Alai

Abstrakt

Tato studie se snažila zjistit, zda je zkrácená folikulární fáze u ovulujících starších žen sekundární v důsledku pokročilé (tj. časnější) nebo urychlené (tj. rychlejší) folikulogeneze. Normálně ovulující ženy ve věku 40-45 let (n = 15) a 20-25 let (n = 13) podstoupily denní venipunkci a transvaginální ultrasonografii během folikulární fáze spontánního menstruačního cyklu (kontrolní cyklus) a po snížení regulace hypofýzy agonistou GnRH (studijní cyklus). Jak se očekávalo, starší subjekty v kontrolních cyklech vykazovaly zvýšený d 3 FSH a zkrácenou folikulární fázi ve srovnání s mladšími subjekty. Po uvolnění ze suprese hypotalamo-hypofyzárně-ovariální osy se vrchol časné folikulární fáze FSH objevil dříve (6,8 vs. 9,8 d; P < 0,01) a měl větší velikost (12,1 vs. 6,5 mIU/ml; P < 0,01) u starších subjektů. Doba od uvolnění suprese do následného vzestupu LH byla u starší skupiny rovněž kratší (17,5 vs. 20,8 d; P < 0,01). Doba od dosažení vrcholu FSH do nárůstu LH však byla u starší a mladší skupiny podobná (10,7 vs. 11,0 d; P = 0,74). Ve srovnání s mladšími ženami měly starší subjekty normální hladiny estradiolu a inhibinu A ve folikulární fázi a nižší hladiny inhibinu B v kontrolních i studijních cyklech. Došli jsme k závěru, že zkrácená folikulární fáze pozorovaná u starších ovulujících žen je způsobena dřívější selekcí dominantních folikulů nezávisle na hormonálních vlivech předcházející luteální fáze.

PRODUKTIVNÍ STÁŘÍ JE kontinuum, které začíná mnoho let předtím, než dojde k absolutní dysfunkci. Důležitým projevem procesu stárnutí je postupný pokles ženské plodnosti, který začíná ve druhé polovině třetí dekády a po 35. roce věku nabývá exponenciální charakter (1, 2). Toto zhoršení plodnosti předchází zjevným příznakům dysfunkce osy hypotalamus-hypofýza-ovaria (HPO), jako je nepravidelnost menstruace, přičemž většina žen má pravidelné ovulační menstruační cykly i po čtyřicítce (3, 4). V letech předcházejících přechodu do menopauzy je pravidelná ovulace zachována, zatímco menstruační cykly se postupně zkracují (4-6). Tento jev je způsoben zkrácením folikulární fáze bez související změny délky luteální fáze (5, 7). Dalším charakteristickým znakem postupujícího reprodukčního věku je vzestup FSH nedoprovázený vzestupem LH (monotropní vzestup FSH) (6-9). Zdá se, že nástup monotropního vzestupu FSH a časnější ovulace časově souvisí se zrychlením rychlosti atrézie folikulů, která nakonec vede k vyčerpání folikulární rezervy (10). Monotropní vzestup FSH a zkrácení folikulární fáze tak slouží jako klinické ukazatele postupujícího reprodukčního věku a rychle klesající plodnosti (11).

Během normálního menstruačního cyklu FSH stoupá v pozdní luteální nebo časné folikulární fázi a obvykle dosahuje vrcholu v časné folikulární fázi (12, 13). Se selekcí a následným vývojem dominantního folikulu FSH klesá na relativně nízkou hladinu až do nárůstu gonadotropinů uprostřed cyklu. Dominantní folikul u eumenorheických žen v pokročilém reprodukčním věku je relativně zdravý, roste do normální velikosti, produkuje normální nebo zvýšené hladiny estradiolu (E2) a po luteinizaci vylučuje normální hladiny progesteronu (7, 8, 14). Tyto normální vlastnosti staršího dominantního folikulu naznačují, že dřívější ovulace u starších žen není způsobena vnitřní vadou folikulu, ale extrafolikulárním hormonálním prostředím. Endokrinologické změny, které jsou ve studiích reprodukčního stárnutí popisovány nejdůsledněji, jsou zvýšená absolutní hladina FSH (6-9), dřívější vzestup FSH v časné folikulární fázi (7) a pokles hladin inhibinu B v časné folikulární fázi (15-18).

