Alai

Von Willebrandův faktor, ADAMTS13 a trombotická trombocytopenická purpura

VWF je syntetizován z velkého genu na chromozomu 12p13.31, který má 178 kb a obsahuje 52 exonů.49 Messengerová RNA (mRNA) produkovaná tímto genem specifikuje polypeptid o 2813 aminokyselinách, který zahrnuje signální peptid o 22 aminokyselinách, propeptid o 742 aminokyselinách a sekvenci o 2050 aminokyselinách, která tvoří monomerní stavební blok VWF nacházející se v plazmě. Po odštěpení signálního peptidu v endoplazmatickém retikulu jsou monomery obsahující propeptid disulfidicky spojeny do dimerů prostřednictvím meziřetězcových disulfidických vazeb zahrnujících zbytky Cys v blízkosti C-konce molekuly. Tyto dimery jsou poté transportovány do Golgiho aparátu, kde propeptid katalyzuje mezidimerní disulfidové vazby mezi zbytky v doméně D3, čímž vznikají dlouhé multimery složené z dimerů spojených hlava na hlavě, které obsahují N-konce na obou koncích. Propeptid je poté odštěpen enzymem podobným furinu a většina výsledného ULVWF je zabalena do zásobních granulí pro pozdější regulovanou sekreci.

Jsou známy pouze dva typy buněk, které syntetizují VWF: endotelové buňky a megakaryocyty. V endoteliálních buňkách je VWF uložen v granulích zvaných Weibel-Paladeho tělíska; v krevních destičkách je uložen v α-granulech. Většina VWF v krvi je endoteliálního původu. Uvolňování endoteliálního VWF může vyvolat mnoho podnětů, včetně adrenalinu, desamino-vasopresinu (DDAVP), histaminu, trombinu, Shiga toxinů a prozánětlivých cytokinů, včetně tumor nekrotizujícího faktoru (TNF)-α, interleukinu (IL)-8 a IL-6 (v komplexu s receptorem IL-6).50 Uvolňování endoteliálního VWF mohou vyvolat i další látky, což poskytuje vodítko k některým podnětným faktorům TTP. Mezi tyto činitele patří viry, jako je adenovirus51 , a oxidanty, jako je superoxid.52 Oxidanty mají nejen schopnost indukovat sekreci ULVWF; mohou také oxidovat VWF tak, že se stane neštěpitelným pro ADAMTS1353 a více adhezivním.54 Navíc oxidanty, zejména ty, které produkují neutrofily a monocyty během zánětu, mohou oxidovat klíčový methioninový zbytek v katalytické doméně ADAMTS13 a inaktivovat enzym.55

Ani endoteliální buňky, ani krevní destičky neuvolňují multimery VWF, které jsou větší než multimery v normální plazmě.56 Tyto multimery ULVWF jsou nejen mnohem větší než ty, které se normálně vyskytují v plazmě; jsou také mnohem adhezivnější a schopné spontánně vázat destičkový receptor VWF glykoprotein Ib (GPIbα; největší polypeptid komplexu GPIb-IX-V) a s vyšší pevností vazby, než jaké bylo dosaženo při vazbě plazmatického VWF na GPIbα v přítomnosti modulátorů ristocetinu nebo botrocetinu.57 In vivo se to projevuje tím, že ULVWF je schopen vázat krevní destičky při žádném nebo nízkém smykovém napětí, zatímco zpracovaný plazmatický VWF vyžaduje k navázání krevních destiček rozbalení vyvolané vysokým smykovým napětím.58

Část nově uvolněného ULVWF se přímo dostává do cirkulující krve, zatímco další frakce zůstává navázána na endotel, kde se multimery ULVWF mohou samoasociovat a vytvářet řetězce o délce několika set mikrometrů až několika milimetrů, které zůstávají ukotveny na povrchu endotelu.59 Povrchově navázané řetězce ULVWF jsou hyperadhezivní a spontánně vážou trombocyty a vytvářejí na povrchu endotelu řetězce zdobené trombocyty se vzhledem „korálků na provázcích“. Při fyziologickém smykovém napětí jsou řetězce ULVWF zdobené destičkami rozštěpeny ADAMTS13 a odstraněny z povrchu endotelu. Další zpracování, které dosud není plně charakterizováno, způsobuje, že VWF není schopen spontánně vázat krevní destičky. Hromadění řetězců ULVWF zdobených destičkami na povrchu endotelu v důsledku snížené hladiny nebo nepřítomnosti ADAMTS13 v cirkulaci iniciuje mikrovaskulární trombózu, která vede k tvorbě a ukládání hyalinních trombů bohatých na destičky v mikrovaskulatuře – charakteristický znak TTP.

