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Una breve historia de T. reesei

Las prácticas biotecnológicas más antiguas que implican a los hongos para la producción de cerveza, vino y queso podrían remontarse a varios milenios, es decir, al comienzo mismo de la civilización letrada . En cambio, el descubrimiento del ascomiceto mesófilo filamentoso Trichoderma reesei (entonces Trichoderma viride) por su asombroso potencial para producir celulasas extracelulares tuvo lugar hace poco más de 70 años. En un principio, el potencial destructivo del Trichoderma sp. original, aislado de equipos en descomposición del ejército estadounidense en las Islas Salomón durante la Segunda Guerra Mundial, se consideró bastante problemático. Sin embargo, no pasó mucho tiempo antes de que los investigadores de los Laboratorios de Investigación del Ejército de Natick, dirigidos por Mary Mandels y Elwyn T. Reese, el investigador que da nombre al proyecto, trataran de convertir este potencial problemático en productos intencionados. En un cribado de 14.000 mohos de la colección Quartermaster, Trichoderma sp. QM6a mostró una capacidad excepcional para degradar la celulosa cristalina nativa. La designación «QM6a» para el último aislado original de Trichoderma que quedaba, que lo identificaba como el sexto de los seis cultivos del hongo almacenados en la Quartermaster Collection de Natick, se mantuvo. Esta cepa en particular no sólo se considera la cepa de referencia de T. reesei, sino que también es la cepa de la que se han derivado todos los mutantes utilizados hoy en día en la industria.

Entonces y ahora, la investigación sobre T. reesei fue impulsada por la idea de que sus celulasas secretadas podrían tener un impacto que cambiara el juego en la lucha de 200 años para producir económicamente combustibles a partir de biomasa lignocelulósica renovable. Desde entonces, la investigación sobre T. reesei ha sido pionera en el concepto de sacarificación enzimática de la celulosa mediante una combinación sinérgica de diferentes actividades celulásicas y ha sentado las bases para nuestra actual comprensión de la regulación de las enzimas implicadas. Su principal celobiohidrolasa CBH1 (CEL7a) fue también la primera celulasa eucariótica clonada y la primera celulasa cuya estructura se resolvió. Un paso importante hacia la aplicación industrial de las celulasas de T. reesei fue el desarrollo de procedimientos eficientes de mutagénesis y cribado de cepas en la década de 1970. En las dos décadas siguientes, el título de la proteína extracelular producida por la cepa original QM6a pudo aumentarse hasta 20 veces mediante programas de mutagénesis en Natick y la Universidad de Rutgers. Este último culminó con el aislamiento de la cepa RUT-C30 (donde «RUT» significa Rutgers). Aunque el estándar de oro para la producción de celulasa en la industria se informó de que era superior a 100 g/L, esta cepa sigue siendo el prototipo de hiperproductor de celulasa disponible para el dominio público, con títulos de proteína extracelular que alcanzan los 30 g/L en el sustrato inductor de la celulasa, la lactosa.

Al principio, sin embargo, se desarrollaron otras aplicaciones comerciales para las celulasas, ya que quedó claro que la sacarificación eficiente y completa de la biomasa lignocelulósica a azúcares fermentables requiere muchas más actividades enzimáticas de las previstas inicialmente. Una vez más, la investigación con T. reesei siguió abriendo nuevos caminos en la enzimología de la degradación de la celulosa y la hemicelulosa, y sigue haciéndolo en la actualidad. La microscopía de fuerza atómica de alta velocidad también ha visualizado la degradación de la celulosa, demostrando cómo la principal celobiohidrolasa CBH1/CEL7A se desliza unidireccionalmente a lo largo de la superficie de la celulosa. A principios de la década de 1990, ya se disponía de técnicas de transformación que facilitaban la ingeniería genética de T. reesei. Durante la siguiente década, estas tecnologías fueron fundamentales para obtener nuevos conocimientos sobre la regulación de sus enzimas y para alterar el perfil enzimático secretado por el hongo. Por aquel entonces, T. reesei fue también uno de los primeros hospedadores para la expresión de proteínas de mamíferos, como lo demuestra la expresión de quimosina de ternera bajo las señales de expresión de cbh1 (cel7a).

