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Resumen

Antecedentes: Evaluar la incidencia, las consecuencias y la estrategia de prevención de las aloinmunizaciones anti-D de las portadoras de la variante D en la población obstétrica del condado de Split-Dalmacia, Croacia. Métodos: Los eventos de inmunización RhD fueron evaluados retrospectivamente para el período entre 1993 y 2012. Las mujeres fueron sometidas a pruebas de antígeno RhD y anticuerpos irregulares. Aquellas con anticuerpos anti-D que no eran serológicamente D- fueron genotipadas para RHD. Se evaluaron sus antecedentes obstétricos y de transfusiones y su título de anti-D. A los neonatos se les evaluó el estado del RhD, la prueba de antiglobulina directa (DAT), los niveles de hemoglobina y bilirrubina, el tratamiento transfusional, así como la fototerapia y el resultado. Resultados: De 104.884 nacidos vivos, 102.982 mujeres fueron sometidas a la prueba del antígeno RhD. La inmunización anti-D se produjo en 184 mujeres, lo que representa el 0,9% de los individuos con riesgo de formación de anti-D. 181 casos se produjeron en mujeres tipificadas serológicamente como D-. Tres mujeres eran portadoras parciales de D (DVa n = 2, DNB n = 1), tipificadas inicialmente como RhD+, y reconocidas como portadoras de la variante D después de producirse la inmunización. Los títulos anti-D variaron de 1:1 a 1:16. Seis niños eran RhD+, cuatro tenían DAT positivo y dos fueron sometidos a fototerapia. Conclusión: La inmunización anti-D se produjo en embarazadas portadoras de D parcial (DVa, DNB). Los niños RhD+ tenían marcadores serológicos de enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (HDFN), sin casos de HDFN grave.

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

Introducción

El antígeno RhD es un antígeno altamente inmunogénico importante para la medicina obstétrica debido a la capacidad del anti-D de causar enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (HDFN) . Además del D+ normal, el antígeno D puede presentarse en más de 200 variantes conocidas actualmente como variantes D . La expresión reducida del antígeno D se denomina tradicionalmente «D débil», mientras que la «D parcial» representa variantes en las que las mutaciones y los reordenamientos genéticos dan lugar a una secuencia proteica alterada que carece de ciertos polipéptidos en la superficie externa de los glóbulos rojos, aunque se ha demostrado que la distinción entre D débil y parcial es fluida y que los tipos de D débil poseen antígenos D de ligera a considerablemente alterados. La mayoría de las variantes de la D débil en los caucásicos incluyen la D débil tipo 1, tipo 2 y tipo 3, que no se sabe que formen aloanti-D . Por el contrario, los portadores de D parcial son propensos a la formación de anti-D. La categoría DVI es la D parcial más relevante desde el punto de vista clínico entre los caucásicos, siendo la variante D más comúnmente reportada como implicada en la inmunización anti-D así como en la HDFN . Se ha documentado la HDFN en bebés de madres con D parcial y anti-D, pero en la mayoría de los casos ha sido leve, con raras excepciones.

El bajo riesgo de inmunización RhD en mujeres con tipos D débiles 1, 2 y 3 es la razón por la que la mayoría de los autores sostienen que las mujeres con tipos D débiles prevalentes no requieren inmunoprofilaxis RhD , y las pacientes con D débil podrían recibir con seguridad unidades de RBC D+ . Por el contrario, las mujeres con D parcial deberían ser clasificadas como D- teniendo en cuenta su tratamiento prenatal y la inmunoprofilaxis RhD . En Europa, los reactivos anti-D se seleccionan para tipificar deliberadamente a las embarazadas portadoras de DVI como D- para garantizar que dichas madres reciban inmunoprofilaxis RhD en su segundo trimestre y/o en el posparto. La distribución de las variantes D varía entre las distintas poblaciones, y su reconocimiento depende de la elección de los reactivos de tipificación D utilizados.

