8.3 Pruebas químicas
La visualización de los componentes de los PHGs en las placas de TLC es posible mediante el uso de reactivos generales para los fenoles; cloruro férrico, vainillina y ácido clorhídrico (dan una gama de colores rosados con los derivados del resorcinol o del cloroglucinol), o utilizando pruebas más específicas con la 2,4-dinitrofenilhidrazina (detecta los aldehídos). El reactivo de Folin-Ciocalteu también es útil para detectar fenoles con núcleos de catecol o hioquinona (aparecen manchas azules inmediatamente después de rociar la placa de TLC) o para otros fenoles, que muestran manchas azules a grises cuando se fumiga la placa con vapor de amoníaco. El reactivo de Gibbs (cloroimida de 2,6-dicloroquinona al 2% en cloroformo) seguido de la fumigación de la placa con NH4OH 2M da una variedad de colores (por ejemplo, es capaz de distinguir el ácido vanílico -color rosa- y el ácido isovanílico -azul-). Los derivados del ácido cinámico dan una fluorescencia azul clara característica cuando se examinan bajo la luz ultravioleta (366 nm). Los isómeros cis y trans de los ácidos cinámicos se presentan en las placas de TLC cuando el extracto se cromatografía en disolventes acuosos en dos direcciones (2D-TLC). Los métodos espectrofotométricos para la estimación del contenido fenólico se utilizan con frecuencia, por ejemplo, el método con el reactivo de Arnow o el anteriormente mencionado reactivo de Folin-Ciocalteu.
Algunas pruebas cualitativas indican la presencia de cumarinas en los extractos vegetales, por ejemplo Prueba del anillo de lactona (las cumarinas hidrolizadas por un álcali diluido forman una solución amarilla de sales de ácido O-cumárico, que puede invertirse tras la acidificación o saturación por CO2); o la prueba de acoplamiento azoico (se desarrolla un color rojo debido a la reacción con el ácido sulfanílico de diazotización en una solución alcalina). Las cumarinas se detectan fácilmente bajo luz ultravioleta (365 nm), ya que dan una fluorescencia de color característica (excepto la cumarina simple no sustituida que no tiene fluorescencia). Se detectan por sus colores azul, violeta, marrón, verde o amarillo. Una solución al 10% de KOH en metanol o una solución al 20% de cloruro de antimonio en cloroformo pueden intensificar el color. Las hidroxicumarinas no presentan desplazamientos espectrales batocrómicos en solución alcalina. En el análisis por HPLC con detección de matriz de diodos, varios espectros UV de las cumarinas permiten una rápida identificación de los compuestos.
Las cromonas reaccionan en soluciones alcalinas para dar O-hidroxi-β-diketonas sin regeneración del anillo γ-pirona y también compuestos coloreados con ácido concentrado y álcali concentrado. Las cromonas también son visibles bajo luz ultravioleta (fluorescencia azul, amarilla, amarilla verdosa, marrón a 365 nm).
La presencia del anillo fenilo activo (cromóforo) en los flavonoides hace que sean fáciles de detectar bajo luz ultravioleta. Sus espectros UV son especialmente informativos, ya que proporcionan información estructural que permite distinguir el tipo de fenol y el patrón de oxidación. Son posibles diferentes reacciones químicas mediante la pulverización de cromatogramas de TLC; por ejemplo, la visualización en presencia de vapor de amoníaco (las chalconas y las auronas se vuelven de color naranja y rojo, respectivamente) o la pulverización con Naturstoff Reagenz A (solución al 1% del éster de 2-aminoetanol y ácido difenilbórico) y la sobrepulverización con un 5% de solución metanólica de polietilenglicol 4000 (PEG 4000), que aumenta la sensibilidad de esta reacción. Tras la derivatización, los compuestos pudieron observarse con luz ultravioleta (fluorescencia de amarillo claro a verde). Otras pruebas incluyen la pulverización con cloruro férrico, ácido sulfanílico diazotizado (ambas son reacciones para fenoles), y la reacción específica; cianidina con polvo de magnesio en presencia de ácido clorhídrico (indica la presencia de flavanonas y dihidroflavanoles) . Para la estimación colorimétrica cuantitativa de los flavonoides, se utiliza la reacción con cloruro de aluminio (AlCl3) (absorbancia medida a 425 nm). Los flavonoides disueltos en soluciones alcalinas dan un color amarillo intenso, que disminuye tras la adición de ácido. Los espectros UV de los compuestos flavonoides muestran dos bandas principales (máximos de absorbencia): la banda I a mayor longitud de onda (atribuida a la parte cinamoil de la estructura del flavonoide) y la banda II a menor longitud de onda (debida a la parte benzoil). La banda I se encuentra normalmente a 304-350 nm en el caso de las flavonas (H en el C-3 del anillo C), a 352-385 nm en el caso de los flavonoles (grupo OH en el C-3) y a 328-357 nm en el caso de los flavonoles 3-sustituidos (O-sustitución en el C-3). La banda II de la mayoría de las estructuras se encuentra a unos 250-280 nm. Un grupo fenólico adicional (-OH) en el anillo A provoca el desplazamiento batocrómico (desplazamiento a longitudes de onda más largas) en la banda II, y un grupo -OH adicional en el anillo B genera un efecto similar en la banda I.
