios de interacción entre el dominio ADAMTS13 conformacionalmente activo y el dominio VWF A2 desplegado y se han resumido en un modelo de cremallera molecular,87 como se representa esquemáticamente en la Fig. 24.3. Con la exposición del VWF multimérico a un nivel crítico de tensión de cizallamiento, se expone primero un exosito en el dominio A2. Este exosito abarca la región helicoidal Glu1660-Arg1668 que está 65 aminoácidos C-terminal al sitio de corte y se une al dominio espaciador de ADAMTS13 con alta afinidad (KD ~ 10 nM).88-90 El esfuerzo de cizallamiento también expone un segundo exosito de baja afinidad en el dominio A2 en o cerca de Asp1614 (sitio P9′), que interactúa con Arg349 en el dominio de desintegración de ADAMTS13.91 La interacción de estos dos exositos con regiones complementarias en ADAMTS13 posiciona el sitio de corte Tyr1605-Met1606 en VWF con el centro activo en el dominio de metaloproteasa de ADAMTS13. Esto implica la interacción de Leu1603 (sitio P3) en el VWF con Leu198, Leu232 y L272 complementarios (sitio S3) en el ADAMTS13, Tyr1605 (sitio P1) en el VWF con Leu151 y Val195 (sitio S1) en el ADAMTS13, y Met1606 (sitio P1′) en el VWF con Asp252-Pro256 (sitio S1′) en el ADAMTS13.92 La visualización de fagos y el análisis de mutaciones aleatorias confirman y muestran que los aminoácidos de la región P3-P2′ y P11′ (Ile1616) también son importantes para la escisión.93 Por lo tanto, la interacción secuencial de estas regiones complementarias en las dos proteínas multidominio facilita la escisión específica de la unión de la tijera.
Desde hace tiempo se sospecha que la incapacidad de degradar los multímeros de ULVWF es la causa de los tipos idiopáticos familiares y adquiridos de PTT, o que predispone a un individuo a estos trastornos (Fig. 24.4).11,94 En 1997 y 1998 se realizaron experimentos críticos para verificar este concepto. Se demostró que cuatro pacientes con PTT crónica recidivante tenían una actividad plasmática deficiente de ADAMTS13.12 Dado que no se detectó ningún inhibidor de la enzima, esta deficiencia se atribuyó a una anormalidad en la producción, supervivencia o función de la proteasa. Durante el año siguiente, se dilucidó la patogénesis del tipo más común de PTT idiopática adquirida.13-15 Los pacientes con PTT idiopática adquirida tenían poca o ninguna actividad plasmática de ADAMTS13 durante los episodios agudos, pero esta actividad aumentaba hacia lo normal en la recuperación. Aunque los ensayos plasmáticos de estos estudios no eran fisiológicos, fueron innovadores e informativos. Los autoanticuerpos de inmunoglobulina (Ig) G contra la enzima probablemente explican la falta de actividad de la proteasa en la mayoría de los pacientes con PTT idiopática adquirida.13-15 Todavía se desconocen las razones de esta desregulación inmunitaria transitoria, así como de la focalización antigénica selectiva de la proteasa destructora del FVW.