Řetězce ULVWF se skládají ze svazků multimerů VWF a každý řetězec je připoután k povrchu endotelu na několika kotevních místech. V nepřítomnosti (nebo při nízkých koncentracích) Ca2+ a Mg2+ se řetězce ULVWF připojují k povrchu endotelu prostřednictvím vazby na P-selektin.60 V přítomnosti fyziologických koncentrací dvojmocných kationtů se vlákna ULVWF ukotvují k povrchu endotelu prostřednictvím interakce s integrinem αvβ3.61 Na tomto ukotvení vláken VWF se nepochybně podílejí i další molekuly, které však dosud nebyly identifikovány.

Schopnost VWF nebo multimerů ULVWF samoasociovat se do silnějších vláken a kabelů se stává důležitým mechanismem regulace adhezivních vlastností VWF. Savage a spol. ukázali, že při smykovém napětí a v přítomnosti trombocytů se multimery VWF v tekuté fázi homotypicky a reverzibilně asociují s multimery VWF, které jsou imobilizovány na kolagenovém povrchu; samoasociované multimery VWF podporují adhezi trombocytů při smykovém napětí.62 Multimery VWF v kapalné fázi mohou také asociovat s řetězci ULVWF navázanými na povrch endotelu63 a samoasociace je usnadněna částečným rozbalením molekul VWF vyvolaným smykovým napětím64,65 nebo vazbou ristocetinu66. Samoasociované multimery VWF vytvářejí síť zesíťovaných vláken na povrchu kolagenu64 nebo v roztoku.66 Při smykovém napětí se multimery VWF v kapalné fázi mohou také asociovat s multimery VWF, které jsou vázány na trombocyty prostřednictvím interakce s GPIbα na povrchu trombocytů.67 Samoasociace VWF na povrchu destiček může vyvolat aktivaci destiček, podpořit jejich agregaci a zvýšit růst trombu.

Schopnost VWF samoasociovat umožňuje vytvářet vlákna, která svou délkou a tloušťkou konkurují nebo převyšují vlákna vznikající polymerací fibrinu. V syntetických mikrocévách indukovaných k sekreci VWF stimulací agonisty se VWF vylučovaný z cévní stěny může sdružovat do vláken schopných překlenout lumen cévy, zejména v místech bifurkací a zakřivení.68 Schopnost VWF vytvářet vlákna a kabely tak obrovských rozměrů a natahovat tato vlákna napříč cestou proudění nejen zvyšuje šanci, že vlákna zachytí trombocyty, ale také zvyšuje jejich schopnost rozmělnit erytrocyty na schistocyty.

Samostatná asociace VWF je regulována nejen smykovým napětím, ale i plazmatickými faktory, které pravděpodobně mohou měnit průběh a závažnost epizod TTP. Sebeasociace VWF je tlumena lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) a apoliproteinem (Apo) A-I, hlavní proteinovou složkou HDL. Obojí významně snižuje délku a tloušťku vláken VWF imobilizovaných na povrchu endotelu. Adheze trombocytů k těmto hyperadhezivním strukturám se rovněž snižuje úměrně ke snížení množství samoasociovaného VWF. V modelu TMA u myší s knockoutem ADAMTS13 HDL také významně zmírnil trombocytopenii vyvolanou infuzí vysokých dávek lidského VWF.69 V souladu se schopností ApoA-I modulovat sebeasociaci VWF koreluje jeho plazmatická koncentrace inverzně s hladinou hyperadhezivního VWF u pacientů s TTP a sepsí. Tato zjištění naznačují, že zásah do sebeasociace VWF by mohl být novým přístupem k léčbě trombotických poruch spojených s hyperadhezivním VWF, včetně TTP.