Současná studie byla provedena s cílem určit, zda je zkrácená folikulární fáze u ovulujících starších žen sekundárně způsobena pokročilou (tj. časnější) nebo zrychlenou (tj. rychlejší) folikulogenezí. Předpokládali jsme, že dřívější dominantní vývoj folikulů u starších žen je sekundární v důsledku dřívějšího vzestupu folikulárního FSH ve srovnání s mladšími kontrolami a že absolutní rychlost růstu folikulů bude v obou věkových kategoriích podobná. Jinými slovy, předpokládali jsme, že vývoj folikulů u žen v pokročilém reprodukčním věku je spíše pokročilý než urychlený. Hormonální a intraovariální účinky předcházejícího menstruačního cyklu mohou potenciálně zkreslit studie dominantního náboru a zrání folikulů. Abychom vyloučili jakýkoli takový vliv předchozího cyklu, potlačili jsme u každého subjektu osu HPO standardní down-regulací agonisty GnRH. Po zdokumentování potlačení osy HPO jsme porovnávali obnovu hormonální, folikulární a menstruační funkce u starších ovulačních subjektů ve srovnání s mladší kontrolní skupinou.

Subjekty a metody

Experimentální subjekty

V rámci série studií normálního reprodukčního stárnutí jsme k účasti získali zdravé ovulační ženy ve věku 40-45 let (n = 16) a 20-25 let (n = 15). Všechny subjekty musely mít pravidelné menstruační cykly (intervaly mezi cykly 21-35 d), normální index tělesné hmotnosti (18-24 kg/m2) a absenci zdravotních nebo reprodukčních poruch (včetně jakékoli anamnézy neplodnosti) a prokázat střednědobé sérové hladiny PRL nižší než 20 ng/ml, progesteronu vyšší než 10 nmol/litr a testosteronu nižší než 3 nmol/litr v předstudiovém cyklu. Po dobu trvání studie všechny subjekty buď sexuálně abstinovaly, nebo používaly nehormonální metody antikoncepce (např. bariérovou metodu nebo nitroděložní tělísko). Od každého účastníka byl získán písemný souhlas a všem dobrovolníkům byla poskytnuta finanční kompenzace. Protokol byl přezkoumán a schválen komisí pro kontrolu lidských subjektů Washingtonské univerzity.

Materiál a metody

Protokol studie.

V rámci kontrolního cyklu podstoupily všechny subjekty denní venipunkci a sériovou transvaginální ultrasonografii k posouzení vývoje dominantního folikulu ve folikulární fázi spontánního, přirozeného cyklu. Pro studijní cyklus bylo podávání nafarelin acetátu (400 μg, intranazálně, denně) zahájeno 7 d po zjištění nárůstu gonadotropinů v moči v polovině cyklu v předchozím cyklu. Když byla suprese osy HPO potvrzena hladinou E2 v séru pod detekčním limitem testu (73 pmol/litr), pokračovalo se v podávání nafarelinu dalších 5 d, aby se zajistilo rovnoměrné snížení regulace osy HPO. Počínaje dnem po ukončení podávání nafarelinu byla denně prováděna venipunkce pro analýzu E2. Jakmile koncentrace E2 v séru dosáhla nebo překročila 367 pmol/litr, byla denně prováděna transvaginální ultrazvuková vyšetření, dokud nebyl pozorován kolaps dominantního folikulu. Studijní cyklus byl zahájen do 6 měsíců od kontrolního cyklu.

Analýzy.

Všechny vzorky séra od určitého subjektu byly analyzovány duplicitně ve stejné analýze, aby se minimalizoval vliv variability uvnitř analýzy. Hladiny FSH v séru byly stanoveny pomocí dvoumístného monoklonálního testu ELISA na pevné fázi (DELFIA, Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Inter- a intraassay variační koeficienty (CV) byly 4,6 %, resp. 2,3 %. RIA pro stanovení E2 v séru byla provedena s použitím činidel dodaných společností ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, Kalifornie). Inter- a intraassay CV byly 18 %, resp. 9 %. K měření inhibinu B byla použita sendvičová ELISA na pevné fázi (Serotec, Oxford, UK), založená na použití destiček potažených monoklonální protilátkou specifickou pro podjednotku inhibinu β. Inhibin B se detekuje pomocí druhé monoklonální protilátky specifické pro podjednotku inhibinu α a postup stanovení podle výrobce zahrnuje předběžnou úpravu vzorků pomocí činidel dodávaných v soupravách (dodecylsulfát sodný a peroxid). Analytická citlivost (např. minimum pro βA-podjednotku inhibinu) byla stanovena s monoklonální protilátkou značenou křenovou peroxidázou specifickou pro α-podjednotku použitou k detekci. Standard testu dodaný výrobcem byl kalibrován pomocí prvního mezinárodního standardu WHO pro inhibin (rekombinantní lidský inhibin; šarže 91/624) a výsledky jsou uvedeny v mezinárodních jednotkách na mililitr tohoto referenčního materiálu. Test byl kontrolován ve dvojím provedení s použitím alikvotů vzorků obsahujících 2,00, resp. 9,56 IU/ml. Na základě těchto kontrol kvality byly CV mezi testy 8,7 %, resp. 3,3 % v rámci 57 testů použitých k získání zde uváděných údajů.