A finales de la década de 1990, Kuhls et al. descubrieron que Hypocrea jecorina es, de hecho, la forma sexual de T. reesei, razón por la cual varias publicaciones posteriores utilizaron H. jecorina como nombre de la especie en lugar de T. reesei. Un estudio más detallado sobre el desarrollo sexual condujo a la hipótesis de que la cepa QM6a es, de hecho, estéril femenina, lo que pudo vincularse posteriormente a una mutación en el gen ham5 que codifica el andamiaje de la MAP-cinasa.

El cambio de milenio, que para la genética puede considerarse como un giro desde el estudio de genes y vías aisladas hacia el estudio de genomas completos, supuso la llegada de T. reesei a la llamada Era Genómica. La primera aproximación global al estudio de la expresión génica de T. reesei fue, en 2003, un estudio transcriptómico realizado por Foreman et al. , que construyó microarrays de ADN basados en ADNc que correspondían a más de 5000 transcritos diferentes del genoma de T. reesei. Cinco años más tarde, la secuenciación del genoma y el análisis del aislado original de T. reesei QM6a sentaron las bases para la aplicación a gran escala de los estudios del genoma. En los años siguientes, el análisis genómico comparativo de una serie de cepas hiperproductoras y no productoras de celulasa condujo al descubrimiento de nuevos factores potenciales implicados en la hiperproducción de celulasa, como el transporte nucleocitoplásmico, el tráfico de proteínas vacuolares y el recambio de ARNm. Estos análisis comparativos se beneficiaron del hecho de que todas las cepas de T. reesei utilizadas en el mundo académico y en la industria se derivan de la cepa QM6a. Sesenta y cinco años después de los estudios iniciales de Elwyn Reese sobre la degradación de la celulosa por T. reesei , la capacidad mundial instalada de producción de biocombustibles celulósicos es ahora de 480,5 millones de litros por año (MMLY) de etanol, de los cuales 380,5 MMLY (o aproximadamente el 80%) se producen utilizando formulaciones enzimáticas de T. reesei como Accellerase y Cellic (Fig. 1a). Sin duda, este esfuerzo requirió la maduración de la tecnología subyacente a varios niveles, incluyendo la ingeniería del proceso y el pretratamiento del sustrato. Sin embargo, la producción y optimización de formulaciones enzimáticas para la etapa de sacarificación de la biomasa ha sido y sigue siendo uno de los factores clave que determinan el coste de los procesos de etanol celulósico. Además, la producción de enzimas con T. reesei no se limita en absoluto a la producción de enzimas de biorrefinería. De hecho, aproximadamente el 11% de todas las formulaciones de enzimas técnicas registradas por la Asociación de Fabricantes y Formuladores de Productos Enzimáticos se producen utilizando T. reesei como huésped de expresión (Fig. 1b, c). Por último, pero no menos importante, T. reesei sigue manteniendo su importancia en la investigación, ejemplificada por más de 100 artículos de investigación que tratan sobre el hongo o sus enzimas publicados cada año (Fig. 1d).

La mezcla de enzimas de la biomasa de T. reesei: nuevos conocimientos y limitaciones