La mayoría de las antraquinonas o sus glucósidos forman cristales amarillos o rojo anaranjados y pueden mostrar fluorescencia dependiente del pH . La principal reacción de color es la prueba de Bornträger, que se efectúa disolviendo la quinona en medio acuoso alcalino. La reacción de color oscila entre el rojo anaranjado y el violeta púrpura (dependiendo de la estructura y los sustituyentes de la quinona). Las antraquinonas dan un color rojo con esta reacción. En el caso de las 1,8-dihidroquinonas, también se utiliza la reacción con acetato de magnesio. Las antraquinonas pueden detectarse en las placas de TLC tras rociarlas con una solución metanólica de KOH al 10%. Los colores originales amarillo o amarillo-marrón cambian a rojo, violeta, verde o púrpura. El ruibarbo en polvo puede examinarse con luz ultravioleta para detectar la presencia de raponticina (glucósido estilbenoide, que es tóxico). En el ruibarbo original (Rheum palmatum) aparece una fluorescencia de color marrón rojizo, pero no se observan manchas brillantes de color azul-violeta (como en el caso del ruibarbo rhaponticum-Rheum rhaponticum).
Como se mencionó anteriormente las saponinas son compuestos activos en la superficie (modifican la tensión superficial) y tienen propiedades emulsionantes. Para una rápida comprobación cualitativa de si una planta tiene SPGs, se suele utilizar una prueba de espuma agitando el material vegetal con agua. Las saponinas tienen propiedades permeabilizadoras de las membranas. Concentraciones bajas de saponinas son capaces de destruir las membranas de los eritrocitos (que pueden precipitar el colesterol que existe en las membranas de los glóbulos rojos), provocando la hemólisis de la sangre in vitro. Esta capacidad ha llevado al uso generalizado de la hemólisis (índice hemolítico-IH) como método para determinar la actividad biológica. El IH se define como la cantidad de suspensión isotónica de sangre bovina al 2% (en mL), que experimenta hemólisis cuando se trata con 1 g de material vegetal probado (o extracto probado). Como referencia se utilizó la mezcla de saponinas de Gypsophila paniculata (IH=30.000) o Saponin Album (Merck) (IH=15.000). Como describen Hostettmann y Marston, la actividad hemolítica de los saponósidos varía considerablemente en función de la estructura de la parte glucósida. Las saponinas monodesmosídicas (excepto los acilglicósidos y la glicirricina) son fuertemente hemolíticas. Ninguna reacción de color es particularmente específica de los GES. Sin embargo, existe la reacción de Lieberman (con anhídrido acético en presencia de ácido sulfúrico), en la que los colores difieren según el tipo de aglicona (triterpeno-rosa a rojo-o esteroide-azul-verde).
Las reacciones químicas para identificar los GCR en el material vegetal pueden deberse a las agliconas o a los azúcares. La prueba de Liebermann y Salkoviski indica la fracción esteroidea, por lo que no es específica para los CRG. Las pruebas de Keller Kiliani y Xanthidrole, ambas indican desoxi-azúcares (digitoxosa o cimarosa). La reacción de Kedde o Baljet es más específica, porque está ligada a la presencia de un anillo de lactona α,β-insaturado. También es posible la reacción fluorescente de los CRG, por ejemplo, el grupo hidroxilo de la digoxina en C-14 y C-16 elimina el agua con H2SO4 con la formación de dos dobles enlaces adicionales. Esto da lugar a un sistema conjugado (con un doble enlace en el anillo de lactona) que hace que la digoxina sea fluorescente a la luz UV. La reacción de Jensen (después de rociar con ácido tricloroacético en etanol) se utiliza para visualizar los GCR en los cromatogramas de TLC.
La medición directa del HCN total por hidrólisis ácida de los glucósidos cianogénicos presentes en los alimentos, así como la descomposición de las cianohidrinas intermedias en HCN, tiene la ventaja de ser aplicable a todo tipo de muestras, aunque es probable que no todo el HCN potencial de los glucósidos cianogénicos esté disponible in vivo. La visualización de la presencia de estos compuestos en las plantas es posible en papel de filtro impregnado con reactivos, como el ácido pícrico/carbonato de sodio o la bencidina/acetato cúprico. Estos reactivos son capaces de dar reacciones de color con el HCN liberado del tejido vegetal triturado. Se coloca un papel impregnado en un tubo sobre el material vegetal triturado y se deja incubar a 40°C durante 2 h. Un cambio de color de amarillo a marrón rojizo indica la liberación enzimática de HCN. El papel picrato no es totalmente específico para el cianógeno (los isotiocianatos volátiles de las especies de Brassica también responden a esta reacción). Por lo tanto, también se utiliza otra prueba que utiliza una mezcla (1:1) de soluciones recién preparadas de difenilamina 4,4-tetrametildiamina al 1% en cloroformo (p/v) y acetoacetato de etilo de cobre al 1% en cloroformo (p/v). La reacción de color pasa de un azul-verde tenue a un verde brillante. Otro método posible requiere la destilación del tejido vegetal en agua ácida y la valoración del HCN liberado con nitrato de plata. Los métodos cromatográficos como HPLC/MS o GC/MS de los derivados del trimetilsililo son eficaces para el análisis de los glucósidos cianogénicos individuales o de las cianohidrinas, y proporcionan la caracterización química así como la cuantificación de los compuestos .
Debido a la diversidad de productos que se forman en las plantas a partir de los glucosinolatos (dependiendo de su estructura aglicona) la estimación de los isotiocianatos por el método espectrofotométrico (en el que se forman los productos de color 1,3-benzoditiol-2-tiones por condensación de isotiocianatos con 1,2-benceno-ditiol) puede ser insuficiente para determinar el contenido de glucosinolatos en las plantas .