Alai

Souhrn

Východiska: Zhodnocení výskytu, důsledků a strategie prevence aloimunizace anti-D u nosiček varianty D v porodnické populaci Splitsko-dalmatské župy v Chorvatsku. Metody: Případy RhD imunizace byly hodnoceny retrospektivně za období 1993-2012. Ženy byly vyšetřeny na RhD antigen a nepravidelné protilátky. Ty, které měly anti-D protilátky a nebyly sérologicky D-, byly genotypizovány na RHD. Byla u nich vyhodnocena porodnická a transfuzní anamnéza a titr anti-D. U novorozenců byl hodnocen RhD status, přímý antiglobulinový test (DAT), hladiny hemoglobinu a bilirubinu, transfuzní terapie i fototerapie a výsledek. Výsledky: Ze 104 884 živě narozených dětí bylo 102 982 žen testováno na RhD antigen. Anti-D imunizace se vyskytla u 184 žen, což představuje 0,9 % jedinců s rizikem tvorby anti-D. U žen sérologicky typizovaných jako D- se vyskytlo 181 případů. Tři ženy byly částečnými nosičkami D (DVa n = 2, DNB n = 1), původně byly typizovány jako RhD+ a po proběhlé imunizaci byly rozpoznány jako nosičky D varianty. Titr anti-D se pohyboval v rozmezí od 1:1 do 1:16. Šest dětí bylo RhD+, čtyři měly pozitivní DAT a dvě podstoupily fototerapii. Závěr: Anti-D imunizace se vyskytla u těhotných částečných nosiček D (DVa, DNB). RhD+ děti měly sérologické markery hemolytického onemocnění plodu a novorozence (HDFN), přičemž se nevyskytl žádný případ těžké HDFN.

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

Úvod

Antigen RhD je vysoce imunogenní antigen významný pro porodnictví vzhledem ke schopnosti anti-D způsobovat hemolytické onemocnění plodu a novorozence (HDFN) . Kromě běžného D+ , může být antigen D prezentován ve více než 200 variantách, které jsou v současné době známy jako varianty D . Snížená exprese antigenu D se tradičně označuje jako „slabý D“, zatímco „částečný D“ představuje varianty, u nichž mutace a přestavby genů vedou ke změněné sekvenci proteinu, v níž chybí určité polypeptidy na vnějším povrchu RBC , ačkoli bylo prokázáno, že rozdíl mezi slabým a částečným D je plynulý a že slabé typy D mají mírně až výrazně změněné antigeny D . Většina slabých variant D u Kavkazanů zahrnuje slabý D typ 1, typ 2 a typ 3, o nichž není známo, že by tvořily aloanti-D . Naopak částeční nositelé D jsou náchylní k tvorbě anti-D . Kategorie DVI je klinicky nejvýznamnější parciální D u Kavkazanů, přičemž se jedná o variantu D, u které se nejčastěji uvádí, že se podílí na vzniku anti-D imunizace i HDFN . HDFN u kojenců od matek s částečným D a anti-D byla zdokumentována, ale ve většině případů byla až na vzácné výjimky mírná .

Nízké riziko imunizace RhD u žen se slabým typem D 1, 2 a 3 je důvodem, proč většina autorů zastává názor, že ženy s převažujícím slabým typem D nevyžadují RhD imunoprofylaxi , a pacientky se slabým D mohou bezpečně dostávat D+ jednotky RBC . Naopak ženy s částečným D by měly být klasifikovány jako D- s ohledem na jejich prenatální management a RhD imunoprofylaxi . V Evropě jsou anti-D reagencie vybírány tak, aby těhotné nositelky DVI byly záměrně klasifikovány jako D-, aby bylo zajištěno, že tyto matky dostanou RhD imunoprofylaxi ve druhém trimestru a/nebo po porodu. Distribuce D variant se v různých populacích liší a jejich rozpoznání závisí na výběru použitých D typizačních činidel .