Metaloproteáza štěpící VWF je 13. členem rodiny 18 různých dosud identifikovaných enzymů typu ADAMTS, které mají společnou strukturní podobnost.16,17 ADAMTS13 se skládá z N-koncové metaloproteázové domény reprolysinového typu (M), za níž následuje dezintegrinová doména (D), doména podobná trombospondinu-1 (T), doména bohatá na cystein (C), která obsahuje arginin-glycin-aspartátovou sekvenci, (S), sedm dalších domén podobných trombospondinu-1 (T2-8) a dvě neidentické domény typu CUB (CUB1-2) na C-konci molekuly (obr. 1). 24.2). Domény CUB obsahují peptidové sekvence podobné subkomponentám komplementu C1r/C1s, embryonálnímu proteinu mořského ježka egf a kostnímu morfogennímu proteinu-1.70 ADAMTS13 je 190 000-daltonový glykoprotein vyžadující Zn2+ a Ca2+, jehož gen se nachází na chromozomu 9q34 a je produkován převážně v hvězdicových buňkách jater.71,72 ADAMTS13 je inhibován EDTA, proto se funkční testy enzymu nejlépe provádějí na citrované plazmě.12,14-17,73-77 Pro testování by byla také vyhovující plazma antikoagulovaná heparinem, chlormethylketony (např. fenylalanin-prolin-aspartát chlormethylketon ), hirudinem a dalšími přímými inhibitory trombinu (DTI). Sérum vhodně ošetřené inhibitory proteáz je rovněž vhodné k testování.78

Štěpení VWF pomocí ADAMTS13 závisí na konformačních změnách VWF vyvolaných smykovým napětím, což je síla, která mění konformaci multimerů VWF z globulární na otevřenou.79 Po tomto konformačním přechodu následuje rozvinutí jedné nebo více domén A2 v multimeru VWF, což vystaví peptidovou vazbu Tyr1605-Met1606 štěpení ADAMTS1379 nebo oxidaci Met1606 chlornanem.54 Kromě smykové síly usnadňují přechod do přístupné konformace také změny ve struktuře domény A2 způsobené navázáním sacharidů,80 aminokyselinové substituce u VWD typu 2A, které destabilizují skládání domény A2,81 a mutace u VWD typu 2B82 a vazba ristocetinu,83 které současně vystavují doménu A1 pro vazbu destiček a místo štěpení ADAMTS13.

Rozpoznávání a štěpení VWF ADAMTS13 bylo podrobně studováno. Nedávné důkazy ukazují, že v nativní molekule ADAMTS13 jsou C-koncové domény T8-CUB v kontaktu s N-koncovými doménami MDTCS, což je intramolekulární interakce, která částečně inhibuje schopnost domén MDTCS vázat a štěpit peptidový substrát VWF-78. Tato interakce se projevuje i při štěpení VWF. V této nativní konformaci je ADAMTS13 částečně autoinhibován.84,85 Schopnost ADAMTS13 skládat se do této konformace je zřejmě usnadněna flexibilitou, kterou mu propůjčují čtyři předpokládané spojovací sekvence umístěné mezi doménami T1 a T2, T2 a T3, T4 a T5 a T8 a CUB1.86 Autoinhibice se zmírní, když jsou C-koncové domény buď zkráceny, nebo jsou na ně navázány protilátky či multimerní VWF, což umožní zapojení MDTCS domén do substrátu.

