Pro účely tohoto příspěvku na blogu (další informace o různých typech fixativ budou následovat…) se zaměříme především na použití paraformaldehydu/formaldehydu, běžně označovaného jako PFA, který je nejčastěji používaným fixativem v průtokové cytometrii. PFA konkrétně označuje pevnou, polymerní formu formaldehydu (a ve vodném roztoku se rozpouští na monomerní formaldehyd), takže to, co se obvykle kanonicky označuje jako „fixace PFA“, je ve skutečnosti použití monomerního, formaldehydového roztoku. V tomto případě jsou PFA a formaldehyd synonyma a jsou vzájemně zaměnitelné.
Pro fixaci vzorků pro průtokovou cytometrii se obvykle používá roztok v rozmezí 1-4 % PFA. V případě dezinfekce infekčních vzorků lze vzorky od pacientů infikovaných HIV účinně dezinfikovat již při koncentraci 0,37 %1. Inkubace po dobu až 45-60 minut s 1% PFA a 15-20 minut se 4% PFA (např. pufr společnosti BioLegend) postačuje k úplné fixaci buněk a buňky lze v této fázi buď použít k následnému zpracování (permeabilizace pro intracelulární cíle), nebo uložit pro budoucí analýzu.
Při rutinním postupu barvení průtokovou cytometrií, který zahrnuje barvení povrchovými markery, existuje několik kroků, kdy se můžete rozhodnout, zda vzorky fixovat – fixovat po barvení povrchovými markery, nebo fixovat předtím.
V některých případech je rozhodnutí, kdy můžete fixovat,… pevné. Například pokud analyzujete fosfo-cíle, vazba určitých povrchových antigenů protilátkami může krátce po kontaktu změnit intracelulární signální dráhy, což vede k artefaktu ve vašich výsledcích fosforylace. V takovém případě byste měli buňky fixovat před přidáním povrchových protilátek (proto je náš doporučený protokol pro použití našeho True-Phos™ Perm Buffer k analýze intracelulárních fosforylačních cílů navržen tak, aby fixační krok předcházel dalším postupům). Každý z těchto postupů má své výhody a nevýhody, ale zde je několik věcí, na které je třeba si dát v každém případě pozor.