Statistická analýza.

Pro výsledky s jednou hodnotou údajů od každého jedince (např. délka folikulární fáze) byly průměry z obou kohort porovnány pomocí oboustranného t testu. Pro označení významného rozdílu byla zvolena hodnota α = 0,05. U výsledků s několika hodnotami údajů od každého jedince (např. sériové hladiny E2) byly průměry vzorků porovnány pomocí ANOVA s opakovanými měřeními. Na základě výsledků předchozích studií jsme očekávali, že variabilita v době do nástupu nárůstu LH bude přibližně 20 %. Proto jsme za předpokladu 20% variačního koeficientu odhadli, že při 15 subjektech v každé skupině bychom měli 80% šanci na nalezení rozdílu stejně malého jako 20%.

Výsledky

Dvě mladší a jedna starší žena byly ze studie vyřazeny z důvodu nedosažení suprese osy HPO. Základní charakteristiky kontrolního cyklu u zbývajících subjektů jsou uvedeny v tabulce 1. Jak se očekávalo, starší subjekty vykazovaly zkrácenou folikulární fázi a také zvýšený FSH a snížený inhibin B v cyklu d 3 kontrolního cyklu ve srovnání s mladšími subjekty. V kontrolních i studijních cyklech se u všech subjektů v každé věkové skupině vyvinul dominantní folikul s ultrazvukovým důkazem následného kolapsu folikulu po nárůstu LH uprostřed cyklu, což ukazuje na zjevně normální vývoj dominantního folikulu a ovulaci jak v přirozených cyklech, tak po přerušení suprese GnRH. Doba podávání přípravku Synarel (Searle, Skokie, IL) potřebná k dosažení suprese definované protokolem studie byla u mladších kontrol poněkud delší (rozmezí 9-20 d; průměr 12,8 ± 0,8 d; celková dávka 5,1 ± 0,3 mg) ve srovnání se staršími subjekty (rozmezí 9-13 d; průměr 11 d).0 ± 0,3 d; celková dávka, 4,4 ± 0,1 mg; P = 0,05 pro trvání i dávku).

Délka folikulární fáze

Pro účely této studie jsme rozdělili folikulární fázi na dva intervaly: časná folikulární fáze (definovaná jako doba od začátku menses nebo ukončení suprese agonisty GnRH do vrcholu FSH v časné folikulární fázi) a pozdní (definovaná jako doba od vrcholu FSH v časné fázi do nárůstu gonadotropinů uprostřed cyklu). Intervaly folikulární fáze (celková, časná a pozdní) jsou znázorněny na obr. 1. Po uvolnění ze suprese osy HPO dosáhla starší kohorta časného folikulárního vrcholu FSH dříve (6,8 ± 0,7 vs. 9,8 ± 0,6 d, v tomto pořadí; P < 0,01), čímž vznikla kratší časná folikulární fáze. Navíc starší kohorta měla kratší dobu od uvolnění suprese do následného vzestupu LH (17,5 ± 0,9 vs. 20,8 ± 0,7 d, v tomto pořadí; P < 0,01), což znamená celkově kratší celkovou folikulární fázi. Doba od vrcholu FSH v časné folikulární fázi do nárůstu LH uprostřed cyklu (pozdní folikulární fáze) však byla u starších a mladších skupin podobná (10,7 ± 0,7 vs. 11,0 ± 0,8 d; P = 0,74). U starších i mladších subjektů byla doba od ukončení podávání nafarelinu do následného vzestupu LH delší než folikulární fáze kontrolního cyklu (starší, 17,5 vs. 12,9 d; mladší, 20,8 vs. 14,8 d).