Retrospektivně jsme vyhodnotili případy RhD aloimunizace a RhD antigenu u těhotných žen za období 20 let. U žen, které nebyly sérologicky D-, jsme analyzovali příčinu imunizace (transfuze nebo těhotenství), jejich sérologickou reaktivitu a genotyp RHD. Také jsme zjišťovali, zda se vyskytly případy HDFN u dětí matek s RhD aloimunizovanou D variantou. Cílem studie bylo zhodnotit výskyt a důsledky aloimunizace anti-D u nosiček varianty D v porodnické populaci Splitsko-dalmatské župy.

Materiál a metody

Předkládaná studie byla provedena na Oddělení transfuzního lékařství Univerzitního nemocničního centra ve Splitu, Splitsko-dalmatská župa, Chorvatsko. Splitsko-dalmatská župa má přibližně 5 000 porodů za rok. Nemocnice je regionální institucí odpovědnou za celkovou péči o těhotné, sledování žen s aloimunizací RBC a vedení porodů. Všechny těhotné ženy v tomto regionu byly při první návštěvě typizovány na antigeny ABO a RhD a testovány na nepravidelné protilátky. Při každé další návštěvě byla provedena pouze kontrola nepřímým antiglobulinovým testem (IAT). RhD imunoprofylaxe je rutinně podávána RhD- ženám po porodu RhD+ dítěte. Ženy s variantou D byly považovány za RhD-, pokud byla nutná transfuzní léčba, ale nedostaly RhD imunoprofylaxi. Pokud genotypizace RHD odhalila částečný antigen D, byla imunoprofylaxe podána po porodu dítěte RhD+.

Těhotenství s variantou D a anti-D

Retrospektivně jsme vyhodnotili RhD imunizační události v porodnické populaci za období od 1. ledna 1993 do 31. prosince 2012. Ve Splitsko-dalmatské župě bylo v období od 1. ledna 1993 do 31. prosince 2012 registrováno 104 884 živě narozených dětí. V tomto období bylo na našem oddělení vyšetřeno 102 982 těhotenství na antigeny ABO a RhD a na nepravidelné protilátky (98% pokrytí screeningem, což je ve shodě s předchozí studií na naší porodnické populaci) . Počet vyšetření RhD typizace a počet sérologicky rozpoznaných variant D byl získán z ručně psaného protokolu o vyšetření porodnic za období 1993-2001 a z počítačové databáze za období 2002-2012.

V tomto období jsme pro sledování těhotenství s aloantigeny anti-D používali formuláře pro sledování očkování, které byly vyplňovány po zjištění klinicky relevantních aloantigenů. Z těchto formulářů jsme analyzovali celkový počet těhotných žen s RhD imunizací s podrobnou analýzou RhD imunizovaných žen, které nebyly sérologicky RhD-. U těchto žen jsme analyzovali imunizační události, které mohly způsobit RhD imunizaci, předchozí těhotenství, předchozí transfuze a podávání RhD imunoprofylaxe po porodu; navíc jsme analyzovali RHD genotyp žen s D variantou. Během těhotenství byl titr anti-D protilátek měřen v intervalech 2-4 týdnů a výsledky každého měření byly zaznamenány do formulářů pro sledování imunizace. Formuláře obsahovaly také údaje o RhD statusu kojenců a přímém antiglobulinovém testu (DAT).

Údaje o RhD+ dětech od žen s variantou D s protilátkami anti-D byly shromažďovány z anamnézy pacientů na oddělení pediatrie a neonatologie. Shromážděné informace zahrnovaly údaje o HDFN, novorozeneckých hladinách hemoglobinu a bilirubinu, novorozenecké transfuzní terapii a fototerapii a dalších novorozeneckých výsledcích.

Serologická typizace RhD antigenu

V období od 1. ledna 1993 do 10. dubna 2008 byla prováděna rutinní typizace RhD pomocí přímé aglutinace ve zkumavce s dvěma z následujících monoklonálních činidel: Anti-D M MonoGnost® (MS-201; BioGnost, Zagreb, Chorvatsko); NovaClone® Anti-D IgM+IgG Monoklonální směs (CI 175-2, D415, 1E4, Immucor Gamma, Dartmouth, NS, Kanada); Anti-D MG MonoGnost® (RUM-1 IgM, MS-26 IgG, BioGnost).