Na základě mutačních analýz, vazebných studií, kinetických analýz a použití syntetických peptidových substrátů byla identifikována četná interakční místa mezi konformačně aktivním ADAMTS13 a rozloženou doménou A2 VWF, která byla shrnuta do modelu molekulárního zipu,87 jak je schematicky znázorněno na obr. 24.3. Při vystavení multimerního VWF kritické úrovni smykového napětí se nejprve obnaží exosit v doméně A2. Tento exozit zahrnuje šroubovicovou oblast Glu1660-Arg1668, která je 65 aminokyselin C-terminálně od místa štěpení a váže se na spacerovou doménu ADAMTS13 s vysokou afinitou (KD ~ 10 nM).88-90 Střihové napětí také odhaluje druhý, nízkoafinitní exozit v doméně A2 na Asp1614 nebo v jeho blízkosti (místo P9′), který interaguje s Arg349 v dezintegrační doméně ADAMTS13.91 Interakce těchto dvou exositů s komplementárními oblastmi v ADAMTS13 umístí místo štěpení Tyr1605-Met1606 ve VWF do aktivního centra v metaloproteázové doméně ADAMTS13. To zahrnuje interakci Leu1603 (místo P3) ve VWF s komplementárními Leu198, Leu232 a L272 (místo S3) v ADAMTS13, Tyr1605 (místo P1) ve VWF s Leu151 a Val195 (místo S1) v ADAMTS13 a Met1606 (místo P1′) ve VWF s Asp252-Pro256 (místo S1′) v ADAMTS13.92 Phage display a analýza náhodných mutací potvrzují a ukazují, že pro štěpení jsou důležité také aminokyseliny v oblasti P3-P2′ a P11′ (Ile1616)93. Sekvenční interakce těchto komplementárních oblastí ve dvou multidoménových proteinech tedy usnadňuje specifické štěpení štěpné vazby.

Dlouho se předpokládalo, že neschopnost rozkládat multimery ULVWF způsobuje familiární a získané idiopatické typy TTP nebo predisponuje jedince k těmto poruchám (obr. 24.4).11,94 Kritické experimenty provedené za účelem ověření tohoto konceptu byly popsány v letech 1997 a 1998. U čtyř pacientů s chronickou recidivující TTP byl prokázán nedostatek plazmatické aktivity ADAMTS13.12 Protože nebyl zjištěn žádný inhibitor enzymu, byl tento nedostatek přisuzován abnormalitě v produkci, přežívání nebo funkci proteázy. Během následujícího roku byla objasněna patogeneze častějšího získaného idiopatického typu TTP.13-15 Pacienti se získanou idiopatickou TTP měli během akutní epizody jen malou nebo žádnou aktivitu ADAMTS13 v plazmě, ale tato aktivita se při zotavení zvýšila směrem k normálu. Ačkoli plazmatické testy v těchto studiích nebyly fyziologické, byly přesto inovativní a informativní. Autoprotilátky proti enzymu imunoglobulinu (Ig) G pravděpodobně vysvětlovaly nedostatek proteázové aktivity u většiny pacientů se získanou idiopatickou TTP.13-15 Důvody této přechodné imunitní dysregulace, stejně jako selektivní antigenní zacílení proteázy štěpící VWF, nejsou dosud známy.

Pacienti s familiární chronickou recidivující TTP mají často v plazmě multimery ULVWF.11,94 Multimery ULVWF jsou detekovány citlivou metodou elektroforézy v agarózovém gelu ve vzorcích plazmy některých pacientů během akutních epizod získané idiopatické TTP, ale ne po zotavení.94 Tyto nálezy vysvětlují badatelé, kteří u familiární chronické recidivující TTP zjistili chronickou absenci ADAMTS13 v plazmě, stejně jako přechodnou inhibici enzymu během akutních epizod získané idiopatické TTP.12-15

Většina pacientů s familiární TTP má v plazmě méně než 5 % normální aktivity ADAMTS13, bez ohledu na to, zda je plazma získána během akutních epizod nebo po nich (za předpokladu, že v poslední době nedostali infuzi plazmy). Většina pacientů se získanou idiopatickou TTP má méně než 5 % normální aktivity ADAMTS13 v plazmě pouze během akutních epizod TTP.12-15,24,95 Závažný nedostatek aktivity ADAMTS13 v plazmě pacientů s TTP koreluje s neschopností štěpit multimery ULVWF, které se vynořují z povrchu endoteliálních buněk (viz obr. 24.4).59 V důsledku toho zůstávají multimery ULVWF vylučované endoteliálními buňkami ukotveny na těchto buňkách a samoasociují se do dlouhých řetězců59 a jsou schopny zachytit procházející trombocyty vazbou na destičkový GPIbα (obr. 24.4). 24.5).68 (Trombocyty se spontánně nevážou na menší formy VWF, které cirkulují po rozštěpení multimerů ULVWF)56. K rostoucímu agregátu trombocytů se následně připojují další trombocyty (rekrutované do agregátu prostřednictvím aktivovaného αIIbβ3), které mohou růst až k uzávěru cévy (viz obr. 24.4).59,96 Ačkoli většina případů idiopatické TTP se projevuje závažným deficitem ADAMTS13, u části případů není aktivita enzymu měřená v současnosti dostupnými testy závažná.97 Zatím není jasné, zda je to způsobeno interferencí s aktivitou enzymu ze strany protilátek, které nejsou detekovány dostupnými testy, rezistencí VWF vůči štěpení (např. z důvodu oxidační modifikace),53 nebo jinými příčinami. Nicméně je pravděpodobné, že mnoho pacientů v této kategorii bude mít stále prospěch z léčby výměnou plazmy.98 Je třeba také zdůraznit, že nedostatek ADAMTS13 není pro stanovení diagnózy získané TTP ani senzitivní, ani specifický (aktivita ADAMTS13 je snížena u mnoha jiných onemocnění)99.

