Virové kmeny
HCoV-229E (VR-740) a HCoV-OC43 (VR-1558) byly množeny v lidských diploidních plicních fibroblastech MRC-5 (CCL-171) a WI-38 (CCL-75), (všechny od ATCC, Manassas, VA). Obě lidské buněčné linie byly pěstovány v MEM doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutaminem, 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Infekční médium pro HCoV-229E a HCoV-OC43 se skládalo z MEM nebo RPMI-1640 plus 2 % tepelně inaktivovaného FBS. Virové kmeny byly množeny inokulací baněk obsahujících 24 hodin staré hostitelské buňky, které byly 80-90 % konfluentní. Po hodinové inkubaci byla buněčná monovrstva promyta a inkubována v čerstvém infekčním médiu po dobu tří nebo čtyř dnů při 35 °C pro HCoV-229E a při 33 °C pro HCoV-OC43. Supernatant obsahující pracovní virovou zásobu byl poté odebrán centrifugací (300 g po dobu 15 minut). Titr viru byl stanoven pomocí 50% infekční dávky tkáňové kultury TCID50 hodnocením cytopatických účinků (CPE), které byly hodnoceny v mikroskopu s jasným polem (10×) jako vakuolizace cytoplazmy, zaoblení buněk a odlupování.
Stolní aerosolová ozařovací komora
Jednoprůchodová dynamická aerosolová/virová ozařovací komora byla použita k vytvoření, ozáření a sběru aerosolových vzorků, jak bylo popsáno dříve23. Virové aerosoly byly generovány přidáním roztoku viru do vysoce výkonného rozprašovače pro rozšířenou aerosolovou respirační terapii (Westmed, Tucson, AZ) a provozovány pomocí vzduchového čerpadla se vstupním průtokem 11 l/min. Virus proudil do komory a byl smíchán se suchým a zvlhčeným vzduchem, aby se udržovala vlhkost mezi přibližně 50-70 %. Po celou dobu provozu byla sledována relativní vlhkost, teplota a distribuce velikosti aerosolových částic. Aerosol byl vystaven dalekému UV záření a nakonec shromážděn pomocí přístroje BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Daleká UV lampa byla umístěna přibližně 22 cm od komory s UV expozicí a byla namířena na plastové okno propouštějící UV záření o rozměrech 26 cm × 25,6 cm × 254 μm (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). V souladu s našimi předchozími experimenty používajícími tuto komoru23 byl průtok systémem 12,5 l/min. Objem oblasti vystavené UV záření byl 4,2 l, takže každý aerosol byl vystaven přibližně 20 sekund při průchodu oknem. Celá ozařovací komora byla umístěna ve skříni úrovně biologické bezpečnosti 2 a všechny vstupy a výstupy vzduchu byly vybaveny filtry HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA), aby se zabránilo vstupu nežádoucí kontaminace do systému nebo jejímu výstupu ze systému.
Výkon ozařovací komory
Vlastní ozařovací komora simulovala přenos aerosolových virů vzniklých prostřednictvím lidského kašle a dýchání. Komora pracovala při průměrné relativní vlhkosti 66 % a průměrné teplotě 24 °C ve všech bězích. Průměrná distribuce velikosti částic byla 83 % mezi 0,3 μm a 0,5 μm, 12 % mezi 0,5 μm a 0,7 μm a 5 % >0,7 μm (tabulka 3). Aerosolované viry byly účinně přenášeny systémem, jak je patrné z kontroly (nulová expozice) vykazující jasnou integraci virů (obr. 2 a 3, levý horní panel).
Lampa Far-UVC a dozimetrie
Zdrojem Far-UVC použitým v této studii byl modul 12 W 222 nm KrCl excimerové lampy vyrobený společností USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). Lampa je vybavena patentovaným optickým filtračním oknem, které snižuje emise lampy mimo emisní pík KrCl 222 nm. Lampa byla umístěna 22 cm od okna expoziční komory a namířena na střed okna. Měření optického výkonu se provádělo pomocí křemíkového fotodetektoru 818-UV/DB s nízkým výkonem a zesíleným UV zářením s optickým měřičem výkonu 843-R (Newport, Irvine, CA). Dozimetrie se prováděla před zahájením experimentu, aby se změřila fluence v komoře v místě aerosolu.