En la naturaleza, la deconstrucción de la lignocelulosa rara vez la realiza un solo organismo. Más bien se consigue mediante el orden secuencial y el esfuerzo colectivo de varios organismos que producen múltiples enzimas activas en los carbohidratos (CAZymes) para degradar los diferentes polímeros. Por lo tanto, no es de extrañar que la mezcla de celulasa secretada de T. reesei tuviera que adaptarse significativamente para ofrecer una formulación enzimática competitiva en costes para la sacarificación completa de la lignocelulosa. Al principio, los investigadores se dieron cuenta de que las formulaciones de T. reesei carecían de suficiente actividad β-glucosidasa porque la mayor parte de la actividad está unida a la pared celular del hongo. En consecuencia, el aumento de la actividad β-glucosidasa mejoró la degradación de la celulosa porque contrarresta la inhibición del producto a través de la celobiosa, que, a su vez, es liberada por la acción cooperativa de las endoglucanasas y las celobiohidrolasas . De lo contrario, este mecanismo de retroalimentación ralentiza seriamente la sacarificación de la celulosa. Del mismo modo, los xilo- y mannooligosacáridos derivados de la hemicelulosa inhiben las celobiohidrolasas de T. reesei, lo que indica claramente que se requieren suficientes actividades de β-xilosidasa y β-manosidasa para degradar eficazmente la lignocelulosa. En 2003, Foreman et al. describieron dos proteínas que son inducidas conjuntamente con las principales celulasas y las denominaron proteína inducida por la celulosa 1 y 2 (CIP1 y CIP2). Desde entonces, se ha demostrado que son importantes para degradar eficazmente la lignocelulosa. Resultados recientes muestran que la CIP1 tiene similitudes estructurales con las liasas, aunque no se ha podido demostrar su actividad liasa, y que la CIP2 es una glucuronoilesterasa de la familia CE15. Otra importante proteína secretada es la swollenina SWO1, que contiene un módulo de unión a carbohidratos (CBM) unido a un dominio similar a la expansina . A pesar de la actividad disruptiva de la celulosa, SWO1 potencia sinérgicamente la actividad de la endoxilanasa más que la de la endoglucanasa o la celobiohidrolasa durante la hidrólisis enzimática del rastrojo de maíz pretratado. Un modo de acción propuesto es que hace que la porción de xilano de la lignocelulosa sea más accesible para la degradación por las xilanasas y, por tanto, promueve indirectamente la acción de las celulasas. Posiblemente, la mayor revolución de los últimos años en la degradación de la celulosa fue el descubrimiento de las monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMO). Estas enzimas introdujeron un nuevo mecanismo oxidativo en la degradación de los polisacáridos. En la degradación de la celulosa se supone que las LPMO actúan sobre la superficie de las fibrillas de celulosa cristalina, haciéndolas así más accesibles a las celulasas. Curiosamente, estas enzimas pueden obtener los electrones necesarios para este proceso de la lignina de la pared celular de la planta a través de la transferencia de electrones de largo alcance, convirtiendo así los mecanismos de defensa de la planta en contra. Alternativamente, las oxidorreductasas GMC o las deshidrogenasas de celobiosa pueden funcionar como donantes de electrones . Este hallazgo podría explicar cómo T. reesei alimenta sus LPMOs, ya que se demostró previamente que varias oxidorreductasas GMC son inducidas por la paja de trigo. Sin embargo, este mecanismo oxidativo no se limita a la despolimerización de la celulosa. Demostrados originalmente para la quitina, los LPMOs también juegan un papel en la degradación del xiloglucano y la amilosa. En la base de datos CAZy, las enzimas pertenecientes a este grupo han sido reclasificadas como «actividades auxiliares» (AA) en contraposición a su anterior clasificación como hidrolasas de glucósidos (por ejemplo, GH61) y se encuentran en las familias AA 9-11 y 13 . Como se ha señalado anteriormente, las actividades hemicelulolíticas son importantes para la sacarificación completa de la lignocelulosa (revisado por Harris et al. ). Se requieren diferentes cantidades de actividades individuales dependiendo de los tipos de hemicelulosa presentes en el sustrato . Por lo tanto, cabe destacar que el repertorio enzimático de T. reesei tiene algunas limitaciones claras para ciertos tipos de enlaces específicos de hemicelulosa. Una de estas actividades ausentes es la α-xilosidasa. La adición de α-xilosidasa a una formulación enzimática comercial de T. reesei mejoró la liberación de xilosa y glucosa del rastrojo de maíz pretratado. Del mismo modo, la adición de una celulasa de la familia GH 5 con actividad contra el glucomanano y el xilano mejoró significativamente una preparación enzimática sintética de T. reesei . Otras actividades ausentes o muy limitadas en la mezcla de celulasa de T. reesei son la endo-arabinasa y varias actividades de pectinasa . La suplementación de las mezclas de celulasa comerciales con estas actividades enzimáticas mejoró en consecuencia la sacarificación de diferentes sustratos . Otra cuestión que aún no se ha resuelto es la función in vivo de las oxidasas multicopas secretadas codificadas en el genoma de T. reesei.