Evaluamos retrospectivamente los casos de aloinmunización RhD y de antígeno RhD en mujeres embarazadas durante un período de 20 años. Para las mujeres que no eran serológicamente D-, analizamos la causa de la inmunización (transfusión o embarazo), su reactividad serológica y el genotipo RHD. Asimismo, se determinó si se habían producido casos de HDFN entre los hijos de madres aloinmunizadas con la variante D del RhD. El objetivo del estudio fue evaluar la incidencia y las consecuencias de las aloinmunizaciones anti-D de las portadoras de la variante D en la población obstétrica del condado de Split-Dalmatia.

Material y métodos

El presente estudio se realizó en el Departamento de Medicina Transfusional del Centro Hospitalario Universitario de Split, en el condado de Split-Dalmatia, Croacia. El condado de Split-Dalmacia tiene aproximadamente 5.000 nacimientos al año. El hospital es una institución regional responsable de la atención general del embarazo, del seguimiento de las mujeres inmunizadas con RBC y de la gestión de los partos. A todas las mujeres embarazadas de esta región se les realizó la tipificación de los antígenos ABO y RhD y la prueba de anticuerpos irregulares en su visita inicial. En cada visita posterior, sólo se realizó el control de la prueba de antiglobulina indirecta (IAT). La inmunoprofilaxis RhD se administra de forma rutinaria a las mujeres RhD- tras el parto de un niño RhD+. Las mujeres de la variante D fueron tratadas como RhD- si se requería una terapia transfusional, pero no recibieron inmunoprofilaxis RhD. Si el genotipo RHD revelaba un antígeno D parcial, la inmunoprofilaxis se administraba después del nacimiento del niño RhD+.

Embarazos con variante D y anti-D

Evaluamos de forma retrospectiva los eventos de inmunización RhD en la población obstétrica durante el periodo del 1 de enero de 1993 al 31 de diciembre de 2012. En el condado de Split-Dalmatia, se registraron 104.884 nacidos vivos entre el 1 de enero de 1993 y el 31 de diciembre de 2012. Durante ese período, 102.982 embarazos fueron sometidos a pruebas de detección de antígenos ABO y RhD y de anticuerpos irregulares en nuestro departamento (una cobertura de cribado del 98%, lo que concuerda con un estudio anterior sobre nuestra población obstétrica) . El número de pruebas de tipificación del RhD y el número de variantes D reconocidas serológicamente se recogieron del protocolo escrito manualmente para las pruebas de las pacientes obstétricas para el período entre 1993 y 2001, y de la base de datos informática para el período entre 2002 y 2012.

Durante este período utilizamos formularios de seguimiento de la inmunización para el seguimiento de los embarazos con aloanticuerpos anti-D, que se rellenaron después de haberse detectado aloanticuerpos clínicamente relevantes. A partir de estos formularios analizamos el número global de mujeres embarazadas con inmunización RhD, con un análisis detallado de las mujeres inmunizadas RhD que no eran serológicamente RhD-. Para estas mujeres analizamos los eventos de inmunización que podrían causar la inmunización RhD, los embarazos anteriores, las transfusiones previas y la administración de inmunoprofilaxis RhD después del parto; además, analizamos el genotipo RHD de las mujeres con variante D. Durante el embarazo, se midió el título de anticuerpos anti-D en intervalos de 2-4 semanas, y los resultados de cada medición se registraron en formularios de seguimiento de la inmunización. Los formularios también contenían datos sobre el estado RhD de los bebés y la prueba de antiglobulina directa (DAT).

Los datos sobre los niños RhD+ de mujeres de la variante D con anticuerpos anti-D se recogieron de la historia de los pacientes en el Departamento de Pediatría y Neonatología. La información recopilada incluía datos sobre la HDFN, los niveles neonatales de hemoglobina y bilirrubina, la terapia transfusional neonatal y la fototerapia, y otros resultados neonatales.