Vlákna VLVWF jsou schopna se oddělit od endoteliálních buněk i při absenci aktivity ADAMTS13, přičemž jsou mechanicky oddělena s rostoucím napětím generovaným smykovým napětím tekutiny při adhezi a agregaci destiček.59 Odtržené řetězce ULVWF a trombocytů mohou uzavírat navazující mikrovesely, což přispívá k orgánové ischemii.

U pacientů s familiární TTP téměř vždy chybí nebo je výrazně snížena aktivita ADAMTS13,12,100,101 v důsledku homozygotních nebo složených heterozygotních mutací genu ADAMTS13.18,24,95,102,103 Mutace u familiární TTP byly zjištěny v celém genu v oblastech, které kódují různé domény (viz obr. 24.2). Při těžkém vrozeném deficitu aktivity ADAMTS13 začínají epizody TTP obvykle v kojeneckém nebo dětském věku. U některých pacientů se však zjevné epizody TTP objeví až po několika letech (např. během prvního těhotenství)102 , pokud vůbec. Toto poslední pozorování naznačuje, že u některých pacientů přetrvává reziduální aktivita ADAMTS13 a akutní epizody TTP jsou spuštěny, když uvolnění ULVWF z endoteliálních buněk překročí omezenou kapacitu jejich ADAMTS13 je zpracovat. Jedním z případů, kdy k tomu může docházet s pravidelností, je těhotenství: Je známo, že hladina VWF během těhotenství stoupá.104-106 V souladu s touto představou jsou ženy s vrozenou TTP často diagnostikovány během prvního těhotenství.29 U dětí s novorozeneckým začátkem vrozené TTP a méně než 5% aktivitou ADAMTS13 je často výraznou součástí poruchy přechodné nebo progresivní selhání ledvin.107 Tito pacienti se klinicky podobají dvěma pacientům popsaným v roce 1960 Schulmanem a jeho kolegy108 a v roce 1978 Upshawem109; proto se tato pediatrická podskupina někdy označuje jako „Upshaw-Schulmanův syndrom“.

U mnoha pacientů se získanou TTP plazmatická aktivita ADAMTS13 buď chybí, nebo je výrazně snížená během akutních epizod, a zvyšuje se při zotavování, ať už po jednotlivých nebo opakovaných epizodách.13-15 Autoprotilátky IgG, které inhibují plazmatickou aktivitu ADAMTS13, lze detekovat u 44 % až 94 % těchto pacientů.13-15,102,110,111 Tyto výsledky naznačují přítomnost přechodné nebo intermitentně se opakující poruchy imunitní regulace u mnoha pacientů, kteří mají získanou idiopatickou TTP spojenou s deficitem ADAMTS13. Protilátky, které inhibují plazmatický ADAMTS13, byly identifikovány také u několika pacientů s TTP spojenou s tiklopidinem nebo klopidogrelem.34,112 Zatím není známo, zda se přechodný závažný defekt v produkci nebo přežívání ADAMTS13 vyskytuje u pacientů se získanou TTP, kteří nemají detekovatelné autoprotilátky proti tomuto enzymu. Alternativně může nezjištění inhibičních autoprotilátek u některých pacientů odrážet omezenou citlivost v současnosti používaných testovacích systémů. Neinhibiční autoprotilátky, které by se mohly vázat a potenciálně zprostředkovat imunitní clearance ADAMTS13, nejsou současným testovacím systémem detekovány.