Mejorando T. reesei como anfitrión de producción de proteínas

Dado el hecho de que las celulasas y la mayoría de las otras enzimas degradadoras de lignocelulosa se expresan de forma coordinada y condicionada, su regulación transcripcional representa un objetivo lógico de ingeniería para mejorar la producción de celulasa por el hongo. Uno de los reguladores principales es el factor de transcripción CRE1, mediador de la represión de los catabolitos de carbono del tipo C2H2. CRE1 cierra la transcripción de sus genes objetivo cuando hay fuentes de carbono más favorables, como la glucosa. Su truncamiento es una de las principales causas de la mejora de la producción de celulasa conseguida mediante programas de mutagénesis aleatoria de T. reesei QM6a que conducen a la cepa RUT-C30, que muestra tanto un mayor nivel basal como un nivel inducido de producción de celulasa . Del mismo modo, la sustitución de los motivos de unión a CRE1 en la región promotora de la principal celobiohidrolasa cel7a por los de un conocido activador de la celulasa reduce la represión de los catabolitos del carbono y eleva la transcripción de cel7a en condiciones de activación y represión . Además, la transcripción de la celulasa, la xilanasa y una serie de otros genes que codifican enzimas implicadas en la degradación de la lignocelulosa depende estrictamente del activador transcripcional de tipo Zn(II)2Cys6 XYR1 . Esto contrasta con otros hongos, como los sordariomicetos Neurospora crassa y Fusarium fujikuroi, donde el ortólogo de XYR1 modula exclusivamente la expresión del gen de la xilanasa. Se descubrió que una mutación que da lugar a una forma truncada de XYR1 causa el fenotipo negativo de la celulasa de la cepa QM9136, que procede del programa de mutagénesis de Natick. En consecuencia, los mutantes que producen celulasa en exceso o en exceso tienen niveles elevados de ARNm para los activadores transcripcionales xyr1 . También se ha comprobado que la sobreexpresión de XYR1 conduce a una mayor expresión de celulasas y suprime su represión catabólica en presencia de glucosa . Además, una mutación puntual dentro de una supuesta región reguladora de XYR1 conduce a un patrón de expresión igualmente desregulado . Además de XYR1 y CRE1, tres factores de transcripción ACE1, ACE2 y ACE3 regulan la expresión de la celulasa y la xilanasa en T. reesei. Al igual que CRE1, ACE1 es un represor de dedos de zinc C2H2 y su supresión mejora la producción de celulasas y xilanasas. ACE2 y ACE3, al igual que XYR1, son activadores de la transcripción del tipo Zn(II)2Cys6 . Cuando ace2 está ausente, la transcripción de celulasas y xilanasas se reduce en consecuencia, aunque la inducción de la celulasa por la soforosa aparentemente no se ve afectada. La supresión de ace3 suprime completamente la transcripción de las celulasas, pero sólo reduce la de las xilanasas. Aunque todavía no se ha intentado la sobreexpresión de ACE2, la sobreexpresión de ACE3 conduce a un aumento de las actividades de ambos tipos de enzimas, al igual que la sobreexpresión de otros seis reguladores no caracterizados hasta ahora. Entre ellos se encuentran otros dos factores de transcripción del tipo Zn(II)2Cys6, así como dos proteínas WD40, una proteína de bromodominio y una acetiltransferasa relacionada con gcn5. Los tres activadores transcripcionales Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 y ACE3) se parecen a la bien caracterizada proteína Gal4 de S. cerevisiae. Está bien establecido que Gal4 recluta el complejo SAGA que contiene Gcn5 y, por tanto, promueve la transcripción de sus genes diana a través de la acetilación de las histonas y la formación de eucromatina. De hecho, el ortólogo Gcn5 de T. reesei es indispensable para la expresión de la celulasa y participa en la acetilación de las histonas en el promotor cbh1. En los últimos años, ha surgido un panorama que muestra que la transcripción de las celulasas y las CAZimas relacionadas en los hongos está gobernada por una combinación de muchos factores de transcripción que representan una compleja red de regulación transcripcional influenciada por activadores y represores que se contraponen. En Penicillium oxalicum, por ejemplo, veinte factores de transcripción modulan la activación o represión de los genes de la celulasa. Entre ellos se identificó el ClrB como integrador clave de todos los demás reguladores con sus genes objetivo . Los homólogos de estos reguladores se encuentran en T. reesei, pero dada la diversidad de adaptaciones en la regulación de la pared celular de las plantas, se espera que otros y diferentes reguladores también desempeñen papeles importantes. Otro actor clave en la regulación de la celulasa es el ortólogo de T. reesei del enigmático LaeA de Aspergillus, que está implicado en la regulación de grupos de genes de metabolitos secundarios en diferentes hongos. Mientras que la supresión de esta putativa proteína metiltransferasa conduce a una fuerte regulación a la baja de diferentes genes de la celulasa y otros genes de la CAZyme, su sobreexpresión puede promover fuertemente su expresión . Se encontraron efectos similares para la proteína VEL1 del complejo VELVET que interactúa con LAE1.

