Alai

A brief history of T. reesei

Nejstarší biotechnologické postupy využívající houby k výrobě piva, vína a sýrů mohou sahat až do doby před několika tisíciletími, tj. k samému počátku gramotné civilizace. Naproti tomu k objevu vláknité mezofilní askomycety Trichoderma reesei (tehdy Trichoderma viride) pro její úžasný potenciál produkovat extracelulární celulázy došlo teprve před více než 70 lety. Zpočátku byl destruktivní potenciál původní Trichoderma sp. izolované z hnijícího vybavení americké armády na Šalamounových ostrovech během druhé světové války vnímán spíše jako problematický. Nicméně netrvalo dlouho a výzkumníci z armádních výzkumných laboratoří v Naticku pod vedením Mary Mandelsové a Elwyna T. Reese, který dal jméno výzkumníkovi, se snažili tento problematický potenciál proměnit v účelné produkty. Při screeningu 14 000 plísní z Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a prokázala vynikající schopnost rozkládat nativní krystalickou celulózu. Označení „QM6a“ pro poslední zbývající původní izolát Trichoderma, které jej identifikovalo jako šestou ze šesti kultur této houby uložených v Quartermaster Collection v Naticku, zůstalo. Tento konkrétní kmen je nejen považován za referenční kmen T. reesei, ale je také jediným kmenem, z něhož byly odvozeny všechny mutanty používané dnes v průmyslu.

Tenkrát i dnes byl výzkum T. reesei poháněn myšlenkou, že její vylučované celulázy by mohly mít převratný vliv na 200 let starý boj o ekonomickou výrobu paliv z obnovitelné lignocelulózové biomasy . Výzkum T. reesei byl od té doby průkopníkem koncepce enzymatické sacharizace celulózy pomocí synergické kombinace různých celulázových aktivit a položil základy pro naše současné chápání regulace zúčastněných enzymů . Její hlavní celobiohydroláza CBH1 (CEL7a) byla také první eukaryotickou celulázou, která byla klonována, a první celulázou, jejíž struktura byla vyřešena . Důležitým krokem k průmyslovému využití celuláz T. reesei byl vývoj účinných postupů mutageneze a screeningu kmenů v 70. letech 20. století. V následujících dvou desetiletích bylo možné zvýšit titr extracelulárního proteinu produkovaného původním kmenem QM6a až dvacetinásobně díky mutagenetickým programům v Naticku a na Rutgersově univerzitě. Ten vyvrcholil izolací kmene RUT-C30 (kde „RUT“ znamená Rutgers). Ačkoli se uvádí, že zlatý standard pro produkci celulázy v průmyslu je vyšší než 100 g/l, tento kmen je stále prototypem veřejně dostupného hyperproducenta celulázy s titry extracelulárního proteinu dosahujícími 30 g/l na celulázu indukujícím substrátu laktóze .

Nejprve však byly vyvinuty další komerční aplikace celulázy, protože se ukázalo, že účinná a úplná sacharizace lignocelulózové biomasy na zkvasitelné cukry vyžaduje mnohem více enzymatických aktivit, než se původně předpokládalo. Výzkum za účasti T. reesei opět pokračoval a dodnes pokračuje v objevování nových poznatků v enzymologii rozkladu celulózy i hemicelulózy . Vysokorychlostní mikroskopie atomárních sil nyní také zviditelnila rozklad celulózy a ukázala, jak hlavní celobiohydroláza CBH1/CEL7A klouže jednosměrně po povrchu celulózy . Počátkem 90. let 20. století byly k dispozici transformační techniky usnadňující genetické inženýrství T. reesei . Během následujícího desetiletí tyto technologie přispěly k získání nových poznatků o regulaci jejích enzymů a ke změně profilu enzymů vylučovaných touto houbou . V té době byla T. reesei také jedním z prvních hostitelů pro expresi savčích proteinů, čehož příkladem je exprese telecího chymosinu pod expresními signály cbh1 (cel7a) .

Koncem 90. let 20. století Kuhls a kol. zjistili, že Hypocrea jecorina je ve skutečnosti pohlavní forma T. reesei, což je důvod, proč řada následných publikací používá jako druhové jméno H. jecorina místo T. reesei. Podrobnější studium pohlavního vývoje vedlo k hypotéze, že kmen QM6a je ve skutečnosti samičí sterilní, což mohlo být následně spojeno s mutací v genu ham5 kódujícím MAP-kinázový scaffold .