Tipificación serológica del antígeno RhD

En el periodo comprendido entre el 1 de enero de 1993 y el 10 de abril de 2008 se realizó la tipificación rutinaria del RhD mediante aglutinación directa en tubo de ensayo con dos de los siguientes reactivos monoclonales: Anti-D M MonoGnost® (MS-201; BioGnost, Zagreb, Croacia); NovaClone® Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend (CI 175-2, D415, 1E4, Immucor Gamma, Dartmouth, NS, Canadá); Anti-D MG MonoGnost® (RUM-1 IgM, MS-26 IgG, BioGnost).

Si el antígeno RhD fue tipificado negativo en aglutinación directa, fue tipificado en IAT. El antígeno RhD tipificado como negativo en aglutinación directa, pero positivo en IAT, se clasificó como «variante D». La prueba del antígeno RhD en la IAT mediante el método de la columna se realizó con la mezcla monoclonal-poloclonal humana Anti-D BioClone® (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA).

Desde el 10 de abril de 2008 hasta el 31 de diciembre de 2012, la tipificación del RhD en aglutinación directa se realizó mediante la tecnología de microcolumna automatizada utilizando el casete de agrupación ABO-DD (Ortho Clinical Diagnostics) que contiene dos reactivos monoclonales IgM anti-D (clon D7B8, y clon RUM-1). La prueba del antígeno RhD en la IAT se omitió después de haber introducido la tecnología de microcolumnas. Los casos con resultados serológicos discrepantes se enviaron para el análisis molecular del RHD, y se aplicó la inmunoprofilaxis a las mujeres que resultaron ser portadoras parciales de D.

Genotipado del RHD

La extracción del ADN de las muestras de sangre EDTA se realizó manualmente con el QIAamp DNA Blood Mini kit® (Qiaqen, Hilden, Alemania) o con el Qiacube analyser® (Qiaqen). La tipificación molecular de las variantes D se realizó mediante kits PCR-SSP (Ready GeneWeak D® y Ready GeneCDE®; Inno-Train, Kronberg im Taunus, Alemania), según las instrucciones del fabricante.

Resultados

En el período observado, de 102.982 embarazos sometidos a la prueba de los antígenos ABO y RhD y de los anticuerpos irregulares, hubo 184 embarazadas afectadas por la aloinmunización RhD en 20.050 mujeres que presentaban la variante RhD o D. Esto representa el 0,9% de las embarazadas con riesgo de aloinmunización RhD. De ellas, 181 mujeres fueron tipificadas serológicamente como RhD-, y 3 inmunizaciones (1,63% de las inmunizaciones anti-D) se produjeron en mujeres portadoras de variantes RhD. El genotipado RHD definió que 2 de las 3 mujeres eran D parcial tipo Va, mientras que 1 mujer era portadora de D parcial tipo DNB (fig. 1). Las 3 mujeres fueron etiquetadas como RhD+ en su tipificación serológica inicial del antígeno RhD, debido a la elección de los reactivos que se utilizaron en su momento (Anti-D M MonoGnost, NovaClone Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend. Por lo tanto, 2 de las 3 recibieron glóbulos rojos RhD+, y ninguna de ellas recibió inmunoprofilaxis anti-D prenatal o postnatal. Las características de la mujer D parcial con inmunización anti-D se muestran en la tabla 1. Una de ellas (DVa) fue inmunizada exclusivamente debido al embarazo, mientras que para las otras 2 mujeres (DVa y DNB) la inmunización fue muy probablemente la consecuencia de haber sido transfundidas con glóbulos rojos RhD+ (tabla 1).

Durante el periodo de estudio, 484 mujeres fueron tipificadas como variante D (Du) utilizando únicamente métodos de tipificación serológica. Estas mujeres no recibieron inmunoprofilaxis, pero sí unidades de glóbulos rojos D en caso de transfusión (fig. 1). No hubo casos de formación de anti-D entre ellas.

La tabla 2 muestra los datos sobre el título de anti-D de las madres inmunizadas, así como los datos sobre sus hijos afectados, incluyendo el DAT neonatal, la hemoglobina, la bilirrubina, la fototerapia y la terapia transfusional.