Pokud byl RhD antigen při přímé aglutinaci negativní, byl typizován v IAT. RhD antigen typizovaný jako negativní v přímé aglutinaci, ale pozitivní v IAT, byl klasifikován jako „varianta D“. Testování RhD antigenu v IAT pomocí sloupcové metody bylo provedeno s použitím lidské monoklonálně-polyklonální směsi Anti-D BioClone® (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA).

Od 10. dubna 2008 do 31. prosince 2012 byla typizace RhD v přímé aglutinaci prováděna automatizovanou mikrokolonovou technologií s použitím ABO-DD Grouping Cassette (Ortho Clinical Diagnostics), která obsahuje dvě monoklonální IgM anti-D reagencie (klon D7B8, a klon RUM-1). Vyšetření RhD antigenu v IAT bylo po zavedení mikrokolonové technologie vynecháno. Případy s nesouhlasnými sérologickými výsledky byly odeslány na molekulární analýzu RHD a u žen, u nichž bylo zjištěno, že jsou částečnými nosičkami D, byla zavedena imunoprofylaxe.

Genotypizace RHD

Extrakce DNA ze vzorků krve EDTA byla provedena manuálně pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini kit® (Qiaqen, Hilden, Německo) nebo analyzátorem Qiacube® (Qiaqen). Molekulární typizace variant D byla provedena pomocí souprav PCR-SSP (Ready GeneWeak D® a Ready GeneCDE®; Inno-Train, Kronberg im Taunus, Německo) podle pokynů výrobce.

Výsledky

Ve sledovaném období bylo ze 102 982 těhotenství vyšetřených na antigeny ABO a RhD a nepravidelné protilátky 184 těhotných žen postižených RhD aloimunizací u 20 050 žen, které byly RhD- nebo D variantou. To představuje 0,9 % těhotných žen s rizikem RhD aloimunizace. Z toho 181 žen bylo sérologicky typizováno jako RhD- a 3 imunizace (1,63 % anti-D imunizací) proběhly u žen, které byly nositelkami RhD variant. Genotypizace RHD určila, že 2 ze 3 žen byly nositelkami částečného D typu Va, zatímco 1 žena byla nositelkou částečného D typu DNB (obr. 1). Všechny 3 ženy byly při počáteční sérologické typizaci RhD antigenu označeny jako RhD+, což bylo způsobeno výběrem reagencií, které byly v té době použity (Anti-D M MonoGnost, NovaClone Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend. Proto 2 ze 3 pacientů dostali RhD+ RBC a žádný z nich nedostal antenatální ani postnatální anti-D imunoprofylaxi. Charakteristiky parciální D ženy s anti-D imunizací jsou uvedeny v tabulce 1. Jedna z nich (DVa) byla imunizována výhradně v důsledku těhotenství, zatímco u ostatních 2 žen (DVa a DNB) byla imunizace nejspíše důsledkem transfuze RhD+ RBC (tabulka 1).

V průběhu sledovaného období bylo 484 žen typizováno jako varianta D (Du) pouze pomocí sérologických typizačních metod. Těmto ženám nebyla podána imunoprofylaxe, ale v případě transfuze dostaly jednotky RBC D- (obr. 1). Nebyly mezi nimi zaznamenány žádné případy tvorby anti-D.

Tabulka 2 uvádí údaje o titru anti-D u imunizovaných matek a také údaje o jejich postižených dětech, včetně novorozeneckého DAT, hemoglobinu, bilirubinu, fototerapie a transfuzní léčby.

Při vyšetřování pozitivního DAT novorozence bylo zjištěno, že žena s variantou DNB byla imunizována. Vzhledem k tomu, že žena byla občankou Bosny a Hercegoviny a do Chorvatska přicestovala krátce před porodem, nebyly k dispozici údaje o jejím dřívějším imunohematologickém vyšetření. Pomocí informací z její zdravotní anamnézy jsme však zjistili, že po předchozím porodu dítěte dostala RBC A+. Novorozenec vyžadoval pouze fototerapii. V jejím dalším těhotenství se narodilo dítě, jehož DAT byl silně pozitivní a dítě vyžadovalo v 8. dni života doplňující transfuzi. Transfuze však nebyla přičítána hemolýze, ale operaci kvůli inkarcerované kýle.