Na přelomu tisíciletí, který lze pro genetiku chápat jako obrat od studia izolovaných genů a drah ke studiu celých genomů, nastala pro T. reesei tzv. genomová éra. Prvním globálním přístupem ke studiu genové exprese T. reesei byla v roce 2003 transkriptomická studie Foremana a spol. , kteří zkonstruovali DNA mikročipy založené na cDNA, které odpovídaly více než 5000 různým transkriptům genomu T. reesei. O pět let později položilo sekvenování genomu a analýza původního izolátu T. reesei QM6a základ pro široké uplatnění celogenomových studií. V následujících letech vedla srovnávací genomická analýza řady kmenů s hyperprodukcí celulázy a kmenů bez produkce celulázy k objevu potenciálních nových faktorů podílejících se na hyperprodukci celulázy, jako je nukleocytoplasmatický transport, vakuolární přenos proteinů a obrat mRNA . Tyto srovnávací analýzy těžily ze skutečnosti, že všechny kmeny T. reesei používané na akademické půdě a v průmyslu jsou odvozeny od kmene QM6a. Šedesát pět let po prvních studiích Elwyna Reeseho o degradaci celulózy pomocí T. reesei činí nyní celosvětová instalovaná kapacita výroby celulózových biopaliv 480,5 milionu litrů etanolu ročně (MMLY), z čehož 380,5 MMLY (neboli zhruba 80 %) se vyrábí pomocí enzymových preparátů T. reesei, jako jsou Accellerase a Cellic (obr. 1a). Toto úsilí bezpochyby vyžadovalo vyspělost základní technologie na několika úrovních, včetně procesního inženýrství a předúpravy substrátu. Přesto výroba a optimalizace enzymových preparátů pro krok sacharifikace biomasy byla a zůstává jedním z klíčových faktorů určujících nákladovou efektivitu procesů celulózového etanolu . Produkce enzymů pomocí T. reesei se navíc v žádném případě neomezuje pouze na výrobu enzymů pro biorafinerie. Ve skutečnosti se zhruba 11 % všech technických enzymových přípravků registrovaných Asociací výrobců a formulátorů enzymových přípravků vyrábí s použitím T. reesei jako expresního hostitele (obr. 1b, c). V neposlední řadě si T. reesei stále udržuje svůj význam ve výzkumu, čehož příkladem je více než 100 výzkumných článků zabývajících se touto houbou nebo jejími enzymy publikovaných každý rok (obr. 1d).