Los pacientes con PTT familiar crónica recidivante tienen frecuentemente multímeros del FVWL en su plasma.11,94 Los multímeros de ULVWF se detectan utilizando un método sensible de electroforesis en gel de agarosa en algunas muestras de plasma de pacientes durante episodios agudos de PTT idiopática adquirida, pero no después de la recuperación.94 Estos hallazgos fueron explicados por los investigadores que descubrieron una ausencia crónica de ADAMTS13 en el plasma en la PTT familiar crónica recidivante, así como una inhibición transitoria de la enzima durante los episodios agudos de la PTT idiopática adquirida.12-15
La mayoría de los pacientes con PTT familiar tienen menos del 5% de la actividad normal de ADAMTS13 en su plasma, independientemente de si el plasma se obtiene durante o después de los episodios agudos (siempre que no hayan recibido recientemente infusiones de plasma). La mayoría de los pacientes con PTT idiopática adquirida tienen menos del 5% de la actividad normal de ADAMTS13 en su plasma sólo durante los episodios agudos de PTT.12-La deficiencia grave de la actividad de ADAMTS13 en el plasma de los pacientes con PTT se correlaciona con la incapacidad de escindir los multímeros de ULVWF cuando emergen de las superficies de las células endoteliales (véase la fig. 24.4).59 Como consecuencia, los multímeros de ULVWF secretados por las células endoteliales permanecen anclados a estas células y se autoasocian en cadenas largas59 y son capaces de capturar las plaquetas que pasan uniéndose a la GPIbα plaquetaria (fig. 24.5). 24.5).68 (Las plaquetas no se unen espontáneamente a las formas más pequeñas de VWF que circulan tras la escisión de los multímeros de ULVWF.)56 Posteriormente, otras plaquetas se unen al agregado de plaquetas en crecimiento (reclutadas al agregado a través de la αIIbβ3 activada), que puede crecer hasta el punto de ocluir el vaso (véase la fig. 24.4).59,96 Aunque la mayoría de los casos de PTT idiopática presentan una deficiencia severa de ADAMTS13, un subgrupo no presenta una deficiencia severa de la actividad enzimática medida por los ensayos disponibles actualmente.97 Todavía no está claro si esto se debe a la interferencia con la actividad enzimática de los anticuerpos no detectados por los ensayos disponibles, a la resistencia del FVW a la escisión (por ejemplo, debido a la modificación oxidativa),53 o a otras causas. No obstante, es probable que muchos pacientes de esta categoría sigan beneficiándose de la terapia de recambio plasmático.98 También hay que destacar que la deficiencia de ADAMTS13 no es sensible ni específica (la actividad de ADAMTS13 está disminuida en muchos otros trastornos)99 para hacer el diagnóstico de PTT adquirida.
Los cordones de FVL son capaces de desprenderse de las células endoteliales en ausencia de actividad de ADAMTS13, cortándose mecánicamente con la tensión creciente generada por el esfuerzo de cizallamiento del fluido a medida que las plaquetas se adhieren y agregan.59 Las cadenas de ULVWF y plaquetas desprendidas pueden ocluir los microvasos aguas abajo, contribuyendo a la isquemia de los órganos.
La actividad de ADAMTS13 en el plasma está casi siempre ausente o gravemente reducida en los pacientes con PTT familiar,12,100,101 como consecuencia de mutaciones homocigóticas o heterocigóticas compuestas del gen ADAMTS13.18,24,95,102,103 Las mutaciones en la PTT familiar se han detectado en todo el gen en regiones que codifican diferentes dominios (véase la Fig. 24.2). Con una deficiencia congénita grave de la actividad de ADAMTS13, los episodios de PTT suelen comenzar durante la infancia o la niñez. En algunos pacientes, sin embargo, los episodios manifiestos de TTP no se desarrollan durante años (por ejemplo, durante el primer embarazo),102 si es que alguna vez lo hacen. Esta última observación sugiere que en algunos pacientes permanece una actividad residual de ADAMTS13, y que los episodios agudos de PTT se desencadenan cuando la liberación de ULVWF de las células endoteliales supera la capacidad limitada de su ADAMTS13 para procesarlos. Un caso en el que esto puede ocurrir con regularidad es durante el embarazo: Se sabe que los niveles de VWF aumentan durante la gestación.104-106 En consonancia con esta noción, las mujeres con PTT congénita suelen ser diagnosticadas durante sus primeros embarazos.29 En los bebés con inicio neonatal de PTT congénita y menos del 5% de actividad de ADAMTS13, la insuficiencia renal transitoria o progresiva suele ser un componente destacado del trastorno.107 Estos pacientes se asemejan clínicamente a dos pacientes descritos en 1960 por Schulman y colegas108 y en 1978 por Upshaw109; en consecuencia, este subgrupo pediátrico se denomina a veces «síndrome de Upshaw-Schulman».
En muchos pacientes con PTT adquirida, la actividad plasmática de ADAMTS13 está ausente o muy reducida durante los episodios agudos, y aumenta a medida que se recuperan, ya sea de episodios únicos o recurrentes.13-15 Los autoanticuerpos IgG que inhiben la actividad plasmática de ADAMTS13 pueden detectarse en el 44% al 94% de estos pacientes.13-15,102,110,111 Estos resultados sugieren la presencia de un defecto transitorio o intermitentemente recurrente en la regulación inmunitaria en muchos pacientes que tienen PTT idiopática adquirida asociada a la deficiencia de ADAMTS13. También se han identificado anticuerpos que inhiben la ADAMTS13 plasmática en unos pocos pacientes con PTT asociada a ticlopidina o clopidogrel.34,112 Todavía no se sabe si se produce un defecto grave transitorio en la producción o la supervivencia de la ADAMTS13 en pacientes con PTT adquirida que no tienen autoanticuerpos detectables contra la enzima. Alternativamente, el hecho de no detectar autoanticuerpos inhibidores en algunos pacientes puede reflejar la limitada sensibilidad de los sistemas de prueba actualmente en uso. Los autoanticuerpos no inhibidores que podrían unirse y mediar potencialmente en la eliminación inmunitaria de ADAMTS13 no son detectados por el sistema de prueba actual.