U druhé ženy (parciální D typ Va) byla při opakovaném rutinním screeningu nepravidelných protilátek ve 34. týdnu druhého těhotenství zjištěna aloimunizace. Její transfuzní anamnéza byla negativní. Přestože čekala RhD+ dítě, její titr anti-D zůstal po celou dobu těhotenství velmi nízký. DAT novorozence po porodu byl negativní a hladiny bilirubinu a hemoglobinu byly v referenčním rozmezí. Její druhé RhD+ dítě však mělo patologicky vysoké hladiny bilirubinu a vyžadovalo fototerapii.

Třetí žena (parciální D typ Va) byla při rutinním vyšetření krevních skupin a screeningu ve druhém těhotenství zjištěna jako aloimunizovaná, její první těhotenství bylo bezproblémové, ale následovala transfuze dvou jednotek A+ RhD+ RBC. Přestože se jí ze čtyř následujících těhotenství ve dvou případech narodily děti RhD+, jejichž DAT byl 1+ pozitivní, a měla nejvyšší titr anti-D ze všech 3 žen, ani u jednoho z jejích dětí nebyla zjištěna patologicky vysoká hladina bilirubinu, viditelná žloutenka nebo anémie, jejich poporodní období bylo bezproblémové a z nemocnice byly propuštěny bez komplikací. Celkem se u žen s částečnou D variantou a anti-D imunizací jednalo o šest těhotenství s RhD+ dětmi. Dvě děti potřebovaly fototerapii, ale nevyskytly se žádné případy závažné HDFN.

Diskuse

Tato studie analyzuje RhD imunizaci u těhotných žen, které byly nositelkami D variant, ve Splitsko-dalmatské župě. Zjistili jsme 184 těhotných žen s anti-D protilátkami, což představuje 0,9 % jedinců s rizikem vzniku anti-D protilátek. To je ve shodě s nedávnou prací o naší porodnické populaci s anti-D . Takto vysoké procento přičítáme skutečnosti, že u nás není prováděna prenatální profylaxe, na jejíž nutnost stát se standardní praxí již bylo upozorňováno . Sérologicky bylo jako RhD- typizováno 181 aloimunizovaných žen. Tři aloimunizované osoby původně typizované jako RhD+ byly částečnými nosičkami D. Mezi těhotnými ženami, které byly původně uznány jako D varianta a byl jim přiřazen status „Du“, nebyly zaznamenány žádné případy tvorby anti-D.

V doporučeních některých zemí pro prevenci aloimunizace anti-D se uvádí, že ženy se slabým D nebo Du nevyžadují profylaxi, zatímco novější doporučení zdůrazňují důležitost řešení nejasných výsledků typizace RhD , a léčení všech variant D kromě slabých typů D 1, 2 a 3 jako D- .

Do roku 2008 bylo testování RhD antigenu v našem centru založeno pouze na sérologii. Ženy, u nichž byla přímou aglutinací zkumavkovou metodou zjištěna RhD-, ale při nepřímé aglutinaci RhD+, byly zařazeny do varianty D nebo Du a nedostávaly RhD imunoprofylaxi; vzhledem k transfuzní léčbě však byly považovány za RhD-. Při použití tohoto přístupu byly těhotné ženy s částečným antigenem D klasifikovány jako D varianta nebo Du. a nebyla jim podána imunoprofylaxe; v důsledku toho nebylo zabráněno imunizačním událostem v důsledku těhotenství. V našem centru byly od roku 2008 případy s nejasným výsledkem sérologické RhD typizace podrobeny molekulární analýze RHD a u žen, které byly genotypizovány jako částečné nosičky D, byla zavedena imunoprofylaxe. Také další studie poukazují na význam genotypizace RHD u těhotných žen s variantou antigenu D pro správnou identifikaci částečných nosiček D, kterým je třeba podávat imunoprofylaxi .

Všechny 3 aloimunizované ženy s částečným D v našem výzkumu nedostaly imunoprofylaxi a 2 z nich dostaly RhD+ jednotky RBC, protože původně nebyly rozpoznány jako nositelky varianty D a byly typizovány jako RhD+. Pouze 1 imunizační příhoda u ženy s částečným D byla zcela spojena s těhotenstvím. U zbývajících 2 imunizací RhD nebylo možné určit, zda imunizaci způsobila transfuze nebo těhotenství. To naznačuje, že rozpoznání varianty D během sérologické typizace je nezbytné k zajištění toho, aby těhotné nositelky částečného D byly léčeny jako RhD- s ohledem na transfuzní terapii a imunoprofylaxi.