La mayoría de los estudios mencionados anteriormente proporcionan conocimientos fundamentales sobre la regulación de la formación de la celulasa. Como la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo en el aislado original de T. reesei QM6a o en la cepa moderadamente sobreproductora QM9414, sigue sin estar claro si estos efectos pueden implementarse en las cepas hiperproductoras y en qué medida. En estas cepas, procesos como la traducción, la secreción y el recambio de las enzimas secretadas, más que la transcripción, podrían limitar un mayor aumento de la producción de celulasa. Será interesante ver si varias de las formas reportadas para mejorar la expresión del gen de la celulasa pueden apilarse o no y cómo se comportarían tales cepas cuando se comparan con las hiperproductoras derivadas por mutagénesis aleatoria.

El simple hecho de potenciar la transcripción del gen de interés no siempre conduce a una mejor formación del producto, especialmente en el caso de las proteínas no fúngicas. Una estrategia exitosa para evitar la baja formación de productos es el enfoque de genes de fusión que utiliza, además de la región promotora y terminadora de un gen altamente expresado, la proteína codificada como potenciador de la expresión. En el caso de T. reesei, se trata de la celobiohidrolasa que codifica cel7A, que es la proteína más expresada en condiciones de inducción de celulasa. Se cree que estas fusiones de genes generalmente aumentan la estabilidad del ARNm, la importación al RE y el paso por la vía secretora. Para ello, a menudo se aprovecha la estructura modular de CEL7A que consiste en un módulo catalítico, un enlazador y un CBM, sustituyendo así el CBM C-terminal por el gen de interés. En la actualidad existen variaciones de este enfoque de fusión de genes que dirigen la proteína al RE para su correcto plegamiento, la formación de puentes disulfuro y la glicosilación, pero que posteriormente buscan la acumulación intracelular de la proteína para evitar la degradación del producto deseado por las proteasas extracelulares. Una de estas estrategias utiliza hidrofobinas con una señal de retención del RE unida como portadora. Estas proteínas de fusión se autoensamblan en estructuras tipo micela y pueden purificarse mediante un sistema bifásico acuoso basado en surfactantes. Otra estrategia para dirigir las proteínas al RE utiliza el péptido γ-zeína (ZERA) derivado de la proteína de almacenamiento del maíz. De forma análoga, estas proteínas de fusión autoensambladas forman cuerpos proteicos rodeados por la membrana del RE que los protegen de la proteólisis . El desarrollo de los hongos como huéspedes eficientes para la producción de proteínas de mamíferos también requiere la inactivación de las proteasas frecuentemente encontradas en el caldo de fermentación. En un estudio sistemático se identificaron diferentes proteasas secretadas relacionadas con la degradación de productos biofarmacéuticos, incluyendo anticuerpos, interferón α 2b y factor de crecimiento similar a la insulina, y se inactivaron varias de ellas. Esto condujo no sólo a una drástica reducción de la actividad de las proteasas, sino también a un fuerte aumento de la estabilidad de las tres proteínas recombinantes, siendo el anticuerpo el que mostró el efecto más pronunciado. Aunque la ingeniería del patrón de N-glicosilación para la producción de proteínas terapéuticas de gran valor ya se intentó anteriormente, la creación de un auténtico patrón de glicosilación humano en un huésped de expresión fúngica no parece factible por el momento. Por lo tanto, es dudoso que tales biofármacos sean producidos por fábricas de células fúngicas en el futuro, sobre todo teniendo en cuenta el rápido desarrollo de las células CHO .

