Spektroskopické metody
Absorpční spektroskopie. U některých enzymových testů je možné měřit reaktant nebo produkt přímo na základě jeho absorpčních vlastností Fersht (1999). V reakci katalyzované glukosa-6-fosfát dehydrogenasou (EC 1.1.1.49) jeden produkt (NADH) absorbuje světlo při 340 nm, což umožňuje sledovat reakci sledováním nárůstu absorbance při této vlnové délce.
Glukosa-6-fosfát + NAD+ → 6-fosfoglukonát + NADH + H+
V jiných případech se reaktant nebo produkt měří nepřímo. Například u acetylcholinesterázy (EC 3.1.1.7) se jako substrát používá acetylthiocholin, který při působení enzymu uvolňuje thiocholin. Thiocholin reaguje s Ellmanovým činidlem za vzniku barevného produktu, což umožňuje sledovat reakci sledováním nárůstu absorbance.
Acetylthiocholin + H2O → acetát + H+ + thiocholin
Thiocholin + Ellmanovo činidlo → barevný derivát
K monitorování aktivity enzymu se někdy používají spojité testy. V tomto případě je enzymová reakce, která je předmětem zájmu, spárována s druhou reakcí, která je spojena pro pohodlné měření. Příkladem je stanovení hexokinázy (EC 2.7.1.1). V tomto případě je do testovací směsi zahrnut přebytek glukosa-6-fosfát dehydrogenázy a NAD+ a sleduje se absorbance při 340 nm.
Reakce I: glukosa + ATP → glukosa-6-fosfát + ADP
Reakce II: Glukosa-6-fosfát + NAD+ → 6-fosfoglukonát + NADH + H+
V tomto příkladu by reakce I měla být limitující rychlost a koncentrace glukosa-6-fosfátu by měla po určité době zpoždění dosáhnout ustáleného stavu. Cleland Cleland (1979) formuloval postup, jak zajistit, aby spojená zkouška poskytovala přesné měření reakční rychlosti enzymu. Pokud je to možné, je vhodnější sledovat reakci nepřetržitě. U výše popsaných testů lze spektrofotometr naprogramovat tak, aby poskytoval kontinuální odečet v závislosti na čase. Při separačních technikách, které mohou zahrnovat použití radioaktivity, elektroforézy nebo chromatografie, se používají diskontinuální nebo koncové testy. Po stanovení lineárního časového období pro zkoušku se parametr měří v jednom časovém bodě v rámci lineárního časového období (nejlépe v časovém bodě blízko středu lineární fáze). Rychlost se pak určí z rozdílu signálu v tomto časovém bodě a v okamžiku zahájení reakce. Při testech s koncovým bodem je třeba postupovat opatrně a časový průběh je třeba zkontrolovat, aby se potvrdila linearita. Změny inkubačních podmínek, jako je teplota, pH nebo koncentrace substrátu, mohou změnit linearitu testu. U běžných enzymových testů obsahuje reakční nádoba všechny složky kromě jedné a reakce se zahájí přidáním chybějící složky (enzymu nebo jednoho ze substrátů). Ostatní složky by měly být vyrovnány z hlediska pH, teploty a iontové síly. Reakce se obvykle zahajuje přidáním malého objemu koncentrovaného základního roztoku chybějící složky. Malý objem zajistí, že tento přídavek nenaruší již zavedené rovnovážné podmínky. Pokud není možné přidat malou složku, měly by mít oddělené složky stejnou teplotu, iontovou sílu a p H. Přestože musí dojít k úplnému promíchání obou složek, je třeba se vyhnout silnému třepání, protože by mohlo denaturovat enzymový protein. Míchání lze dosáhnout převrácením zkumavky s přiloženou zátkou nebo kyvety s použitím těsnicí fólie Parafilm. Zředěné proteiny jsou často méně stabilní než koncentrovanější proteiny a testy se často provádějí v přítomnosti inertního proteinu, jako je hovězí sérový albumin (0,25 mg/ml), aby se stabilizoval purifikovaný enzym. Experimenty by měly být prováděny tak, aby bylo zajištěno, že protein je inertní. Protože se například albumin může vázat na hydrofobní substráty, nemusí být pro tento účel vždy vhodný. Pro diskontinuální testy lze nastavit časovač a vzorky po smíchání nasávat v určitých časových intervalech. U většiny spektrofotometrů se detekce spouští ručně pomocí panelu přístroje nebo klávesnice počítače. Přidání složky do kyvety vyžaduje asi 20 sekund k umístění kyvety do spektrofotometru a zahájení detekce stisknutím klávesy počítače. Tato doba obvykle nemá velký význam, protože u většiny reakcí probíhá analýza 10 až 30 minut. Kontrolní měření zahrnují slepý pokus neobsahující enzym a slepý pokus neobsahující substrát. Tyto kontroly zajišťují, že nedochází k náhodným reakcím. Kontrolní rychlost (slepý pokus bez enzymu) se odečte od data generovaného experimentem, čímž se získá skutečná rychlost enzymatické reakce. U mnoha testů je nutné reakci v určitém čase uhasit nebo zastavit, aby se zabránilo další tvorbě produktu. Například vzorky lze odebírat v pětiminutových intervalech po předem stanovenou dobu a produkt měřit pomocí HPLC.