Po vyřazení RhD typizace v IAT u těhotných žen v roce 2008 byly ženy s variantou DVI, pokud se v naší porodnické populaci vyskytovaly, typizovány jako RhD-, zatímco dříve jim byla přiřazována varianta D nebo Du, protože DVI dává pozitivní reakce při nepřímé aglutinaci s anti-D činidlem používaným pro IAT typizaci. Přesto jsme nezjistili žádný případ anti-D u matek s DVI. Přestože je varianta DVI považována za klinicky nejvýznamnější parciální variantu D u bělochů , postižené ženy v naší studii patřily do kategorií DVa a DNB. Navíc výzkum provedený na dárcích krve ze stejné geografické oblasti nezjistil žádné nositele parciální DVI kategorie . DNB je známá jako nejrozšířenější parciální varianta D v sousedních regionech střední Evropy . V našem případě jediný nositel DNB pocházel ze sousední geografické oblasti Bosny a Hercegoviny, zatímco oba nositelé DVa pocházeli ze zkoumané oblasti Splitsko-dalmatské župy. Z toho vyplývá nutnost zohlednit geografickou variabilitu výskytu variant D při zavádění standardů typizace RhD a imunoprofylaxe.

Žádné případy tvorby anti-D u žen, kterým byl původně přisouzen status RhD+ nebo Du, nebyly při genotypizaci zaznamenaných aloimunizovaných případů přisouzeny slabým typům D. To se očekávalo, protože nejčastějšími slabými variantami D rozšířenými v Chorvatsku jsou slabý D typ 3, typ 1 a typ 2, zatímco ve středomořské části Chorvatska, v níž byla studie provedena, je nejčastější slabý D typ 1, následovaný typem 3 a 2 . Oproti zjištěním autorů v nekavkazské populaci, kde jsou časté slabé typy D náchylné k tvorbě anti-D, lze předpokládat, že nositelé slabých typů D v naší porodnické populaci nevyžadují imunoprofylaxi . Protože však v dříve publikované studii na chorvatské populaci byl zjištěn výskyt slabého D typu 4.2, který je známý tvorbou anti-D, ve středomořské části Chorvatska, je nutná opatrnost. Navíc ve studii Hylanda a kol. na RhD těhotných ženách byly mezi aloimunizovanými ženami nalezeny nositelky D varianty. Některé částečné D RBC nereagují s anti-D ani s IAT . V naší studii se genotypizace u aloimunizovaných RhD- žen neprováděla, proto mohli být někteří jedinci s variantou D a anti-D našimi tehdy používanými sérologickými technikami přehlédnuti.

Podobně jako u zjištění většiny ostatních autorů vedla imunizace anti-D u žen s částečným D většinou k sérologickým markerům HDFN, ale bez závažných klinických následků . Je zajímavé, že v naší studii žena s nejvyšším titrem anti-D ze všech 3 žen porodila děti, jejichž DAT byl pouze 1+, zatímco děti ženy s nižším titrem byly sérologicky výrazněji postižené, s DAT 4+. Faktory zahrnující závažnost HDFN jsou stále předmětem potenciálního výzkumu . Přestože většina případů HDFN u matek s částečným D je mírná, byl zaznamenán i fatální průběh .