Las mencionadas hidrofobinas son otro grupo de proteínas que han recibido una atención considerable debido a sus propiedades tensioactivas . Estas pequeñas proteínas extracelulares se autoensamblan en capas de proteínas en interfaces hidrofóbicas/hidrófilas debido a sus propiedades anfifílicas y hacen que las superficies hidrofóbicas sean mojables o que las superficies hidrofílicas sean hidrofóbicas. Tienen un amplio potencial en aplicaciones alimentarias y médicas para dispersar materiales hidrofóbicos, estabilizar espumas o dirigir diferentes moléculas a las superficies. Las cerato-plataninas son otro grupo de pequeñas proteínas secretadas con cuatro cisteínas conservadas. Se unen a la quitina y a los oligosacáridos de N-acetilglucosamina y poseen propiedades de autoensamblaje en interfaces hidrofóbicas/hidrófilas. A diferencia de las hidrofobinas, las cerato-plataninas mejoran las propiedades de polaridad/apolaridad de las superficies. También se atribuye una función de orientación a las CBM presentes en diferentes CAZymes. Pueden mejorar la actividad hidrolítica del dominio catalítico al que están unidas y conducir a un pH y una temperatura óptimos más favorables. Además, sus propiedades de unión a carbohidratos pueden aprovecharse para la purificación por afinidad de proteínas de fusión utilizando, por ejemplo, columnas de celulosa . La amplia gama de otras aplicaciones de las CBM recombinantes se ha revisado recientemente en otro lugar.

Trichoderma reesei para el bioprocesamiento consolidado y la catálisis de células enteras

El bioprocesamiento consolidado (CBP) se entiende clásicamente como la integración de la producción de enzimas celulolíticas, la hidrólisis enzimática y las etapas de fermentación de un proceso de producción de etanol celulósico en una sola operación unitaria. Por lo tanto, sería deseable un único organismo con buenas propiedades celulolíticas y una vía de fermentación de etanol eficiente. Sin embargo, el uso de consorcios microbianos también ha recibido cierta atención. Desgraciadamente, en la actualidad no se dispone de un organismo único que cumpla ambos requisitos (Fig. 2). En consecuencia, se han realizado esfuerzos para diseñar etanógenos que se conviertan en celulolíticos u organismos celulolíticos que se conviertan en etanógenos. En el contexto del primer escenario, T. reesei ha servido a menudo como donante de genes CAZyme, especialmente para cel5a y cel7b que codifican dos de sus endoglucanasas y para sus dos celobiohidrolasas cel6a y cel7a (Tabla 1). En todos los estudios publicados, la capacidad secretora relativamente baja de S. cerevisiae limitó la conversión de sustrato por las CAZimas heterólogas secretadas o ancladas en la membrana. Por lo tanto, los altos rendimientos de etanol con sustratos celulósicos realistas requirieron la complementación con cócteles enzimáticos comerciales de T. reesei. Sin embargo, aunque se están realizando esfuerzos para mejorar la secreción y la capacidad de despliegue de superficie de las cepas de S. cerevisiae modificadas, las cepas de despliegue de celulasa actualmente disponibles ya tienen el potencial de conducir a reducciones sustanciales de las cargas enzimáticas requeridas para la sacarificación de la biomasa. En el contexto del segundo escenario, el propio T. reesei representa un organismo objetivo prometedor. Pero aunque este hongo posee naturalmente la capacidad de metabolizar todos los azúcares relacionados con la biomasa y convertirlos en etanol, los rendimientos son bajos y se forma ácido acético como subproducto no deseado . Por otro lado, los regímenes de fermentación a gran escala de T. reesei están bien establecidos debido a su amplia aplicación en la producción comercial de enzimas, y las herramientas moleculares para su ingeniería genética también están muy bien desarrolladas. Uno de los grandes retos que quedan para emplear T. reesei como organismo CBP es que varias de sus celulasas y genes glicolíticos están reprimidos por la hipoxia , que es necesaria para la producción de etanol. Además, la represión transcripcional de las celulasas en presencia de etanol representa otro reto a superar. Sin embargo, la cepa hiperproductora de celulasas RUT-C30 tiene una mayor tolerancia al etanol en comparación con la cepa QM9414 del linaje Natick , y por lo tanto representa una cepa plataforma perfecta para desarrollar T. reesei como organismo CBP, especialmente porque también está desreprimida por el catabolito del carbono . Además, en presencia de una pulpa lignocelulósica, RUT-C30 exhibe una morfología similar a la de los pellets durante las primeras etapas de la fermentación , lo que puede lograrse de manera independiente del crecimiento mediante la adición del surfactante Triton X-100 y luego también conduce a una mayor producción de enzimas . Esto es importante porque la escasa capacidad de mezcla y las bajas densidades celulares máximas como consecuencia del crecimiento filamentoso obstaculizaban hasta ahora el uso de T. reesei como organismo PFC. En términos más generales, el bioprocesamiento consolidado también podría utilizarse para describir otros procesos integrados en los que el sustrato no es necesariamente la biomasa lignocelulósica, sino otro biopolímero como la quitina o el almidón, y el producto no es el etanol, sino cualquier otro metabolito . Con este fin, una serie de estudios recientes han tratado de sobreproducir diferentes metabolitos mediante la ingeniería de T. reesei (Tabla 2). Sin embargo, los rendimientos que pudieron alcanzarse estaban en la mayoría de los casos lejos de la comercialización, por lo que requerían una mayor optimización.