Každá chromatografická analýza může trvat 30 minut. Metody pro ukončení reakce obvykle zahrnují denaturaci enzymu přidáním kyseliny nebo ponořením do vroucí vodní lázně. Aktivitu některých metaloenzymů lze uhasit pomocí EDTA nebo jiného chelátoru kovových iontů. Většina enzymových testů je založena na spektroskopických technikách, přičemž dvě nejčastěji používané jsou absorpční a fluorescenční Fersht (1999). Vlnová délka použitá pro sledování rychlosti reakce by měla být taková, která poskytuje největší rozdíl v absorpci mezi substrátem a produktem. Absorpční měření se provádí pomocí standardního spektrofotometru se vzorky umístěnými ve specializovaných kyvetách. Jednorázové plastové kyvety, které pojmou 1 nebo 3 ml vzorků, jsou komerčně dostupné. Jejich použití je omezeno na viditelný rozsah vlnových délek (350-800 nm). Pro měření při vlnových délkách nižších než 350 nm se musí používat křemenné kyvety (sklo a plast absorbují světlo v UV oblasti). Délku dráhy pro kyvety uvádí výrobce. Oblíbené délky dráhy jsou 1,00 cm, 0,40 cm a 0,20 cm. Stále více testů se provádí pomocí 96jamkových mikrotitračních destiček s plastovým nebo křemenným dnem. Koncentraci látky, která absorbuje světlo při určitých vlnových délkách, lze určit z Beerova zákona:
A = εcl,
kde A je absorbance vzorku při určité vlnové délce, c je koncentrace vzorku, l je délka dráhy a ε je extinkční koeficient neboli molární absorbance. ε má jednotky M-1 cm-1 nebo mM-1 cm-1. Pokud je známa hodnota ε pro určitou látku, je možné vypočítat koncentraci této látky v roztoku měřením její absorpce v tomto roztoku. Pomocí Beerova zákona je možné vypočítat rychlost změny koncentrace v průběhu reakce. Možná chyba při použití měření absorpce vyplývá z odchylky od Beerova zákona, protože ten platí pouze pro konečný rozsah hodnot absorpce. Protože tedy nemusí být použitelný pro absorbance větší než 1, měly by být testy navrženy tak, aby experimentální hodnoty byly menší než tato hodnota. Některé z těchto problémů je možné obejít použitím kyvet s kratšími drahami. Vzorek s absorbancí 1,00 v kyvetě o délce dráhy 1,00 cm bude mít absorbanci 0,20 v kyvetě o délce dráhy 0,20 cm. Obecně platí, že práce s absorbancí kolem 0,5 představuje kompromis mezi minimalizací optického šumu vlastního spektrofotometru a přiměřeným měřitelným signálem. Zákal v roztoku může rozptylovat světlo a vytvářet zdánlivou absorbanci. K odstranění těchto částic lze použít filtraci nebo odstředění. Ačkoli změny délky dráhy obcházejí některé odchylky od linearity (tj. když je absorbance tak vysoká, že spektrofotometr nemůže provést přesné měření), často jsou odchylky způsobeny mezimolekulárními interakcemi mezi absorbujícími druhy. Dimerizace (nebo tvorba eximerů vyššího řádu) nastává při vyšších koncentracích absorbujících druhů. V těchto případech bude Beerův zákon dodržen, pokud se sníží koncentrace produktu. Toho lze dosáhnout buď zpomalením reakce (snížením koncentrace enzymu), nebo měřením po kratší dobu (než se objeví odchylky od Beerova zákona).
.