8.3 Chemické zkoušky
Vizualizace složek PHG na TLC deskách je možná pomocí obecných činidel pro fenoly; chlorid železitý, vanilin a kyselina chlorovodíková (dávají řadu růžových barev s deriváty resorcinolu nebo floroglucinolu) nebo pomocí specifičtějších zkoušek s 2,4-dinitrofenylhydrazinem (detekuje aldehydy). Folin-Ciocalteuovo činidlo je rovněž užitečné pro detekci fenolů s katecholovým nebo hyrochinonovým jádrem (modré skvrny se objeví ihned po postříkání TLC desky) nebo pro ostatní fenoly, které vykazují modré až šedé skvrny, když se deska vykouří parami amoniaku. Gibbsovo činidlo (2 % 2,6-dichlorchinon-chloroimid v chloroformu) s následným vykouřením desky 2M NH4OH dává různé barvy (např. je schopno rozlišit kyselinu vanilovou – růžová barva – a kyselinu isovanilovou – modrá). Deriváty kyseliny skořicové poskytují charakteristickou světle modrou fluorescenci při zkoumání pod UV zářením (366 nm). Cis a trans izomery kyselin skořicových jsou prezentovány na TLC deskách, když je extrakt chromatografován ve vodných rozpouštědlech ve dvou směrech (2D-TLC). Často se používají spektrofotometrické metody pro stanovení obsahu fenolů, např. metoda s Arnowovým činidlem nebo již zmíněné Folin-Ciocalteuovo činidlo .
Některé kvalitativní testy indikují kumariny v rostlinných extraktech, např, test laktonového kruhu (kumariny hydrolyzované zředěnou zásadou tvoří žlutý roztok solí kyseliny O-kumarové, který lze zvrátit po okyselení nebo nasycení CO2); nebo Azo-spojovací test (červené zbarvení vzniká v důsledku reakce s diazotací kyseliny sulfanilové v alkalickém roztoku). Kumariny se snadno detekují v UV světle (365 nm), protože dávají charakteristickou barevnou fluorescenci (kromě jednoduchého nesubstituovaného kumarinu, který nemá fluorescenci). Detekují se podle modré, fialové, hnědé, zelené nebo žluté barvy. Barvu může zesílit 10% roztok KOH v methanolu nebo 20% roztok chloridu antimonitého v chloroformu. Hydroxykumariny nevykazují bathochromní spektrální posuny v alkalickém roztoku . Při HPLC analýze s detekcí pomocí diodového pole umožňují různá UV spektra kumarinů rychlou identifikaci sloučenin .
Kumariny reagují v alkalických roztocích za vzniku O-hydroxy-β-diketonů bez regenerace γ-pyronového kruhu a také barevných sloučenin s koncentrovanou kyselinou a koncentrovanou zásadou. Chromony jsou také viditelné v UV světle (modrá, žlutá, zelenožlutá, hnědá fluorescence při 365 nm).
Přítomnost aktivního fenylového kruhu (chromoforu) ve flavonoidech usnadňuje jejich detekci v UV světle. Jejich UV spektra jsou obzvláště informativní a poskytují strukturní informace, které mohou rozlišit typ fenolu a oxidační vzorec. Možné jsou různé chemické reakce pomocí nástřiku TLC chromatogramů; např. vizualizace v přítomnosti par amoniaku (chalkony a aurony se zbarví do oranžova, resp. do červena) nebo nástřik Naturstoff Reagenz A (1% roztok esteru 2-aminoethanolu a kyseliny difenylborité) a přestříkání 5% methanolovým roztokem polyethylenglykolu 4000 (PEG 4000), což zvyšuje citlivost této reakce. Po derivatizaci bylo možné sloučeniny pozorovat v UV světle (fluorescence od světle žluté po zelenou). Další testy zahrnují postřik chloridem železitým, diazotovanou kyselinou sulfanilovou (obě reakce jsou reakcí na fenoly) a specifickou reakci; kyanidin s hořčíkovým práškem v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové (indikuje přítomnost flavanonů a dihydroflavanolů) . Pro kvantitativní kolorimetrické stanovení flavonoidů se používá reakce s chloridem hlinitým (AlCl3) (absorbance se měří při 425 nm). Flavonoidy rozpuštěné v alkalických roztocích dávají intenzivní žluté zbarvení, které po přidání kyseliny klesá. UV spektra flavonoidních sloučenin vykazují dva hlavní pásy (maxima absorbance): pás I při vyšší vlnové délce (připisovaný skořicové části flavonoidní struktury) a pás II při nižší vlnové délce (způsobený benzoilovou částí). Pás I je obvykle při 304-350 nm pro flavony (H na C-3 v kruhu C), při 352-385 nm pro flavonoly (OH skupina na C-3) a při 328-357 nm pro 3-substituované flavonoly (O-substituce na C-3). Pás II pro většinu struktur je při cca 250-280 nm. Další fenolová skupina (-OH) v kruhu A způsobuje bathochromní posun (posun k delším vlnovým délkám) v pásu II a další -OH skupina v kruhu B vytváří podobný efekt v pásu I .