Herramientas para el diseño y la ingeniería celular

Aunque recientemente se han dado dos revisiones completas sobre la caja de herramientas moleculares de T. reesei y otras especies de Trichoderma, queremos actualizarlas con los avances más recientes en el campo. La ingeniería de cepas para mejorar la producción de celulasa o para la ingeniería metabólica requiere métodos eficientes para introducir alteraciones genéticas dirigidas en el organismo. La eficacia generalmente baja de la selección de genes ha sido durante mucho tiempo un reto importante para obtener un número razonable de transformantes mediante la integración homóloga de una deleción o un casete de expresión. Este problema se ha resuelto principalmente inactivando componentes de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) de reparación del ADN, como tku70 o tmus53 . Las cepas suprimidas por tku70 muestran una mejora en la orientación de los genes, aunque la eficiencia de la integración homóloga en estas cepas puede seguir variando en función del locus al que se dirija y, por tanto, podría descender hasta el 30%. Basándose en esta mejora, se desarrollaron varios enfoques novedosos para insertar casetes de expresión en una región genómica definida, evitando así los efectos pleiotrópicos causados por su integración aleatoria. Utilizando un fondo tku70, Jorgensen et al. desarrollaron una plataforma de expresión que emplea el locus ade2, de fácil detección, como sitio preferido de integración. Tras la integración del casete de expresión en este locus, ade2 se destruye y los transformantes resultantes desarrollan una pigmentación roja distintiva. En otro estudio, se eligieron los loci pyr4 y asl1 para desarrollar una cepa con auxotrofia de uridina y l-arginina que permite la integración dirigida a estos sitios . Ouaedraogo et al. siguieron una estrategia diferente y expresaron la meganucleasa I-SceI de S. cerevisiae en T. reesei. I-SceI genera roturas artificiales de doble cadena en un sitio de reconocimiento de I-SceI que se introdujo de antemano en un locus predefinido y mejoró tanto la eficiencia de transformación como la de integración homóloga. En un estudio posterior, las roturas de doble cadena mediadas por I-SceI se combinaron con una deleción tku70. En este caso, la incapacidad de reparar las roturas de doble cadena a través de NHEJ favorece la integración del casete, lo que conduce a eficiencias de recombinación homóloga de hasta el 100%. El sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 supuso una revolución para la ingeniería genética o la edición del genoma. Subrayando tanto la necesidad de tal tecnología como la creciente importancia como productor de enzimas, este sistema se probó por primera vez para hongos filamentosos en T. reesei . Introduce roturas de doble cadena de ADN específicas para estimular la orientación de los genes y depende únicamente de una nucleasa Cas9 (asociada a CRISPR) que utiliza un único ARN guía quimérico para la orientación. La orientación precisa de esta Cas9 guiada por ARN a una secuencia específica de ADN se consigue gracias a la secuencia protospacer del ARN guía mediante un simple emparejamiento de bases. Utilizando regiones flanqueantes de 200 pb para la construcción de la deleción del gen, se pudieron alcanzar frecuencias de RH superiores al 90 %. Las deleciones dobles y triples se produjeron con una frecuencia del 45 y el 4 %, respectivamente, tras una única ronda de transformación. Mientras que en este estudio los ARN guía transcritos in vitro se cotransformaron con el casete de deleción en un T. reesei que expresaba Cas9, Nødvig et al. utilizaron dos secuencias de ribozimas flanqueantes para liberar los ARN guía de un transcrito mayor que también codifica la enzima Cas9 en diferentes Aspergilli. Otra herramienta esencial necesaria tanto en la expresión de proteínas recombinantes como en la ingeniería de cepas son los promotores que permiten la expresión de genes de forma controlable. Aunque se dispone de una serie de promotores inducibles y reprimibles con las diferentes regiones promotoras de la celulasa, suelen presentar inconvenientes, ya que su expresión está ligada al metabolismo del huésped y los activadores pueden ser limitantes debido a los efectos de titulación del promotor. Entre las alternativas útiles se encuentra un conjunto de genes de T. reesei reprimibles por l-metionina con diferente fuerza de expresión basal . Se demostró que uno de estos promotores puede impulsar la expresión reprimida de diferentes genes informadores en varias fuentes de carbono, incluida la paja de trigo. En un estudio similar, se utilizó el promotor de un gen de la permeasa de cobre de T. reesei para controlar la expresión del principal regulador de la celulasa y la hemicelulasa, xyr1, en ausencia de cobre. Sin embargo, dado el hecho de que las enzimas que contienen cobre de la familia AA 9 son componentes importantes de la mezcla de celulasa de T. reesei , es, sin embargo, dudoso que este sistema pueda aplicarse en un escenario de producción de celulasa.