Jedna studie hodnotila epitopy ADAMTS13 rozpoznávané polyklonálními autoprotilátkami u 25 pacientů se získanou TTP,113 přičemž zjistila, že cílem protilátek byla vždy sekvence domény bohaté na cystein/spacer (CS); u 3 pacientů byla tato oblast jediným cílem protilátek. Ostatních 22 autoprotilátek reagovalo se sekvencí domény CS plus doménami CUB (64 %), sekvencí metaloproteázy/disintegrinu podobné/první trombospondinu-1 podobné domény (MDT) (56 %) nebo oblastí obsahující druhé až osmé trombospondinu-1 podobné repetice (T2-8, 28 %) (viz obr. 24.2). Propeptidovou oblast identifikovalo také 20 % autoprotilátek,113 což naznačuje, že odstranění propeptidu není nutné pro sekreci aktivního enzymu.114 Autoprotilátky inhibují aktivitu ADAMTS13 nebo snižují jeho přežívání. V jiné studii u sedmi pacientů identifikovali Luken a spol.115 autoprotilátky proti ADAMTS13 u šesti pacientů, které se vázaly výhradně v rámci spacerové domény (S); u sedmého pacienta se protilátky vázaly jak na S doménu, tak na T2-8 repetice. Mutagenezí tito badatelé určili, že oblasti Thr572-Asn579 a Val657-Gly666 ve spacerové doméně ADAMTS13 jsou společnými epitopy pro vazbu autoprotilátek.116 Když byly Arg660, Tyr661 nebo Tyr665 nahrazeny alaninem, vazba autoprotilátek od šesti pacientů s TTP byla eliminována.117

Auto-protilátky proti ADAMTS13 u pacientů se získanou TTP patří převážně do třídy IgG,118 i když byly zjištěny také protilátky třídy IgM a IgA.119 Klonování a sekvenování monoklonálních protilátek od pacientů se získanou TTP ukazuje, že dochází k přednostnímu začlenění segmentu genu těžkého řetězce VH1-69 do variabilní oblasti imunoglobulinů.120,121 Tato preference naznačuje, že oblast CDR2 nebo CDR3 VH1-69 může přispívat ke specifitě pro epitop na spacerové doméně ADAMTS13. Při analýze distribuce podtypů protilátek u 58 pacientů s akutní získanou TTP byly zjištěny protilátky patřící ke všem podtypům IgG.118 Nejčastějším podtypem byl IgG4, který byl přítomen u 90 % pacientů, a to buď samostatně, nebo v kombinaci s jinými podtypy IgG.

Tvorba autoprotilátek ADAMTS13 je téměř jistě geneticky ovlivněna. Tuto skutečnost zdůrazňuje objevení získané TTP u sester-dvojčat způsobené autoprotilátkami ADAMTS13.122 Relapsy se vyskytují u 23 % až 44 % pacientů se získanou TTP,102,110,123,124 často během prvního roku po první epizodě.102 Relaps je nejčastější u pacientů s nejnižšími hladinami aktivity ADAMTS13 (<10 %).

Těhotenství a období po porodu představují v souvislosti s TTP zvláštní výzvu. Za prvé, preeklampsie a syndrom HELLP (hemolýza, zvýšené jaterní enzymy, nízká hladina trombocytů) mají mnoho klinických rysů, které se překrývají s TTP, a mohou mít společné některé patofyziologické rysy, jako je systémová endoteliální dysfunkce a proteinurie (viz kapitola 32).125 Syndrom HELLP může být obzvláště obtížné odlišit od TTP, protože se rovněž projevuje mikroangiopatickou hemolytickou anémií, zvýšenou hladinou LDH a trombocytopenií (i když obvykle ne tak závažnou jako u TTP).126 TTP v těhotenství může být spojena s autoprotilátkami proti ADAMTS13 a onemocnění se obvykle projeví v blízkosti porodu nebo po porodu.127 Odhady rizika recidivy během následujících těhotenství se značně liší a pohybují se od 26 % do 73 % na jedno těhotenství.102