Mix enzymů biomasy T. reesei: nové poznatky a omezení

V přírodě je dekonstrukce lignocelulózy jen zřídka prováděna jediným organismem. Dochází k ní spíše postupným řazením a společným úsilím několika organismů, které produkují více sacharidově aktivních enzymů (CAZymů) k rozkladu různých polymerů. Proto není překvapivé, že směs vylučovaných celuláz T. reesei musela být výrazně upravena, aby poskytovala cenově konkurenceschopné složení enzymů pro kompletní sacharizaci lignocelulózy. Výzkumníci si brzy uvědomili, že preparáty T. reesei nemají dostatečnou β-glukosidázovou aktivitu, protože většina aktivity je vázána na buněčnou stěnu houby . V důsledku toho zvýšená aktivita β-glukosidasy zlepšila rozklad celulózy, protože působí proti inhibici produktu prostřednictvím celobiózy, která se zase uvolňuje kooperativním působením endoglukanasy a celobiohydrolasy . Tento mechanismus zpětné vazby jinak vážně zpomaluje sacharizaci celulózy. Stejně tak xylo- a mannooligosacharidy odvozené od hemicelulózy inhibují celobiohydrolasy T. reesei, což silně naznačuje, že k účinnému rozkladu lignocelulózy je zapotřebí dostatečná aktivita β-xylosidasy a β-mannosidasy. V roce 2003 Foreman et al. popsali dva proteiny, které jsou koindukovány s hlavními celulázami, a nazvali je celulózou indukovaný protein 1 a 2 (CIP1 a CIP2). Od té doby se ukázalo, že jsou důležité pro účinnou degradaci lignocelulózy . Nejnovější výsledky ukazují, že CIP1 má strukturní podobnost s lyasami, ačkoli lyasovou aktivitu se nepodařilo prokázat , a že CIP2 je glukuronoylesterasa z rodiny CE15 . Dalším důležitým vylučovaným proteinem je swollenin SWO1, který obsahuje modul vázající sacharidy (CBM) spojený s doménou podobnou expansinu . Navzdory aktivitě narušující celulózu , SWO1 synergicky zvyšuje aktivitu endoxylanázy spíše než endoglukanázy nebo celobiohydrolázy během enzymatické hydrolýzy předupravených kukuřičných stonků . Jedním z navrhovaných způsobů účinku je, že činí xylanovou část lignocelulózy přístupnější pro rozklad xylanázami, a tím nepřímo podporuje působení celuláz. Pravděpodobně největší revolucí v posledních letech v oblasti rozkladu celulózy byl objev lytických polysacharidových monooxygenáz (LPMO). Tyto enzymy zavedly nový, oxidační mechanismus rozkladu polysacharidů. Při rozkladu celulózy se předpokládá, že LPMO působí na povrch krystalických celulózových vláken, čímž je činí přístupnějšími pro celulázy . Zajímavé je, že tyto enzymy mohou získávat elektrony potřebné pro tento proces z ligninu rostlinných buněčných stěn prostřednictvím dálkového přenosu elektronů, čímž se obranné mechanismy rostliny obracejí proti nim . Alternativně mohou jako donory elektronů fungovat GMC oxidoreduktasy nebo celobiose dehydrogenasy . Toto zjištění by mohlo dobře vysvětlit, jak T. reesei pohání své LPMO, protože již dříve bylo prokázáno, že několik takových GMC oxidoreduktáz je skutečně indukováno pšeničnou slámou . Tento oxidační mechanismus se však v žádném případě neomezuje pouze na depolymerizaci celulózy. Původně byl prokázán pro chitin , LPMO hrají roli také při degradaci xyloglukanu a amylózy . V databázi CAZy byly enzymy patřící do této skupiny překlasifikovány na „pomocné aktivity“ (AA) na rozdíl od jejich předchozí klasifikace jako glykosidové hydrolázy (např. GH61) a nacházejí se v rodinách AA 9-11 a 13 . Jak již bylo nastíněno dříve, hemicelulolytické aktivity jsou důležité pro úplnou sacharizaci lignocelulózy (přehled Harris et al. ). V závislosti na typech hemicelulózy přítomných v substrátu jsou zapotřebí různá množství jednotlivých aktivit . Je proto pozoruhodné, že enzymatický repertoár T. reesei má pro určité typy hemicelulosových specifických vazeb určitá jasná omezení. Jednou z takových chybějících aktivit je α-xylosidasa. Přidání α-xylosidasy do komerčního enzymového přípravku T. reesei zvýšilo uvolňování xylosy a glukosy z předupravených kukuřičných stonků . Podobně přídavek celulázy rodiny GH 5 s aktivitou proti glukomannanu a xylanu výrazně zlepšil syntetický enzymový přípravek T. reesei . Mezi další aktivity, které ve směsi celuláz T. reesei chybí nebo jsou velmi omezené, patří endo-arabináza a několik pektinázových aktivit . Doplnění komerčních celulasových směsí o tyto enzymové aktivity následně zlepšilo sacharizaci různých substrátů . Další dosud nezodpovězenou otázkou je funkce in vivo vylučovaných laktázám podobných multikoperoxidáz kódovaných v genomu T. reesei .