Vzdálenost mezi lampou a ozařovací komorou umožňovala jediné lampě rovnoměrně ozářit celou plochu expozičního okna. Měření pomocí křemíkového fotodetektoru ukázala expoziční intenzitu přibližně 90 μW/cm2 v celé expoziční ploše. Komora je vybavena odrazným hliníkovým povrchem naproti expozičnímu okénku. Stejně jako v naší předchozí práci s touto komorou23 byla odrazivost tohoto povrchu přibližně 15 %. Proto jsme konzervativně odhadli intenzitu na celé expoziční ploše na 100 μW/cm2. S lampou umístěnou 22 cm od okna a vzhledem k 20 sekundám potřebným k tomu, aby částice aerosolu prošla expozičním oknem, jsme vypočítali celkovou expoziční dávku pro částici na 2 mJ/cm2. Použili jsme další listy plastových oken propouštějících UV záření, abychom rovnoměrně snížili intenzitu v celé oblasti expozice a vytvořili různé podmínky expozice. Zatímco v naší předchozí práci s těmito fóliemi jsme naměřili propustnost blížící se 65 %23 , při těchto testech jsme naměřili propustnost 222 nm každé fólie přibližně 50 %. Tento pokles propustnosti je pravděpodobně způsoben fotodegradací plastu v průběhu času4. Přidání jednoho nebo dvou plátů plastu zakrývajících expoziční okénko snižuje expoziční dávku na 1, resp. 0,5 mJ/cm2.
Experimentální protokol
Jak již bylo popsáno23 , roztok viru v rozprašovači se skládal z 1 ml modifikovaného Eagleova média (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) obsahujícího 107-108 TCID50 koronaviru, 20 ml deionizované vody a 0,05 ml Hankova vyváženého solného roztoku s vápníkem a hořčíkem (HBSS++). Ozařovací komora byla provozována s aerosolovými částicemi viru proudícími komorou a obtokovým kanálem po dobu 5 minut před každým odběrem vzorků, aby se stanovila požadovaná hodnota relativní vlhkosti. Sběr vzorků byl zahájen změnou průtoku vzduchu z obtokového kanálu do přístroje BioSampler pomocí sady třícestných ventilů. Vzorkovač BioSampler byl zpočátku naplněn 20 ml HBSS++ pro zachycení aerosolu. Během každého odběru vzorků, který trval 30 minut, byl vnitřek ozařovací komory vystaven světlu 222 nm dalekého UVC, které procházelo plastovým okénkem. Variace dávky dalekého UV záření dodané částicím aerosolu bylo dosaženo vložením dalších UV-transparentních plastových fólií, jak je popsáno výše, čímž byly dodány tři zkušební dávky 0,5, 1,0 a 2,0 mJ/cm2. Kontrolní studie s nulovou dávkou byly provedeny s vypnutou excimerovou lampou. Po ukončení doby odběru vzorků byl roztok z přístroje BioSampler použit pro testy infekčnosti viru.
Testy infekčnosti viru
TCID50
K určení infekčnosti viru jsme použili test 50% infekční dávky tkáňové kultury28. Stručně řečeno, den před experimentem bylo do každé jamky 96jamkových destiček naneseno 105 hostitelských buněk. Buňky byly dvakrát promyty v HBSS++ a na buňky byly na dvě hodiny naneseny sériové roztoky 1:10 v infekčním médiu exponovaného viru z BioSampleru. Poté byly buňky dvakrát promyty v HBSS++, překryty čerstvým infekčním médiem a inkubovány po dobu tří nebo čtyř dnů při 34 °C. Cytopatické účinky (CPE) byly hodnoceny pod mikroskopem s jasným polem (10×) jako vakuolizace cytoplazmy, zakulacení buněk a slévání. TCID50 byla vypočtena metodou Reeda a Muencha28,38. Pro potvrzení skóre CPE byly vzorky fixovány ve 100% metanolu po dobu pěti minut a obarveny 0,1% krystalovou violetí. Výsledky jsou uváděny jako odhad jednotek tvořících plaky (PFU)/ml s použitím přepočtu PFU/ml = 0,7 TCID50 za použití Poissonova rozdělení29.