Většina antrachinonů nebo jejich glykosidů tvoří žluté nebo oranžově červené krystaly a může vykazovat fluorescenci závislou na pH . Hlavní barevnou reakcí je Bornträgerův test, který se provádí rozpuštěním chinonu v alkalickém vodném prostředí. Barevná reakce se pohybuje od oranžově červené po purpurově fialovou (v závislosti na struktuře a substituentech chinonu). Antrachinony dávají touto reakcí červenou barvu. Pro 1,8-dihydrochinony se rovněž používá reakce s octanem hořečnatým. Antrachinony lze detekovat na TLC deskách po postřiku 10% methanolickým roztokem KOH. Původní žluté nebo žlutohnědé barvy se mění na červenou, fialovou, zelenou nebo fialovou . Prášek rebarbory lze zkoumat v UV světle, aby se zjistila přítomnost raponthicinu (stilbenoidní glykosid, který je toxický). U původní rebarbory (Rheum palmatum) se objevuje červenohnědá fluorescence, ale nejsou vidět žádné zářivé modrofialové skvrny (jako v případě rebarbory rhapontické – Rheum rhaponticum).
Jak již bylo zmíněno, saponiny jsou povrchově aktivní sloučeniny (mění povrchové napětí) a mají emulgační vlastnosti. Pro rychlou kvalitativní kontrolu, zda rostlina obsahuje SPG, se běžně používá test pěnění protřepáním rostlinného materiálu s vodou. Saponiny mají membránové permeabilizační vlastnosti. Nízké koncentrace saponinů jsou schopny ničit membrány erytrocytů (mohou vysrážet cholesterol, který existuje v membránách červených krvinek), což způsobuje hemolýzu krve in vitro. Tato schopnost vedla k rozšířenému používání hemolýzy (hemolytický index-IH) jako metody pro stanovení biologické aktivity. IH je definován jako množství 2% izotonické suspenze hovězí krve (v ml), které podléhá hemolýze při působení 1 g testovaného rostlinného materiálu (nebo testovaného extraktu). Jako referenční látka byla použita směs saponinů Gypsophila paniculata (IH=30 000) nebo Saponin Album (Merck) (IH=15 000). Jak popsali Hostettmann a Marston , hemolytická aktivita saponosidů se značně liší podle struktury glykosidové části. Monodesmosidické saponiny (kromě acylglykosidů a glycyrrhizinu) jsou silně hemolytické. Žádná barevná reakce není pro SPG zvláště specifická. Je však k dispozici Liebermanova reakce (s acetanhydridem v přítomnosti kyseliny sírové), kde se barvy liší v závislosti na typu aglykonu (triterpen-růžová až červená -nebo steroid-modrozelená) .
Chemické reakce k identifikaci CRG v rostlinném materiálu mohou být způsobeny aglykony nebo cukry. Liebermannův a Salkoviskiho test indikuje steroidní část, není tedy specifický pro CRG. Keller Kilianiho a Xanthidrole test, oba indikují deoxy-cukry (digitoxosu nebo cymarosu). Keddeho nebo Baljetova reakce je specifičtější, protože je vázána na přítomnost α,β-nenasyceného laktonového kruhu. Fluorescenční reakce CRG je také možná, např. hydroxylová skupina digoxinu na C-14 a C-16 eliminuje vodu s H2SO4 za vzniku dalších dvou dvojných vazeb. Výsledkem je konjugovaný systém (s dvojnou vazbou v laktonovém kruhu), díky němuž digoxin fluoreskuje v UV světle. Jensenova reakce (po postřiku kyselinou trichloroctovou v ethanolu) se používá k vizualizaci CRG na TLC chromatogramech .
Přímé měření celkového HCN kyselou hydrolýzou kyanogenních glykosidů přítomných v potravinách, jakož i rozkladem meziproduktů kyanohydrinů na HCN má tu výhodu, že je použitelné pro všechny typy vzorků, i když ne veškerý potenciální HCN kyanogenních glykosidů je pravděpodobně k dispozici in vivo. Vizualizace přítomnosti těchto sloučenin v rostlinách je možná na filtračním papíře impregnovaném činidly, jako je kyselina pikrová/karbonát sodný nebo benzidin/acetát vápenatý. Tato činidla jsou schopna vyvolat barevné reakce s HCN uvolněným z rozdrcených rostlinných tkání. Impregnovaný papír se vloží do zkumavky nad rozdrcený rostlinný materiál a nechá se inkubovat při 40 °C po dobu 2 h. Změna barvy ze žluté na červenohnědou indikuje enzymatické uvolňování HCN. Pikrátový papír není zcela specifický pro kyanogen (na tuto reakci reagují také těkavé isothiokyanáty z druhů rodu Brassica). Proto se používá také jiný test, při kterém se používá směs (1:1) čerstvě připravených roztoků 1 % 4,4-tetramethyldiaminu difenylaminu v chloroformu (w/v) a 1 % ethylacetátu měďnatého v chloroformu (w/v). Barva reakce se změní ze slabě modrozelené na jasně zelenou. Další možná metoda vyžaduje destilaci rostlinného pletiva v kyselé vodě a titraci uvolněného HCN dusičnanem stříbrným. Chromatografické metody, jako je HPLC/MS nebo GC/MS trimethylsilylderivátů, jsou účinné pro analýzu jednotlivých kyanogenních glykosidů nebo kyanohydrinů a poskytují chemickou charakterizaci i kvantifikaci sloučenin .
Vzhledem k různorodosti produktů vznikajících v rostlinách z glukosinolátů (v závislosti na jejich aglykonové struktuře) může být odhad isothiokyanátů spektrofotometrickou metodou (kde barevné produkty 1,3-benzodithiol-2-tiony vznikají kondenzací isothiokyanátů s 1,2-benzen-dithiolem) nedostatečný pro stanovení obsahu glukosinolátů v rostlinách .
.