Zlepšení T. reesei jako hostitele pro produkci proteinů

Vzhledem k tomu, že celulázy a většina ostatních enzymů rozkládajících lignocelulózu jsou koordinovaně a podmíněně exprimovány , představuje jejich transkripční regulace logický inženýrský cíl pro zlepšení produkce celuláz touto houbou. Jedním z hlavních regulátorů je transkripční faktor CRE1 typu C2H2, který zprostředkovává katabolitovou represi uhlíku. CRE1 vypíná transkripci svých cílových genů, když jsou přítomny příznivější zdroje uhlíku, jako je glukóza. Jeho zkrácení je jednou z hlavních příčin lepší produkce celulázy dosažené programy náhodné mutageneze T. reesei QM6a vedoucí ke vzniku kmene RUT-C30, který vykazuje vyšší bazální i indukovanou úroveň produkce celulázy . Podobně nahrazení vazebných motivů CRE1 v promotorové oblasti hlavní celobiohydrolázy cel7a motivy známého aktivátoru celulázy snižuje represi katabolitu uhlíku a zvyšuje transkripci cel7a za aktivačních i represivních podmínek . Kromě toho transkripce celulázy, xylanázy a řady dalších genů kódujících enzymy zapojené do rozkladu lignocelulózy striktně závisí na transkripčním aktivátoru typu Zn(II)2Cys6 XYR1 . To je na rozdíl od jiných hub včetně Sordariomycetes Neurospora crassa a Fusarium fujikuroi, kde ortolog XYR1 výhradně moduluje expresi genů xylanázy . Bylo zjištěno, že mutace vedoucí ke zkrácené formě XYR1 způsobuje celuláza-negativní fenotyp kmene QM9136, který pochází z programu mutageneze v Naticku . V souladu s tím mají mutanti s nadprodukcí a hyperprodukcí celulázy zvýšené hladiny mRNA pro transkripční aktivátory xyr1 . Bylo také prokázáno, že nadměrná exprese XYR1 vede k vyšší expresi celuláz a ruší jejich katabolitní represi v přítomnosti glukózy . Bodová mutace v domnělé regulační oblasti XYR1 navíc vede k podobně deregulované expresi . Kromě XYR1 a CRE1 regulují expresi celuláz a xylanáz u T. reesei tři transkripční faktory ACE1, ACE2 a ACE3 . Podobně jako CRE1 je ACE1 represorem zinkového prstu C2H2 a jeho delece proto zlepšuje produkci celuláz i xylanáz . ACE2 a ACE3 jsou stejně jako XYR1 transkripční aktivátory typu Zn(II)2Cys6 . Když ace2 chybí, transkripce celuláz a xylanáz je odpovídajícím způsobem snížena, ačkoli indukce celuláz soforosou zřejmě zůstává neovlivněna . Delece ace3 zcela zruší transkripci celuláz, ale pouze sníží transkripci xylanáz. Zatímco nadměrná exprese ACE2 zatím nebyla vyzkoušena, nadměrná exprese ACE3 vede ke zvýšení aktivity obou typů enzymů, stejně jako nadměrná exprese šesti dalších dosud necharakterizovaných regulátorů . Patří mezi ně další dva transkripční faktory typu Zn(II)2Cys6 a také dva proteiny WD40, protein s bromodoménou a acetyltransferáza příbuzná gcn5. Všechny tři transkripční aktivátory typu Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 a ACE3) se podobají dobře charakterizovanému proteinu Gal4 ze S. cerevisiae. Je dobře známo, že Gal4 rekrutuje komplex SAGA obsahující Gcn5, a tím podporuje transkripci svých cílových genů prostřednictvím acetylace histonů a tvorby euchromatinu. Ve skutečnosti je ortolog Gcn5 T. reesei nepostradatelný pro expresi celulázy a podílí se na acetylaci histonů v promotoru cbh1 . V posledních letech se objevil obraz, který ukazuje, že transkripce celuláz a příbuzných CAZymů u hub je řízena kombinací mnoha transkripčních faktorů představujících složitou transkripčně-regulační síť ovlivňovanou protichůdnými aktivátory a represory. Například u Penicillium oxalicum moduluje aktivaci nebo represi celulázových genů dvacet transkripčních faktorů. Mezi nimi byl ClrB identifikován jako klíčový integrátor všech ostatních regulátorů s jejich cílovými geny . Homologové těchto regulátorů se nacházejí u T. reesei, ale vzhledem k rozmanitosti adaptací v regulaci buněčné stěny rostlin , se očekává, že významnou roli budou hrát i jiné a odlišné regulátory. Dalším klíčovým hráčem v regulaci celulázy je T. reesei ortolog záhadného Aspergillus LaeA, který se podílí na regulaci genových klastrů sekundárních metabolitů u různých hub . Zatímco delece této předpokládané proteinové metyltransferázy vede k silné downregulaci různých celulázových a dalších CAZyme genů, její overexprese může silně podpořit jejich expresi . Podobné účinky byly zjištěny i u proteinu VEL1 interagujícího s LAE1 komplexu VELVET .