Plazmatická aktivita ADAMTS13 se u zdravých dospělých pohybuje přibližně od 50 % do 178 % normální sdružené plazmy při použití v současnosti dostupných statických testů. Snížená aktivita ADAMTS13 byla zjištěna také u jaterních onemocnění, diseminovaných malignit,128 systémových zánětlivých syndromů, například způsobených endotoxinem,129 akutní pankreatitidy,130 těžké sepse a septického šoku,131 sepsí indukované DIC132 a sepsí indukované orgánové dysfunkce.133-135 Kromě toho lze nízké hladiny ADAMTS13 nalézt v těhotenství a u novorozenců.136 S výjimkou žen v peripartálním období, u nichž se vyvine zjevná TTP,102,110 není aktivita ADAMTS13 pozorovaná u pacientů s těmito stavy snížena na extrémně nízké hodnoty (<5 % normálu), které se vyskytují u většiny pacientů s familiární nebo získanou TTP.

Assays ADAMTS13

Assays ADAMTS13 stanovuje proteolytickou aktivitu, hladinu antigenu a hladinu autoprotilátek proti ADAMTS13. Dřívější testy aktivity ADAMTS13 byly založeny na degradaci purifikovaných multimerů VWF v přítomnosti denaturačních činidel a kvantifikaci štěpných produktů pomocí imunoblotu,74,75 zbytkové vazby kolagenu,137 nebo snížené agregace destiček vyvolané ristocetinem.138 Ačkoli jsou tyto testy citlivé, jejich provedení je těžkopádné a časově náročné a zahrnuje použití denaturačních činidel. Tyto testy byly nahrazeny poté, co studie rekombinantních fragmentů VWF odhalily minimální sekvence nezbytné pro měření aktivity. Kokame a spolupracovníci provedli částečné delece domény A2 VWF a identifikovali minimální peptid o 73 aminokyselinách (VWF73, Asp1596-Arg1668), který byl účinně štěpen ADAMTS13 bez denaturantů za statických podmínek.88 Následně bylo vyvinuto několik testů založených na štěpení peptidů zahrnujících VWF73, jako je fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET)97 , VWF78 s vazbou na HRP,139 ELISA,140 imunoblotting141 a hmotnostní spektrometrie142.

V roce 2008 byla provedena druhá mezinárodní kolaborativní studie s cílem porovnat výkonnost osmi funkčních a tří antigenních testů pro ADAMTS13.143 Srovnání těchto metod ukázalo, že testy štěpení založené na modifikovaných peptidech VWF jako substrátech nabízejí vysokou přesnost a reprodukovatelnost a nízkou odchylku a variabilitu mezi metodami. Test FRET-VWF73 se od té doby široce používá ke kvantifikaci aktivity ADAMTS13 ve vzorcích pacientů. Ačkoli se test založený na FRET snadno provádí, má několik omezení. Za prvé, štěpení FRET-VWF73 za použití citrované plazmy jako zdroje ADAMTS13 by mělo být prováděno při teplotě nižší než 33 °C, protože při 37 °C dochází k významné ireverzibilní inaktivaci ADAMTS13 chelatací vápníku zprostředkovanou citrátem. Za druhé, optimální detekce fluorescenčního signálu vyžaduje provedení štěpení substrátu FRET-VWF73 při pH 6,1, což snižuje rychlost štěpení. Za třetí, při tomto suboptimálním pH některé inhibiční autoprotilátky netvoří stabilní komplexy s ADAMTS13 a tyto protilátky zůstávají ve studiích inhibice nedetekovány. Začtvrté dochází k významné interferenci fluorescenčního signálu hemoglobinem a bilirubinem v důsledku spektrálního překrývání. Byl vyvinut vylepšený peptidový substrát na bázi FRET, FRETS-rVWF71. Pomocí tohoto vylepšeného substrátu lze měřit aktivitu ADAMTS13 v séru a citrované nebo heparinizované plazmě při fyziologickém pH, iontové síle a koncentraci vápníku, aniž by docházelo k interferenci s endogenními multimery VWF nebo bilirubinem či hemoglobinem v plazmě.78 Dalším omezením těchto testů aktivity na bázi peptidů je, že se nehodnotí schopnost ADAMTS13 štěpit multimerní VWF při smykovém napětí. Ačkoli bylo prokázáno, že smykové napětí vyvolané konstantním vířením podporuje štěpení multimerů VWF,144 kvantifikace produktů štěpení pomocí imunoblotu je stále časově náročná. Pro měření aktivity ADAMTS13 jsou k dispozici nejméně čtyři komerční soupravy založené na uváděných metodách. Tyto soupravy však nebyly hodnoceny v přímých srovnávacích a standardizačních studiích.