Un estudio evaluó los epítopos de ADAMTS13 reconocidos por los autoanticuerpos policlonales en 25 pacientes con PTT adquirida,113 encontrando que las dianas de los anticuerpos incluían invariablemente la secuencia del dominio rico en cisteína/espaciador (CS); en 3 pacientes ésta era la única región a la que se dirigían los anticuerpos. Los otros 22 autoanticuerpos reaccionaron con la secuencia del dominio CS más los dominios CUB (64%), la secuencia del dominio similar a la metaloproteasa/desintegración/primer dominio similar a la trombospondina-1 (MDT) (56%), o la región que contiene las repeticiones similares a la trombospondina-1 de la segunda a la octava (T2-8, 28%) (véase la Fig. 24.2). La región del propéptido también fue identificada por el 20% de los autoanticuerpos,113 lo que indica que la eliminación del propéptido no es necesaria para la secreción de la enzima activa.114 Los autoanticuerpos inhiben la actividad de ADAMTS13 o disminuyen su supervivencia. En otro estudio de siete pacientes, Luken et al.115 identificaron autoanticuerpos de ADAMTS13 en seis pacientes que se unían exclusivamente al dominio espaciador (S); en el séptimo paciente, los anticuerpos se unían tanto al dominio S como a las repeticiones T2-8. Mediante mutagénesis, estos investigadores determinaron que las regiones Thr572-Asn579 y Val657-Gly666 en el dominio espaciador de ADAMTS13 eran los epítopos comunes para la unión de autoanticuerpos.116 Cuando se sustituyó Arg660, Tyr661 o Tyr665 por alanina, se eliminó la unión de los autoanticuerpos de los seis pacientes con PTT.117
Los autoanticuerpos contra ADAMTS13 en pacientes con PTT adquirida pertenecen predominantemente a la clase IgG,118 aunque también se han detectado anticuerpos de clase IgM e IgA.119 La clonación y secuenciación de los anticuerpos monoclonales de pacientes con PTT adquirida muestran que existe una incorporación preferente del segmento génico de la cadena pesada VH1-69 en la región variable de las inmunoglobulinas.120,121 Esta preferencia sugiere que la región CDR2 o CDR3 de VH1-69 puede contribuir a la especificidad para un epítopo en el dominio espaciador de ADAMTS13. En un análisis de la distribución de los subtipos de anticuerpos en 58 pacientes con PTT aguda adquirida, se detectaron anticuerpos pertenecientes a todos los subtipos de IgG.118 La IgG4 fue el subtipo más prevalente, estando presente en el 90% de los pacientes, ya sea sola o en combinación con otros subtipos de IgG.
La producción de autoanticuerpos contra la ADAMTS13 está casi ciertamente influenciada genéticamente. Este hecho se enfatiza por el descubrimiento en hermanas gemelas de una PTT adquirida causada por autoanticuerpos ADAMTS13.122 Las recaídas ocurren en el 23% al 44% de los pacientes con PTT adquirida,102,110,123,124 a menudo durante el primer año después del episodio inicial.102 La recaída es más común entre los pacientes con los niveles más bajos de actividad de ADAMTS13 (<10%).