Většina výše uvedených studií poskytuje zásadní poznatky o regulaci tvorby celulázy. Vzhledem k tomu, že většina těchto studií byla provedena buď na původním izolátu T. reesei QM6a, nebo na mírně nadprodukčním kmeni QM9414, zůstává nejasné, zda a do jaké míry se tyto účinky mohou uplatnit u hyperprodukčních kmenů. U těchto kmenů by procesy jako translace, sekrece a obrat vylučovaných enzymů, spíše než transkripce, mohly omezit další zvýšení produkce celulázy. Bude zajímavé zjistit, zda několik z uváděných způsobů, jak zlepšit expresi genů celulázy, lze naskládat na sebe a jak by si takové kmeny vedly ve srovnání s hyperproducenty získanými náhodnou mutagenezí.

Prosté zvýšení transkripce zájmového genu nemusí vždy vést ke zlepšení tvorby produktu, zejména v případě nehoubových proteinů. Jednou z úspěšných strategií, jak obejít nízkou tvorbu produktu, je přístup fúzního genu, který využívá kromě promotoru a terminátorové oblasti vysoce exprimovaného genu také kódovaný protein jako zesilovač exprese. V případě T. reesei se jedná o celobiohydrolázu kódující cel7A, která je nejsilněji exprimovaným proteinem za podmínek indukce celulázy . Předpokládá se, že tyto genové fúze obecně zvyšují stabilitu mRNA, import do ER a průchod sekreční cestou. Za tímto účelem se často využívá modulární struktura CEL7A sestávající z katalytického modulu, linkeru a CBM, čímž se C-terminální CBM nahrazuje zájmovým genem. V současné době jsou k dispozici varianty tohoto přístupu fúze genů, které cílí protein do ER pro správné skládání, tvorbu disulfidových můstků a glykosylaci, ale následně se zaměřují na intracelulární akumulaci proteinu, aby se zabránilo degradaci požadovaného produktu extracelulárními proteázami. Jedna taková strategie využívá hydrofobiny s připojeným retenčním signálem ER jako nosiče. Tyto fúzní proteiny se samy shromažďují do struktur podobných micelám a lze je purifikovat pomocí vodného dvoufázového systému na bázi povrchově aktivních látek . Další strategie cílení proteinů do ER využívá peptid γ-zein (ZERA) odvozený od zásobního proteinu kukuřice. Analogicky tyto samouspořádávající se fúzní proteiny tvoří proteinová tělíska obklopená membránou ER, která je chrání před proteolýzou . Vývoj hub jako účinných hostitelů pro produkci savčích proteinů rovněž vyžaduje inaktivaci často se vyskytujících proteáz ve fermentačním bujónu. V systematické studii byly identifikovány různé vylučované proteázy související s degradací biofarmak včetně protilátek, interferonu α 2b a inzulinu podobného růstového faktoru a několik z nich bylo inaktivováno . To vedlo nejen k drastickému snížení proteázové aktivity, ale také k výraznému zvýšení stability všech tří rekombinantních proteinů, přičemž u protilátek byl účinek nejvýraznější. Ačkoli se o inženýrství N-glykosylačního vzorce pro výrobu vysoce hodnotných terapeutických proteinů pokoušeli již dříve, vytvoření autentického lidského glykosylačního vzorce v houbovém expresním hostiteli se v současné době nezdá být proveditelné. Je proto otázkou, zda se taková biofarmaka budou v budoucnu vyrábět v houbových buněčných továrnách, zejména vzhledem k rychlému rozvoji CHO buněk .