FSH

Profily FSH v okolí vrcholu FSH v časné folikulární fázi pro kontrolní i studijní cykly jsou znázorněny na obr. 2. Vrcholová hladina FSH v časné folikulární fázi byla vyšší u starších subjektů jak v kontrolním (12,0 ± 1,4 vs. 6,8 ± 0,3 mIU/ml; P < 0,01), tak ve studijním (12,1 ± 1,9 vs. 6,5 ± 0,4 mIU/ml; P < 0,01) cyklu. V rámci každé věkové skupiny nebyly pozorovány žádné rozdíly ve velikosti vrcholu FSH mezi kontrolními a studijními cykly (obr. 2). Zdá se tedy, že velikost vrcholu FSH je nezávislá na vlivu předcházející luteální fáze v obou věkových skupinách.

Sekrece ovariálních hormonů

Převažujícími sekrečními produkty dominantního folikulu jsou E2 a inhibin A. Obrázek 3 znázorňuje koncentrace E2 ve folikulární fázi, normalizované na nárůst LH, pro obě věkové skupiny v kontrolních a studijních cyklech. Vzor a množství E2 vylučovaného dominantním foliklem jsou podobné mezi studijními a kontrolními cykly v obou věkových skupinách. Ačkoli sklon vzestupu E2 a velikost dominantního folikulu se mezi skupinami nelišily, vrchol E2 v polovině cyklu byl vyšší u starších žen jak v kontrolním (1175 ± 73 vs. 973 ± 76 pmol/litr, resp.; P = 0,05), tak ve studijním cyklu (1351 ± 91 vs. 1061 ± 94 pmol/litr, resp.; P < 0,05). V obou cyklech vykazovaly starší subjekty také normální koncentrace inhibinu A ve folikulární fázi, přičemž mezi kontrolními a studijními cykly nebyly pozorovány žádné rozdíly (obr. 4). Starší subjekty měly vyšší koncentrace inhibinu A uprostřed cyklu jak v kontrolním (3,44 ± 0,45 vs. 2,50 ± 0,25 IU/ml; P = 0,08), tak ve studijním (3,32 ± 0,37 vs. 2,54 ± 0,26 IU/ml; P = 0,10) cyklu, ale toto zvýšení nedosáhlo statistické významnosti. Dominantní folikul starší ovulující ženy tedy vylučuje normální nebo zvýšené koncentrace E2 i inhibinu A. Sekrece těchto folikulárních hormonů není ovlivněna předchozí supresí osy HPO.

Na rozdíl od inhibinu A byl inhibin B, který je produkován převážně malými (<10 mm) antrálními folikuly (19, 20), významně nižší v časné folikulární fázi u starších žen v kontrolních i studijních cyklech (obr. 5). Všimněte si, že ne všechny subjekty měly dostatek alikvotů séra k provedení testů inhibinu A a/nebo B; proto je počet analyzovaných subjektů uveden v legendě každého obrázku.

Diskuse

Předchozí studie prokázaly postupné zkracování folikulární fáze s přibývajícím věkem navzdory zjevně normální dominantní velikosti folikulů, sekreční kapacitě a ovulaci (5, 7, 14). Mezi možná vysvětlení patří buď dřívější (pokročilá) selekce, nebo rychlejší (akcelerovaný) vývoj dominantního folikulu. V obou případech faktory, které určují délku folikulární fáze, potenciálně zahrnují změny ve fyziologii luteální fáze (ovlivňující parakrinní a/nebo endokrinní signální mechanismy) nebo změny v interakcích HPO v časné folikulární fázi. Cílem současné studie bylo eliminovat účinky předcházející luteální fáze potlačením osy HPO v podobné míře. Tímto způsobem bylo možné zkoumat folikulární fázi z podobného výchozího bodu.

Studie folikulární fáze u normálních žen prokázaly, že FSH začíná stoupat v pozdní luteální fázi, dosahuje vrcholu v časné folikulární fázi a následně klesá se vznikem dominantního folikulu (21, 22). Sonografický výskyt dominantního folikulu je spojen s vzestupem sérového E2, který zase koreluje s poklesem hladiny FSH (23). Proto jsme se zaměřili na vrchol FSH v časné folikulární fázi jako na ukazatel selekce dominantního folikulu. Jak v kontrolních cyklech, tak v cyklech po supresi osy HPO je folikulární fáze u starších žen zkrácena přibližně o 2-3 d; konkrétně se dříve objevuje vrchol časné folikulární fáze FSH. Výsledky této studie naznačují, že toto zkrácení folikulární fáze u starších žen je způsobeno pokročilým náborem (tj. dřívějším výběrem dominantního folikulu), a nikoli zrychleným (tj. rychlejším) růstem dominantního folikulu. Pokud by starší ženy měly zrychlený růst dominantního folikulu, očekávali bychom, že mezi jednotlivými skupinami bude rozdíl v době od časného vrcholu FSH ve folikulu do nárůstu LH.