Hladiny antigenu ADAMTS13 byly kvantifikovány pomocí monoklonálních a polyklonálních protilátek.145,146 Vliv zkrácení, mutací a autoprotilátek na přesnost a citlivost těchto testů není jasný. Pro měření hladin antigenu ADAMTS13 je k dispozici pět komerčních testovacích souprav, ale nebyla provedena validace a srovnání s jinými testy.

V roce 2015 byl stanoven první mezinárodní standard pro ADAMTS13, který byl testován ve 32 laboratořích ze 14 zemí na aktivitu ADAMTS13 a hladiny antigenu oproti místním standardům.147 Tento plazmatický standard, označený WHO IS (12/252), byl získán ze sdružené plazmy od 38 zdravých dárců. Tato studie ukázala konsenzuální průměrnou hodnotu 0,91 jednotek/ml aktivity ADAMTS13 pro tuto plazmu s mezilaboratorní variabilitou 12,4 % a 0,92 jednotek/ml antigenu ADAMTS13 s mezilaboratorní variabilitou 16,3 %. Velká mezilaboratorní variabilita nebyla primárně způsobena použitím různých místních standardů, ale metodickými rozdíly mezi laboratořemi.

Testy autoprotilátek proti ADAMTS13 se obvykle provádějí smícháním tepelně inaktivované pacientské plazmy se známým množstvím sdružené normální plazmy a měřením zbytkové aktivity ADAMTS13. Neutralizující protilátky se detekují pomocí imunoblotu.148

Ačkoli dosud nebyl identifikován žádný inhibitor specifický pro ADAMTS13, několik proteinů a peptidů může za zvláštních podmínek inhibovat štěpení VWF ADAMTS13. Patří mezi ně hemoglobin, IL-6, trombospondin-1 a neutrofilní α-defensiny. Ve všech případech inhibiční látky zřejmě vážou substrát, VWF, a brání tak štěpení VWF pomocí ADAMTS13. Bylo prokázáno, že tímto způsobem působí hemoglobin, který váže řetězce VWF na povrchu endotelu za průtoku a kompetitivně blokuje štěpení pomocí ADAMTS13.149 Tento mechanismus může přispívat k vazo-okluzivním komplikacím u pacientů se srpkovitou anémií s významnou hemolýzou a dále komplikovat TTP při vysoké míře hemolýzy. Vysoké koncentrace IL-6 (50 a 100 ng/ml) rovněž inhibují ADAMTS13 zprostředkované štěpení endoteliálních řetězců ULVWF za průtoku in vitro,50 což naznačuje, že tento mechanismus může přispívat k trombóze během cytokinové bouře150 nebo syndromu uvolňování cytokinů.151 Trombospondin-1, hojný protein v α-granulech krevních destiček, který se uvolňuje do cirkulace při aktivaci destiček, váže oblasti A2-A3 VWF, kompetitivně blokuje a inhibuje štěpení pomocí ADAMTS13 in vitro.152 Tato protrombotická vlastnost trombospondinu-1 je v souladu s defektním náborem destiček do aktivovaného nebo poškozeného endotelu a zvýšenou embolizací destičkových trombů pozorovanou u myší s knockoutem trombospondinu-1.153 Lidské neutrofilní peptidy známé jako α-defensiny, uvolňované z aktivovaných neutrofilů, mohou vázat doménu A2 VWF a kompetitivně blokovat štěpení zprostředkované ADAMTS13.154 Koncentrace α-defensinů se v plazmě pacientů se získanou TTP zvyšuje až sedmkrát.

.