Výše uvedené hydrofobiny jsou další skupinou proteinů, kterým byla věnována značná pozornost díky jejich povrchově aktivním vlastnostem . Tyto malé extracelulární proteiny se díky svým amfifilním vlastnostem samy shromažďují do proteinových vrstev na hydrofobních/hydrofilních rozhraních a činí hydrofobní povrchy smáčivými nebo hydrofilní povrchy hydrofobními. Mají široký potenciál v potravinářských a lékařských aplikacích k dispergaci hydrofobních materiálů, stabilizaci pěn nebo cílení různých molekul na povrchy . Cerato-plataniny jsou další skupinou malých vylučovaných proteinů se čtyřmi konzervovanými cysteiny. Vážou se na chitin a N-acetylglukosaminové oligosacharidy a mají samoskladné vlastnosti na hydrofobních/hydrofilních rozhraních. Na rozdíl od hydrofobinů cerato-plataniny spíše zvyšují polaritu/apolaritu povrchů . CBM přítomným v různých CAZymech se také přisuzuje cílená funkce. Mohou zlepšit hydrolytickou aktivitu katalytické domény, ke které jsou připojeny, a vést k příznivějšímu pH a teplotnímu optimu . Jejich sacharidové vazebné vlastnosti lze dále využít pro afinitní purifikaci fúzních proteinů např. pomocí celulózových kolonek . Široká škála dalších aplikací rekombinantních CBM byla nedávno přezkoumána na jiném místě .

Trichoderma reesei pro konsolidovaný bioprocesing a celobuněčnou katalýzu

Konsolidovaný bioprocesing (CBP) je klasicky chápán jako integrace výroby celulolytického enzymu, enzymatické hydrolýzy a fermentačních kroků procesu výroby celulózového ethanolu do jedné jednotkové operace. Proto by byl žádoucí jediný organismus s dobrými celulolytickými vlastnostmi a účinnou cestou fermentace ethanolu. Nicméně využití mikrobiálních konsorcií byla také věnována určitá pozornost . Bohužel v současné době není k dispozici jediný organismus, který by splňoval oba požadavky (obr. 2). V důsledku toho byly podniknuty snahy o inženýrské úpravy ethanologenů na celulolytické nebo celulolytických organismů na ethanologenické. V rámci prvního scénáře T. reesei často sloužil jako dárce genů CAZyme, zejména pro cel5a a cel7b kódující dvě z jeho endoglukanas a pro jeho dvě celobiohydrolasy cel6a a cel7a (tab. 1). Ve všech publikovaných studiích omezovala relativně nízká sekreční kapacita S. cerevisiae přeměnu substrátu pomocí sekretovaných nebo v membráně ukotvených heterologních CAZymů. Proto vysoké výtěžky ethanolu s reálnými celulózovými substráty vyžadovaly doplnění komerčními koktejly enzymů T. reesei. Nicméně zatímco nyní probíhají snahy o zlepšení schopnosti sekrece a povrchového zobrazení upravených kmenů S. cerevisiae , v současné době dostupné kmeny zobrazující celulázu již mají potenciál vést k podstatnému snížení potřebných dávek enzymů pro sacharizaci biomasy. V souvislosti s druhým scénářem představuje slibný cílový organismus samotná T. reesei. Ačkoli však tato houba přirozeně disponuje schopností metabolizovat všechny cukry související s biomasou a přeměňovat je na ethanol, výtěžky jsou nízké a jako nežádoucí vedlejší produkt vzniká kyselina octová . Na druhou stranu, fermentační režimy pro T. reesei ve velkém měřítku jsou dobře zavedeny díky jejímu širokému využití v komerční výrobě enzymů a molekulární nástroje pro její genetické inženýrství jsou také velmi dobře vyvinuty . Jednou ze zbývajících velkých výzev pro využití T. reesei jako organismu CBP je, že několik jeho celuláz a glykolytických genů je potlačeno hypoxií , která je nezbytná pro výrobu ethanolu. Navíc transkripční represe celuláz v přítomnosti ethanolu představuje další výzvu, kterou je třeba překonat. Kmen RUT-C30 s hyperprodukcí celulázy však vykazuje vyšší toleranci k ethanolu ve srovnání s kmenem QM9414 z linie Natick , a proto představuje ideální platformový kmen pro vývoj T. reesei jako organismu CBP, zejména proto, že je rovněž derepresován katabolity uhlíku. Kromě toho v přítomnosti lignocelulózové buničiny vykazuje RUT-C30 v raných fázích fermentace morfologii podobnou peletám , které lze dosáhnout nezávisle na růstu přidáním povrchově aktivní látky Triton X-100, a pak také vede k vyšší produkci enzymů . To je důležité, protože špatná mísitelnost a nízká maximální hustota buněk v důsledku vláknitého růstu dosud bránily použití T. reesei jako organismu CBP. Obecněji řečeno, konsolidované bioprocesy lze použít také k popisu jiných integrovaných procesů, v nichž substrátem nemusí být nutně lignocelulózová biomasa, ale jiný biopolymer, například chitin nebo škrob, a produktem není ethanol, ale jakýkoli jiný metabolit . Za tímto účelem byla v poslední době provedena řada studií zaměřených na nadprodukci různých metabolitů pomocí inženýrství T. reesei (tabulka 2). Výtěžky, kterých se podařilo dosáhnout, však byly ve většině případů daleko od komercializace, a proto vyžadovaly další optimalizaci.