La mujer de la variante DNB se encontró inmunizada durante la investigación del DAT positivo del recién nacido. Dado que la mujer era ciudadana de Bosnia y Herzegovina y había llegado a Croacia poco antes del parto, no se disponía de datos de sus pruebas inmunohematológicas anteriores. Sin embargo, utilizando la información de su historial de salud, descubrimos que había recibido glóbulos rojos A+ después del parto anterior. El recién nacido sólo necesitó fototerapia. Su siguiente embarazo dio lugar al nacimiento de un niño cuyo DAT fue fuertemente positivo y el bebé requirió una transfusión de refuerzo en su octavo día de vida. Sin embargo, la transfusión no se atribuyó a la hemólisis, sino a la intervención quirúrgica debida a la hernia encarcelada.

La segunda mujer (D parcial tipo Va) resultó estar aloinmunizada en su repetido cribado rutinario de anticuerpos irregulares en la semana 34 de su segundo embarazo. Su historial de transfusiones era negativo. A pesar de estar embarazada de un niño RhD+, su título anti-D se mantuvo muy bajo durante todo el embarazo. La DAT del recién nacido tras el parto fue negativa, y los niveles de bilirrubina y hemoglobina estaban dentro de los rangos de referencia. Sin embargo, su segundo hijo RhD+ tuvo niveles de bilirrubina patológicamente elevados y requirió fototerapia.

La tercera mujer (parcial D tipo Va) fue encontrada aloinmunizada en la determinación rutinaria del grupo sanguíneo y el cribado en el segundo embarazo, su primer embarazo fue sin incidentes pero seguido de la transfusión de dos unidades de glóbulos rojos A+ RhD+. A pesar de que de sus cuatro embarazos posteriores, dos dieron lugar al nacimiento de niños RhD+ cuya DAT era 1+ positiva y de que ella tenía el título anti-D más alto de las 3 mujeres, no se detectaron niveles patológicamente elevados de bilirrubina, ictericia visible o anemia en ninguno de sus hijos, sus periodos postnatales fueron sin incidencias y fueron dados de alta del hospital sin complicaciones. En total, las mujeres con variantes D parciales e inmunización anti-D tuvieron seis embarazos con niños RhD+. Dos niños necesitaron fototerapia, pero no hubo casos de HDFN grave.

Discusión

Este estudio analiza las inmunizaciones contra el RhD en mujeres embarazadas portadoras de variantes D, en el condado de Split-Dalmacia. Encontramos 184 mujeres embarazadas con anticuerpos anti-D, lo que representa el 0,9% de los individuos con riesgo de formación de anti-D. Esto está en concordancia con un trabajo reciente sobre nuestra población obstétrica con anti-D . Un porcentaje tan elevado se atribuye a que la profilaxis prenatal no está implantada en nuestro país, y ya se ha insistido en la necesidad de que se convierta en una práctica habitual . 181 mujeres aloinmunizadas fueron tipificadas serológicamente como RhD-. Tres aloinmunizados tipificados inicialmente como RhD+ eran portadores parciales de D. No hubo ningún caso de formación de anti-D entre las mujeres embarazadas que fueron reconocidas inicialmente como variante D y a las que se les asignó el estatus «Du».

En las directrices de algunos países para la prevención de la aloinmunización anti-D, se afirma que las mujeres D débiles o Du no requieren profilaxis, mientras que las recomendaciones más recientes destacan la importancia de resolver los resultados poco claros de la tipificación del RhD, y de tratar todas las variantes D que no sean los tipos D débiles 1, 2 y 3 como D- .