Además de estas emocionantes herramientas moleculares, ahora también están disponibles algunos trucos más antiguos de la genética clásica. El desarrollo de cepas de T. reesei se vio obstaculizado durante mucho tiempo por el hecho de que se pensaba que el hongo era asexual, lo que impedía el cruce de cepas. Un hito en este sentido fue el descubrimiento de que QM6a tiene un locus de tipo de apareamiento MAT1-2 y puede cruzarse fácilmente con ciertos aislados de tipo salvaje MAT1-1 de T. reesei. Pero cuando el locus MAT1-2 de QM6a fue sustituido por su homólogo MAT1-1, no se formaron estomas al confrontarlo con la cepa original MAT1-2 QM6a. En consecuencia, fue imposible explotar el apareamiento para la ingeniería de la cepa en las diferentes cepas académicas e industriales de T. reesei derivadas de QM6a. Utilizando un enfoque biológico de sistemas, se identificó el gen faltante responsable de la esterilidad femenina como ham5 . En N. crassa, ham-5 codifica para una proteína que sirve como andamio de la MAP quinasa durante la fusión celular. La reintroducción de un ham5 funcional restablece la formación de estromas en la cepa QM6a y permite la restauración de la fertilidad femenina en otras cepas procedentes de fondos QM6a . Este hallazgo es especialmente importante porque el cruce con los aislados de H. jecorina antes mencionados puede dar lugar a progenies segmentariamente aneuploides . Con esta herramienta en mano, se sientan las bases para identificar las mutaciones relevantes que conducen, por ejemplo, a la hiperproducción de celulasa. Esto es importante, ya que los enfoques tradicionales de complementación para identificar los genes que causan fenotipos mutantes no han tenido mucho éxito en especies como T. reesei. Y aunque la secuenciación de alto rendimiento y el análisis comparativo del genoma pueden identificar fácilmente las mutaciones en la línea de la cepa QM6a de hiperproductores y nulíferos de celulasa, sólo en unos pocos casos esto ha conducido ya a la vinculación de una mutación con un fenotipo concreto. Pero en los casos en los que se encontró un elevado número de mutaciones o las mutaciones afectaban a genes de función desconocida, el análisis comparativo de la secuencia no reveló la naturaleza de los genes objetivo deseados . Por ello, varios investigadores han aplicado con éxito el análisis de segregación masiva en combinación con la secuenciación de nueva generación para identificar las mutaciones relevantes. En este enfoque, el mutante se cruza con una cepa de referencia y el ADN genómico de los segregantes que muestran el fenotipo deseado se agrupa y se secuencia. La comparación de este conjunto de ADN secuenciado con los genomas de las cepas parentales puede revelar mutaciones conservadas relevantes para el fenotipo. Las mutaciones que no están relacionadas con el fenotipo estarán subrepresentadas. Aunque no se puede esperar que este enfoque conduzca a la identificación de una única mutación, ya que las mutaciones cercanas a la mutación relevante suelen co-segregarse, el número de objetivos para la investigación posterior se reduce considerablemente.