Nástroje pro buněčný design a inženýrství

Když byly teprve nedávno podány dva obsáhlé přehledy molekulárních nástrojů T. reesei a dalších druhů Trichoderma , chceme je aktualizovat o nejnovější pokroky v této oblasti. Cílené kmenové inženýrství směřující ke zlepšení produkce celulázy nebo k metabolickému inženýrství vyžaduje účinné metody zavádění cílených genetických změn do organismu. Obecně nízká účinnost cílení genů byla po dlouhou dobu hlavní výzvou k získání rozumného počtu transformantů homologní integrací deleční nebo expresní kazety. Tento problém byl řešen především inaktivací složek nehomologního spojování konců DNA (NHEJ), jako je tku70 nebo tmus53 . Kmeny s odstraněným tku70 vykazují lepší cílení genů, ačkoli účinnost homologní integrace se u těchto kmenů může stále lišit v závislosti na cíleném lokusu, a může tak klesnout až na 30 % . Na základě tohoto zlepšení byla vyvinuta řada nových přístupů k vkládání expresních kazet do definované genomové oblasti, čímž se zamezí pleiotropním účinkům způsobeným jejich náhodnou integrací. Na pozadí tku70 Jorgensen a kol. vyvinuli expresní platformu, která využívá snadno prověřitelný lokus ade2 jako preferované místo integrace. Po integraci expresní kazety do tohoto lokusu se ade2 zničí a výslední transformanti vyvinou výraznou červenou pigmentaci. V další studii byly vybrány lokusy pyr4 a asl1 pro vývoj kmene s uridinovou a l-argininovou auxotrofií, který umožňuje integraci v těchto místech . Ouaedraogo et al. použili jinou strategii a exprimovali meganukleázu I-SceI S. cerevisiae v T. reesei. I-SceI vytváří umělé dvouřetězcové zlomy v rozpoznávacím místě I-SceI, které bylo předem zavedeno v předem definovaném lokusu a zlepšilo účinnost transformace i homologní integrace. V následné studii byly dvouřetězcové zlomy zprostředkované I-SceI kombinovány s delecí tku70 . Zde neschopnost opravit dvouřetězcové zlomy prostřednictvím NHEJ podporuje integraci kazety, což vede k účinnosti homologní rekombinace až 100 %. Revoluci pro genetické inženýrství neboli editaci genomu přinesl systém CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 . Na důkaz potřeby takové technologie i rostoucího významu jako producenta enzymů byl tento systém poprvé testován pro vláknité houby T. reesei . Zavádí specifické dvouřetězcové zlomy DNA, které stimulují cílení genů, a závisí pouze na nukleáze Cas9 (spojené s CRISPR), která k cílení využívá jedinou chimérickou vodicí RNA. Přesného zacílení této vodicí RNA Cas9 na specifickou sekvenci DNA je dosaženo pomocí protospacerové sekvence vodicí RNA prostřednictvím jednoduchého párování bází. Při použití 200 bp up- a downstream doprovodných oblastí pro konstrukt s delecí genu bylo možné dosáhnout HR frekvence vyšší než 90 %. Po jednom kole transformace se vyskytly dvojité delece s frekvencí 45 % a trojité delece s frekvencí 4 %. Zatímco v této studii byly in vitro transkribované vodicí RNA kotransformovány s deleční kazetou do T. reesei exprimující Cas9, Nødvig a kol. použili dvě doprovodné ribozymové sekvence k uvolnění vodicích RNA z většího transkriptu, který rovněž kóduje enzym Cas9 v různých Aspergilli. Dalším nezbytným nástrojem potřebným pro expresi rekombinantních proteinů i kmenové inženýrství jsou promotory, které umožňují řízenou expresi genů. Ačkoli je k dispozici řada indukovatelných a represivních promotorů s různými promotorovými oblastmi celulázy, mají obvykle nevýhody, protože jejich exprese je vázána na metabolismus hostitele a aktivátory mohou být limitující v důsledku titračního efektu promotoru. Mezi užitečné alternativy patří soubor l-methionin represibilních genů T. reesei s různou silou základní exprese . Bylo prokázáno, že jeden z těchto promotorů může řídit represivní expresi různých reportérových genů na několika zdrojích uhlíku včetně pšeničné slámy. V podobné studii byl promotor genu pro permeázu mědi T. reesei použit k řízení exprese hlavního regulátoru celulázy a hemicelulázy xyr1 v nepřítomnosti mědi . Avšak vzhledem k tomu, že enzymy obsahující měď z rodiny AA 9 jsou důležitými složkami celulázové směsi T. reesei , je však sporné, zda lze tento systém použít ve scénáři výroby celulázy.