Hasta 2008, las pruebas del antígeno RhD en nuestro centro se basaban únicamente en la serología. A las mujeres que resultaban ser RhD- mediante el método del tubo por aglutinación directa pero RhD+ en la aglutinación indirecta se les asignaba la variante D o Du, y no recibían inmunoprofilaxis RhD; sin embargo, se las consideraba como RhD- teniendo en cuenta la terapia transfusional. Con este enfoque, las mujeres embarazadas con antígeno D parcial fueron clasificadas como D variante o Du. y no recibieron inmunoprofilaxis; en consecuencia, no se evitaron los eventos de inmunización debidos al embarazo. En nuestro centro, desde 2008, los casos con resultados poco claros de la tipificación serológica del RhD se sometieron a un análisis molecular del RHD, y se aplicó la inmunoprofilaxis a las mujeres que fueron genotipadas como portadoras parciales del D. Otros estudios también señalan la importancia de la genotipificación del RHD en mujeres embarazadas con antígeno variante D para identificar correctamente a las portadoras parciales de D a las que hay que administrar inmunoprofilaxis .

Las 3 mujeres aloinmunizadas D parciales de nuestra investigación no recibieron inmunoprofilaxis, y 2 de ellas recibieron unidades de glóbulos rojos RhD+, ya que no fueron reconocidas inicialmente como portadoras de variantes D, y fueron tipificadas como RhD+. Sólo 1 evento de inmunización en una mujer con variante D parcial se relacionó totalmente con el embarazo. Para las 2 inmunizaciones RhD restantes no fue posible determinar si la transfusión o el embarazo causaron la inmunización. Esto sugiere que el reconocimiento de las variantes D durante la tipificación serológica es esencial para asegurar que las embarazadas portadoras de D parcial sean tratadas como RhD- considerando la terapia transfusional y la inmunoprofilaxis.

Después de que se descartara la tipificación del RhD en la IAT para las embarazadas en 2008, las que presentaban la variante DVI, si estaban presentes en nuestra población obstétrica, se tipificaron como RhD- mientras que anteriormente se asignaban como variante D o Du, ya que la DVI da reacciones positivas en la aglutinación indirecta con el reactivo anti-D utilizado para la tipificación en la IAT. Sin embargo, no hemos encontrado ningún caso de anti-D en las madres con IVC. A pesar de que la variante DVI se considera la variante D parcial más relevante desde el punto de vista clínico entre los caucásicos, las mujeres afectadas en nuestro estudio pertenecían a las categorías DVa y DNB. Además, la investigación realizada en donantes de sangre de la misma región geográfica no encontró ningún portador de la categoría DVI parcial . Se sabe que la DNB es la variante D parcial más prevalente en las regiones vecinas de Europa Central . En nuestro caso, el único portador de DNB procedía de una región geográfica vecina de Bosnia y Herzegovina, mientras que los dos portadores de DVa procedían de la zona investigada del condado de Split-Dalmacia. Esto implica la necesidad de tener en cuenta la variabilidad geográfica en la prevalencia de las variantes D al aplicar las normas de tipificación e inmunoprofilaxis del RhD.

No se atribuyó a tipos D débiles ningún caso de formación de anti-D en mujeres a las que se les había asignado inicialmente el estatus RhD+ o Du cuando se realizó la genotipificación en los casos aloinmunizados registrados. Esto era de esperar, ya que las variantes D débiles más prevalentes en Croacia son el tipo D débil 3, el tipo 1 y el tipo 2, mientras que en la parte mediterránea de Croacia, en la que se realizó el estudio, el más común es el tipo D débil 1, seguido del tipo 3 y 2 . En contraposición a los hallazgos de los autores en poblaciones no caucásicas, siendo comunes los tipos D débiles propensos a la formación de anti-D, es seguro asumir que los portadores de D débil en nuestra población obstétrica no requieren inmunoprofilaxis . Sin embargo, dado que en un estudio publicado anteriormente sobre la población croata se encontró que el tipo D débil 4.2, que se sabe que produce anti-D, estaba presente en la parte mediterránea de Croacia, la precaución es obligatoria. Además, en un estudio sobre mujeres embarazadas RhD realizado por Hyland et al. se encontraron portadores de la variante D entre las mujeres aloinmunizadas. Algunos glóbulos rojos D parciales no reaccionan con el anti-D ni siquiera con la IAT . En nuestro estudio no se realizó la genotipificación en mujeres aloinmunizadas RhD-; por lo tanto, algunos individuos con variantes D con anti-D podrían haber sido pasados por alto por nuestras técnicas serológicas utilizadas en ese momento.