El embarazo y el período posparto presentan un desafío especial con respecto a la PTT. En primer lugar, la preeclampsia y el síndrome HELLP (hemólisis, enzimas hepáticas elevadas, plaquetas bajas) tienen muchas características clínicas que se solapan con la PTT y pueden compartir ciertas características fisiopatológicas como la disfunción endotelial sistémica y la proteinuria (véase el capítulo 32).125 El síndrome HELLP puede ser especialmente difícil de distinguir de la PTT porque también manifiesta anemia hemolítica microangiopática, niveles elevados de LDH y trombocitopenia (aunque no suele ser tan grave como en la PTT).126 La PTT en el embarazo puede estar asociada a autoanticuerpos contra ADAMTS13, y la enfermedad suele manifestarse cerca del término o en el posparto.127 Las estimaciones del riesgo de recurrencia durante los siguientes embarazos varían ampliamente, oscilando entre el 26% y el 73% por embarazo.102
La actividad de ADAMTS13 en el plasma de adultos sanos oscila entre aproximadamente el 50% y el 178% del plasma normal utilizando los ensayos estáticos actualmente disponibles. También se ha encontrado una actividad reducida de ADAMTS13 en enfermedades hepáticas, neoplasias malignas diseminadas,128 síndromes inflamatorios sistémicos como los causados por la endotoxina,129 pancreatitis aguda,130 sepsis grave y shock séptico,131 CID inducida por sepsis,132 y disfunción orgánica inducida por sepsis.133-135 Además, se pueden encontrar niveles bajos de ADAMTS13 en el embarazo y en los recién nacidos.136 Con la excepción de las mujeres periparto que desarrollan una PTT manifiesta,102,110 la actividad de ADAMTS13 observada en pacientes con estas condiciones no se reduce a los valores extremadamente bajos (<5% de lo normal) encontrados en la mayoría de los pacientes con PTT familiar o adquirida.
Ensayos de ADAMTS13
Los ensayos de ADAMTS13 determinan la actividad proteolítica, el nivel de antígeno y el nivel de autoanticuerpos anti-ADAMTS13. Los primeros ensayos de actividad de ADAMTS13 se basaban en la degradación de multímeros de FVW purificados en presencia de agentes desnaturalizantes y en la cuantificación de los productos de escisión mediante inmunotransferencia,74,75 la unión del colágeno residual,137 o la reducción de la agregación plaquetaria inducida por la ristocetina.138 Aunque estos ensayos son sensibles, su realización es engorrosa y requiere mucho tiempo e implica el uso de desnaturalizantes. Estos ensayos fueron suplantados después de que los estudios de los fragmentos recombinantes del VWF revelaran las secuencias mínimas necesarias para las mediciones de actividad. Kokame y sus colaboradores realizaron deleciones parciales del dominio A2 del FVW e identificaron un péptido mínimo de 73 aminoácidos (VWF73, Asp1596-Arg1668) que fue escindido eficazmente por ADAMTS13 en ausencia de desnaturalizantes en condiciones estáticas.88 Posteriormente, se han desarrollado varios ensayos basados en la escisión de péptidos que engloban al VWF73, como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET),97 un VWF78 ligado a HRP,139 ELISA,140 inmunoblotting,141 y espectrometría de masas142.
En 2008, se llevó a cabo un segundo estudio colaborativo internacional para comparar el rendimiento de ocho ensayos funcionales y tres ensayos de antígenos para ADAMTS13.143 La comparación de estos métodos mostró que los ensayos de escisión basados en péptidos de VWF modificados como sustratos ofrecían una alta precisión y reproducibilidad y una baja varianza y variabilidad entre métodos. Desde entonces, el ensayo FRET-VWF73 se ha utilizado ampliamente para cuantificar la actividad de ADAMTS13 en muestras de pacientes. Aunque es fácil de realizar, el ensayo basado en FRET tiene varias limitaciones. En primer lugar, la escisión de FRET-VWF73 utilizando plasma citratado como fuente de ADAMTS13 debe realizarse por debajo de 33°C, ya que a 37°C se produce una inactivación irreversible significativa de ADAMTS13 por quelación de calcio mediada por citrato. En segundo lugar, la detección óptima de la señal de fluorescencia requiere la realización de la escisión del sustrato FRET-VWF73 a pH 6,1, lo que reduce la tasa de escisión. En tercer lugar, a este pH subóptimo, algunos autoanticuerpos inhibidores no forman complejos estables con ADAMTS13, y estos anticuerpos no se detectan en los estudios de inhibición. En cuarto lugar, se produce una interferencia significativa de la señal de fluorescencia por la hemoglobina y la bilirrubina debido al solapamiento espectral. Se ha desarrollado un sustrato peptídico mejorado basado en FRET, FRETS-rVWF71. La actividad de ADAMTS13 en el suero y en el plasma citratado o heparinizado puede medirse con este sustrato mejorado a pH fisiológico, fuerza iónica y concentración de calcio, sin interferencia de los multímeros endógenos del VWF, ni de la bilirrubina o la hemoglobina en el plasma.78 Otra limitación de estos ensayos de actividad basados en péptidos es que no se evalúa la capacidad de ADAMTS13 para escindir el VWF multimérico bajo tensión de cizallamiento. Aunque se ha demostrado que la tensión de cizallamiento producida por el vortexing constante promueve la escisión de los multímeros del VWF,144 la cuantificación de los productos de escisión mediante inmunoblotting sigue requiriendo mucho tiempo. Existen al menos cuatro kits comerciales para la medición de la actividad de ADAMTS13 basados en los métodos descritos. Sin embargo, estos kits no han sido evaluados en estudios de comparación directa y estandarización.