Kromě těchto zajímavých molekulárních nástrojů jsou nyní k dispozici i některé starší triky z klasické genetiky. Vývoji kmenů T. reesei dlouho bránila skutečnost, že houba byla považována za nepohlavní, což bránilo křížení kmenů. Milníkem v tomto ohledu bylo zjištění, že QM6a má lokus párovacího typu MAT1-2 a může být snadno křížen s některými izoláty T. reesei divokého typu MAT1-1 . Když však byl lokus MAT1-2 kmene QM6a nahrazen jeho protějškem MAT1-1, při konfrontaci s původním MAT1-2 kmenem QM6a se nevytvořila žádná stromata. V důsledku toho nebylo možné využít páření pro kmenové inženýrství u různých akademických a průmyslových kmenů T. reesei odvozených z QM6a. Pomocí systémově biologického přístupu byl chybějící gen zodpovědný za samičí sterilitu identifikován jako ham5 . U N. crassa kóduje ham-5 protein, který slouží jako lešení MAP kinázy během buněčné fúze . Opětovné zavedení funkčního ham5 obnovuje tvorbu stromatu u kmene QM6a a umožňuje obnovení samičí plodnosti u jiných kmenů pocházejících z pozadí QM6a . Toto zjištění je obzvláště důležité, protože křížení s výše uvedenými izoláty H. jecorina může vést k segmentálně aneuploidním potomkům . S tímto nástrojem v ruce je položen základ pro identifikaci relevantních mutací vedoucích např. k hyperprodukci celulázy. To je důležité, protože tradiční komplementační přístupy k identifikaci genů způsobujících mutantní fenotypy byly u druhů, jako je T. reesei, většinou neúspěšné. A přestože vysoce výkonné sekvenování a srovnávací analýza genomu mohou snadno identifikovat mutace v linii kmene QM6a hyper- a nullproducentů celulázy, pouze v několika případech to již vedlo k propojení mutace s konkrétním fenotypem . V případech, kdy byl nalezen vysoký počet mutací nebo mutace postihovaly geny s neznámou funkcí, však srovnávací sekvenční analýza neodhalila povahu požadovaných cílových genů . Několik výzkumníků proto úspěšně použilo k identifikaci příslušných mutací hromadnou segregační analýzu v kombinaci se sekvenováním nové generace . Při tomto přístupu se mutant zkříží s referenčním kmenem a genomová DNA segregantů vykazujících hledaný fenotyp se spojí a sekvenuje. Srovnání genomu tohoto souboru sekvenované DNA s genomy rodičovských kmenů pak může odhalit konzervované mutace relevantní pro daný fenotyp. Mutace, které s fenotypem nesouvisejí, budou zastoupeny nedostatečně. Ačkoli nelze očekávat, že tento přístup povede k identifikaci jediné mutace, protože mutace blízké příslušné mutaci se obvykle vyskytují společně, počet cílů pro další zkoumání se tím výrazně sníží.

.