De forma similar a los hallazgos de la mayoría de los demás autores, las inmunizaciones anti-D de las mujeres con D parcial dieron lugar en su mayoría a marcadores serológicos de HDFN, pero sin consecuencias clínicas graves . Es interesante observar que en nuestro estudio la mujer con el título anti-D más alto de las 3 mujeres dio a luz a niños cuya DAT era sólo 1+, mientras que los hijos de la mujer con un título más bajo estaban más prominentemente afectados serológicamente, con DAT 4+. Los factores que intervienen en la gravedad de la HDFN siguen siendo objeto de investigación. A pesar de que la mayoría de los casos de HDFN en madres con D parcial son leves, también se ha informado de resultados fatales .

Aunque la formación de anti-D en mujeres no RhD- es extremadamente rara, los eventos de inmunización demostrados confirman que es relevante identificar correctamente a las portadoras de D parcial, que requieren ser consideradas como RhD- considerando la terapia transfusional y la inmunoprofilaxis. Una investigación reciente realizada en EE.UU. descubrió que la realización del genotipo RHD entre las mujeres embarazadas con fenotipos D serológicamente débiles es una estrategia de coste neutro, y es probable que el ahorro de costes aumente ligeramente con el tiempo. Además de la importancia indiscutible del genotipado RHD para resolver los resultados discrepantes de la tipificación RhD y discernir las variantes D, es necesario subrayar la relevancia de la tipificación serológica, ya que no se reconocerá la necesidad del genotipado si no se reconocen las variantes D durante la tipificación serológica inicial y se asignan las portadoras de variantes D a RhD+. En nuestro estudio, las 3 embarazadas con anti-D no fueron reconocidas inicialmente como variantes D debido a la fuerte reactividad de sus glóbulos rojos con los reactivos monoclonales utilizados en ese momento. Podemos concluir que la elección de los reactivos para la tipificación serológica del RhD es crucial para el reconocimiento de las variantes D y, en consecuencia, el reconocimiento de la necesidad de la tipificación molecular del RhD.

Por último, en este estudio encontramos que no hubo casos de inmunización RhD en mujeres embarazadas tipificadas inicialmente como variante D, pero las inmunizaciones sí ocurrieron en mujeres que fueron tipificadas como RhD+. Esto implica la necesidad de seguir investigando para hacer una elección adecuada de reactivos para la tipificación serológica del RhD que detecte las variantes D con riesgo de aloinmunización anti-D en nuestra población.

Las limitaciones de este estudio retrospectivo son el largo período de seguimiento, los cambios en los métodos y reactivos que se utilizaron durante el período de estudio, así como el algoritmo de las pruebas. Los cambios incluyen la omisión de la tipificación del RhD en la IAT después de 2008 y la introducción de la inmunoprofilaxis para las mujeres embarazadas con antígeno D parcial después de 2008, mientras que antes de 2008 la profilaxis no se administraba a las mujeres con cualquier variante D. Otra limitación de nuestro estudio es el hecho de que no se realizó la genotipificación en las mujeres aloinmunizadas RhD-.

A pesar de estas limitaciones, creemos que es muy importante realizar un seguimiento de la población obstétrica durante un largo periodo de tiempo. Esto nos permitiría evaluar la idoneidad de la estrategia de tipificación serológica del antígeno RhD y la administración de inmunoprofilaxis en mujeres embarazadas con variantes D.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Pera Erceg-Maglic, Hanija Dadic-Jadric, Branka Skelin, Dejana Bogdanic, Ivica Bradaric, Vedrana Burilovic y Nina Ipavec la recogida de datos durante la investigación.

Requisitos éticos

El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Centro Hospitalario Universitario de Split.

Declaración de divulgación

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

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