Ačkoli je tvorba anti-D u žen bez RhD extrémně vzácná, prokázané imunizační příhody potvrzují, že je důležité správně identifikovat nosičky částečného D, které je třeba považovat za RhD- s ohledem na transfuzní terapii a imunoprofylaxi. Nedávný výzkum z USA zjistil, že provádění genotypizace RHD u těhotných žen se sérologicky slabým fenotypem D je nákladově neutrální strategie, přičemž úspora nákladů se pravděpodobně časem mírně zvýší . Vedle nesporného významu genotypizace RHD při řešení rozporuplných výsledků RhD typizace a rozeznání D variant je nutné zdůraznit význam sérologické typizace, protože potřeba genotypizace nebude rozpoznána, pokud při prvotní sérologické typizaci nebudou rozpoznány D varianty a nositelkám D variant bude přiřazen RhD+. V naší studii nebyly všechny 3 těhotné ženy s anti-D původně rozpoznány jako D varianty vzhledem k silné reaktivitě jejich RBC s tehdy používanými monoklonálními činidly. Můžeme konstatovat, že volba reagencií pro sérologickou RhD typizaci má zásadní význam pro rozpoznání D variant a následně pro rozpoznání potřeby molekulární RhD typizace.

Nakonec jsme v této studii zjistili, že se nevyskytly případy RhD imunizace u těhotných žen, které byly původně typizovány jako D varianta, ale k imunizaci došlo u žen, které byly typizovány jako RhD+. Z toho vyplývá potřeba dalšího zkoumání za účelem vhodného výběru reagencií pro sérologickou typizaci RhD, které odhalí varianty D s rizikem aloimunizace anti-D v naší populaci.

Omezením této retrospektivní studie je dlouhé období sledování, změny v metodách a reagenciích, které byly použity během období studie, a také algoritmus testování. Mezi změny patří vynechání typizace RhD v IAT po roce 2008 a zavedení imunoprofylaxe u těhotných žen s parciálním antigenem D po roce 2008, zatímco před rokem 2008 se profylaxe ženám s jakoukoli variantou D nepodávala. Dalším omezením naší studie je skutečnost, že genotypizace nebyla provedena u aloimunizovaných žen s RhD.

I přes tato omezení považujeme za velmi důležité dlouhodobé sledování porodnické populace. To by nám umožnilo posoudit adekvátnost strategie sérologické typizace RhD antigenu a podávání imunoprofylaxe u těhotných žen s D variantou.

Poděkování

Autoři děkují Perovi Ercegovi-Maglicovi, Haniji Dadič-Jadričovi, Brance Skelin, Dejaně Bogdanič, Ivici Bradaričovi, Vedraně Burilovič a Nině Ipavec za sběr dat během výzkumu.

Etické předpoklady

Studie byla schválena etickou komisí Univerzitního nemocničního centra Split.

Prohlášení o zveřejnění informací

Autoři nezveřejňují žádný střet zájmů.

Kontakty autora

Article / Publication Details

Autorská práva / Dávkování léčiv / Zřeknutí se odpovědnosti

Autorská práva: Všechna práva vyhrazena. Žádná část této publikace nesmí být překládána do jiných jazyků, reprodukována nebo využívána v jakékoli formě nebo jakýmikoli prostředky, elektronickými nebo mechanickými, včetně fotokopírování, nahrávání, mikrokopírování nebo jakýmkoli systémem pro ukládání a vyhledávání informací, bez písemného souhlasu vydavatele.
Dávkování léčiv: Autoři a vydavatel vynaložili veškeré úsilí, aby výběr a dávkování léků uvedené v tomto textu byly v souladu s aktuálními doporučeními a praxí v době vydání. Vzhledem k probíhajícímu výzkumu, změnám ve vládních nařízeních a neustálému přísunu informací týkajících se farmakoterapie a lékových reakcí však čtenáře vyzýváme, aby si u každého léku zkontroloval příbalový leták, zda nedošlo ke změnám v indikacích a dávkování a k doplnění varování a bezpečnostních opatření. To je zvláště důležité, pokud je doporučovaným přípravkem nový a/nebo zřídka užívaný lék.
Vyjádření: Výroky, názory a údaje obsažené v této publikaci jsou výhradně výroky jednotlivých autorů a přispěvatelů, nikoliv vydavatelů a editorů. Výskyt reklamy a/nebo odkazů na produkty v publikaci neznamená záruku, podporu nebo schválení inzerovaných produktů nebo služeb ani jejich účinnosti, kvality nebo bezpečnosti. Vydavatel a redaktor(é) se zříkají odpovědnosti za jakoukoli újmu na zdraví osob nebo majetku, která by vznikla v důsledku myšlenek, metod, návodů nebo výrobků, na něž se v obsahu nebo inzerátech odkazuje

.