Imunofluorescence
Pro posouzení, zda zvyšující se dávky světla 222 nm snižují počet infikovaných buněk, jsme provedli standardní protokol fluorescenčního imunobarvení k detekci virového antigenu v hostitelských lidských buňkách23. Stručně řečeno, 2 × 105 hostitelských buněk (MRC-5 buňky pro HCoV-229E a WI-38 pro HCoV-OC43) bylo den před experimentem umístěno do každé jamky 48jamkových destiček. Po 30minutovém průchodu ozařovací komorou bylo na monovrstvu hostitelských buněk naneseno 150 μl virové suspenze odebrané z přístroje BioSampler. Buňky byly inkubovány s virem po dobu jedné hodiny, poté třikrát promyty HBSS++ a následně inkubovány přes noc v čerstvém infekčním médiu. Infikované buňky byly poté fixovány ve 100% ledově chladném methanolu při 4 °C po dobu 5 minut a označeny anti-human coronavirus spike glycoproteinem (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 v HBSS++ obsahujícím 1% bovinní sérový albumin (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny za mírného třepání. Buňky byly třikrát promyty v HBSS++ a označeny kozí protilátkou proti myším Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 v HBSS++ obsahující 1 % BSA při pokojové teplotě po dobu 30 minut ve tmě za mírného protřepávání. Po třech promytích v HBSS++ byly buňky obarveny přípravkem Vectashield obsahujícím DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a pozorovány pomocí 10× objektivu fluorescenčního mikroskopu Olympus IX70 vybaveného vysoce účinnou digitální kamerou Photometrics PVCAM s vysokým rozlišením a softwarem Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Pro každou dávku 222 nm a rod viru byly reprezentativní výsledky opakovány dvakrát. Pro každý vzorek bylo získáno až deset zorných polí sloučených snímků DAPI a Alexa Fluor-488.
Analýza dat
Přežívající frakce (S) viru byla vypočtena vydělením frakce PFU/ml při každé dávce UV záření (PFUUV) frakcí při nulové dávce (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Hodnoty přežití byly vypočteny pro každý opakovaný pokus a transformovány přirozeným logaritmem (ln), aby se rozdělení chyb přiblížilo normálnímu39. Robustní lineární regrese pomocí iterovaných převážených nejmenších čtverců (IWLS)40,41 byla provedena v softwaru R 3.6.2 s použitím těchto normalizovaných ln hodnot jako závislé proměnné a dávky UV záření (D, mJ/cm2) jako nezávislé proměnné. Pomocí tohoto přístupu bylo přežívání viru popsáno kinetikou prvního řádu podle rovnice4:
kde k je rychlostní konstanta inaktivace UV zářením nebo faktor citlivosti (cm2/mJ). Regrese byla provedena s intercepčním členem nastaveným na nulu, což představuje definici 100% relativního přežití při nulové dávce UV záření, zvlášť pro každý studovaný kmen viru. Údaje při nulové dávce, které podle definice představují ln = 0, nebyly do regrese zahrnuty. Nejistoty (95% intervaly spolehlivosti, CI) pro parametr k pro každý virový kmen byly odhadnuty pomocí bootstrappingu pro každou regresní metodu, protože bootstrapping může vést k realističtějším odhadům nejistot ve srovnání se standardní analytickou aproximací založenou na asymptotické normalitě v malých souborech dat, jaké byly použity zde (n = 3 HCoV-229E a n = 4 pro HCoV-OC43). Dobrá shoda byla hodnocena pomocí koeficientu determinace (R2). Analýza reziduí na autokorelaci a heteroskedasticitu byla provedena pomocí Durbin-Watsonova testu42 a Breusch-Paganova testu (implementovaného balíčkem lmtest R)43 . Odhady parametrů (k) pro jednotlivé kmeny viru byly vzájemně porovnány na základě 95% CI a přímo t-testem s použitím velikostí vzorků, hodnot k a jejich standardních chyb. Průřez inaktivace viru, D90, což je dávka UV záření, která inaktivuje 90 % exponovaného viru, byl vypočítán jako D90 = – ln/k. Ostatní hodnoty D byly vypočteny podobně.
.