Předpokládaným mechanismem zkrácení folikulární fáze u starších žen je dřívější a vyšší nárůst FSH u těchto subjektů ve srovnání s mladšími subjekty. K tomuto jevu došlo při absenci vlivu předcházející luteální fáze, což naznačuje, že nástup a velikost časného folikulárního vzestupu FSH může být způsoben jemnými rozdíly v ovariálních hormonech časné folikulární fáze souvisejícími s klesající ovariální rezervou. Na druhou stranu jsme zaznamenali, že folikulární fáze byla u obou věkových skupin po supresi nafarelinem delší než v kontrolním cyklu. Ačkoli je toto zjištění pravděpodobně částečně způsobeno dobou potřebnou k obnovení reaktivity hypofýzy na GnRH (24), podporuje také koncept, že dominantní nábor folikulů je zahájen v luteální fázi předchozího menstruačního cyklu (25).

Kandidátním hormonem, který je pravděpodobně zodpovědný za pozorované rozdíly v sekreci FSH v časné folikulární fázi, je inhibin B, 32-kDa heterodimerní glykoprotein vylučovaný ovariálními folikuly, který selektivně inhibuje sekreci FSH. Hladiny inhibinu B korelují s velikostí kohorty vyvíjejících se časných antrálních folikulů (26). Snížení hladin inhibinu B u starších ovulujících žen může být důsledkem postupující folikulární atrézie a s ní souvisejícího poklesu počtu antrálních folikulů (10, 27). Starší ženy se zvýšeným FSH mají nižší hladiny inhibinu B v časné folikulární fázi, což je pravděpodobně odrazem zmenšujícího se fondu ovariálních folikulů (19, 20, 28). Tento hormonální vzorec přetrvává i po snížení regulace hypofýzy, což naznačuje, že nízké hladiny inhibinu B u starších žen jsou nezávislé na sekreci inhibinu nebo steroidů v luteální fázi.

Normální velikost dominantního folikulu a normální sekrece E2 a inhibinu A ve folikulární fázi naznačují, že po náboru je dominantní folikul u starších žen zdravý a reaguje na stimulaci FSH. Zdá se však, že k náboru a udržení normální funkce dominantního folikulu jsou nutné vyšší hladiny FSH. Vyšší hladiny E2 v polovině cyklu uváděné u starších ovulujících žen (14, 29) mohou být způsobeny silnější sekrecí dominantního folikulu a/nebo mohou být výsledkem příspěvku sekundárních folikulů. Naše předchozí studie obsahu steroidů ve folikulární tekutině naznačují, že dominantní folikul je primárně zodpovědný za vyšší cirkulující hladiny E2 pozorované u starších premenopauzálních žen (14). Výsledky současné studie podporují vztah mezi monotropním vzestupem FSH a časným vývojem a ovulací dominantního folikulu. Další studie jsou nezbytné ke zjištění, zda existuje také vztah mezi zvýšeným FSH, vyššími preovulačními hladinami E2 a/nebo zrychlenou rychlostí atrézie folikulů pozorovanou ke konci čtvrté dekády.

Závěrem tato studie poskytuje důkaz, že zkrácení folikulární fáze pozorované u starších ovulujících žen je způsobeno zkrácením časné části folikulární fáze. Pozdní folikulární fáze zůstává co do délky a hormonálního profilu nezměněna. To naznačuje, že růst dominantního folikulu není urychlen, ale že jeho selekce je pokročilá. Tato studie také ukazuje, že zkrácení folikulární fáze u starších ovulujících žen není závislé na hormonálních vlivech předcházející luteální fáze.

Poděkování patří paní Gretchen Davisové a paní J. K. K., které se na této studii podílely. Laurie Guidry za pomoc při náboru subjektů a vedení projektu, panu Patricku Clarkovi za pomoc s ilustracemi a paní Dorothy McGuinness, panu Arlenu Sarkissianovi, panu Josephu Moyovi a paní Sheile Mallette za odbornou technickou pomoc při testech.

Tato práce byla podpořena grantem NIA RO1-AG-14579 a grantem NICHHD U54-HD29164.

• CV,

  Variační koeficient(y);

• E2,

  estradiol;

• HPO,

  hypotalamo-hypofyzárně-ovariální.

.