Los niveles de antígeno de ADAMTS13 se han cuantificado mediante anticuerpos monoclonales y policlonales.145,146 La influencia de la truncación, las mutaciones y los autoanticuerpos en la precisión y sensibilidad de estas pruebas no está clara. Existen cinco kits de pruebas comerciales para medir los niveles de antígeno de ADAMTS13, pero no se ha realizado ninguna validación ni comparación con otros ensayos.
En 2015, se estableció el primer estándar internacional para ADAMTS13 y se probó en 32 laboratorios de 14 países para la actividad de ADAMTS13 y los niveles de antígeno frente a los estándares locales.147 Este estándar de plasma, designado WHO IS (12/252), se derivó del plasma agrupado de 38 donantes sanos normales. Este estudio mostró un valor medio consensuado de 0,91 unidades/mL de actividad ADAMTS13 para este plasma con una variabilidad interlaboratorio del 12,4%, y 0,92 unidades/mL de antígeno ADAMTS13 con una variabilidad interlaboratorio del 16,3%. La gran variabilidad entre laboratorios no se debió principalmente al uso de diferentes estándares locales, sino a las diferencias metodológicas entre laboratorios.
Los ensayos de autoanticuerpos anti-ADAMTS13 se realizan normalmente mezclando plasma de paciente inactivado por calor con una cantidad conocida de plasma normal agrupado y midiendo la actividad ADAMTS13 residual. Los anticuerpos no neutralizantes se detectan mediante inmunotransferencia.148
Aunque hasta ahora no se ha identificado ningún inhibidor específico de ADAMTS13 que no sea un anticuerpo, varias proteínas y péptidos pueden inhibir la escisión de ADAMTS13 del VWF en condiciones especiales. Entre ellos se encuentran la hemoglobina, la IL-6, la trombospondina-1 y las α-defensinas de los neutrófilos. En todos los casos, los agentes inhibidores aparentemente se unen al sustrato, el VWF, impidiendo que el VWF sea escindido por ADAMTS13. Se ha demostrado que la hemoglobina actúa de esta manera, uniendo cadenas de VWF en la superficie endotelial bajo flujo y bloqueando competitivamente la escisión por ADAMTS13.149 Este mecanismo puede contribuir a las complicaciones vaso-oclusivas en pacientes con anemia falciforme con hemólisis significativa y complicar aún más la PTT cuando las tasas hemolíticas son altas. Concentraciones elevadas de IL-6 (50 y 100 ng/mL) también inhiben la escisión mediada por ADAMTS13 de las cadenas endoteliales de ULVWF bajo flujo in vitro,50 lo que sugiere que este mecanismo puede contribuir a la trombosis durante la tormenta de citoquinas150 o el síndrome de liberación de citoquinas.151 La trombospondina-1, una proteína abundante en los gránulos α de las plaquetas que se libera a la circulación tras la activación plaquetaria, se une a las regiones A2-A3 del FVW, bloqueando e inhibiendo de forma competitiva la escisión por ADAMTS13 in vitro.152 Esta propiedad protrombótica de la trombospondina-1 es coherente con el reclutamiento defectuoso de las plaquetas hacia el endotelio activado o lesionado y la mayor embolización de los trombos plaquetarios observada en los ratones knockout de trombospondina-1.153 Los péptidos de neutrófilos humanos conocidos como α-defensinas, liberados por los neutrófilos activados, pueden unirse al dominio A2 del VWF y bloquear de forma competitiva la escisión mediada por ADAMTS13.154 Las concentraciones de α-defensinas aumentan hasta siete veces en el plasma de los pacientes con PTT adquirida.