Alai

Abstrakt

Revmatoidní artritida (RA) je autoimunitní onemocnění. Vosí jed (WV), který je považován za tradiční lidový lék v národnosti Jingpo v čínském Yunnanu, zmírňuje revmatoidní artritidu. Cílem této studie bylo prozkoumat účinek vosího jedu na zmírnění příznaků revmatoidní artritidy u pokusných potkanů. Vytvořili jsme model kolagenem typu II (CII) indukované artritidy (CIA) u SD potkanů a zkoumali jsme inhibici zánětu a autoimunitní reakce. Antiartritické účinky WV byly hodnoceny prostřednictvím otoku tlapky a bylo hodnoceno histopatologické skóre a histopatologické změny postižené tlapky. Protizánětlivé účinky byly zjišťovány pomocí hladiny IL-6, TNF-α, IL-1β a počtu zánětlivých buněk v periferní krvi. Změny poměru subsetů T buněk ve slezině potkanů byly zjišťovány průtokovou cytometrií a současně byl hodnocen viscerální index a hladiny imunitního globulinu v séru. Výsledky naznačily, že různé dávky WV (0,125, 0,25 a 0,5 mg/kg) významně zmírnily otok tlapek a skóre artritidy u potkanů CIA s neléčenou kontrolou (). WV (0,25 a 0,5 mg/kg) zmírnil léze synoviální tkáně hlezenních kloubů a histopatologické skóre hyperplazie synoviocytů a infiltrace zánětlivých buněk se skupinou s vehikulem (). Pokud jde o imunologickou regulaci, WV v dávce 0,5 mg/kg snížil hladinu globulinu v imunitním séru () a dále jsme zjistili, že WV (0,5 mg/kg) potlačil imunitní odpověď Th buněk a zároveň výrazně posílil funkci Tc buněk a Treg buněk ve slezině (). Imunosupresivní účinek WV byl analogický jeho inhibičnímu účinku na hladiny IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 a PGE2 v séru potkanů. Závěrem lze říci, že tato zjištění prokázala, že WV vykazují antiartritickou aktivitu, která může souviset s jejich inhibičním účinkem na imunoregulaci a protizánětlivým působením.

1. Úvod

Rheumatoidní artritida (RA) je chronické autoimunitní onemocnění, které může progredovat do systémových komplikací, fyzického postižení a dokonce i předčasné smrti . Hyperplazie synoviálních buněk, chronický zánět synovie a destrukce chrupavky a kosti jsou hlavními charakteristikami RA. Kromě toho hrají v patofyziologickém procesu klíčovou roli také synergické účinky T buněk, B buněk a prozánětlivých cytokinů . Když jsou aktivovány CD4+ T buňky, produkují prozánětlivé cytokiny, které posilují imunitní odpověď stimulací dalších mononukleárních buněk, synoviálních fibroblastů, chondrocytů a osteoklastů. Uvolňování těchto prozánětlivých cytokinů, zejména TNF-α, IL-6 a IL-1β, může přispívat ke vzniku synovitidy .

V současné době se klinická léčba léky používanými k léčbě RA zaměřuje především na snížení zánětlivých mediátorů, jako jsou nesteroidní protizánětlivé léky (NSAID), chorobu modifikující antirevmatika (DMARD) a biologické látky. Například folátový analog metotrexát (MTX) byl jako NSAID schválen úřadem FDA pro léčbu RA v roce 1988 . Kromě toho se stal nejpoužívanějším v léčbě RA díky své imunosupresivní aktivitě, protizánětlivému účinku a nízké ceně . MTX však není ideálním léčebným prostředkem pro své nežádoucí vedlejší účinky na neuronální, gastrointestinální a imunitní systém, stejně jako další léky . Proto stále více lidí hledá nové alternativy, které by řešily neúčinnost a bezpečnost těchto léků. V teorii tradiční čínské medicíny (TCM) je RA považována za jeden ze syndromů artralgie („Bi Zheng“ v TCM), který je pravděpodobně způsoben exogenním větrem, vlhkostí a patogeny tepla nebo chladu . Uplatnění TCM v prevenci a léčbě nemocí má několikasetletou historii, rostoucí význam v léčbě RA se přisuzuje její pozoruhodné účinnosti, ale menšímu množství vedlejších účinků a nákladů .

Jedová terapie, jako přístup doplňkové a alternativní medicíny, se v lidovém léčitelství používá již několik století k léčbě bolesti, zánětu a artritidy . Již v období Válčících států je ve Vnitřním kánonu Žlutého císaře („Huangdi Neijing“ v čínštině) záznam o tom, že „včelí bodnutí je léčivé i přes vzniklé toxické riziko“. Podle moderního lékařského výzkumu vykazuje včelí jed (BV) antiartritické, protizánětlivé a analgetické účinky, které lze přičíst aktivaci centrálního inhibitoru a modulaci imunitního systému prostřednictvím mnoha mechanismů . Několik klinických studií také prokázalo, že BV může zlepšit příznaky související s artritidou .

Včelí jed obsahuje řadu biologicky aktivních složek, včetně biogenních aminů, vysokomolekulárních látek (jako jsou enzymy, alergeny a bioaktivní peptidy) a polyaminových toxinů. Vosí jed vykazuje různé farmakologické účinky při léčbě bolesti, zánětlivých onemocnění a neurodegenerativních onemocnění . Vespa magnifica (Smith) je druh společenské vosy, která se vyskytuje v čínském Yunnanu . V posledních letech bylo z jejich jedu odděleno mnoho sloučenin s protisrážlivou, protidestičkovou, protizánětlivou a imunosupresivní aktivitou . Na základě pozoruhodného účinku na revmatoidní artritidu se stal zvyk hojně užívat v Jingpo, čínské národnostní menšině . Nicméně, pokud je nám známo, existuje pouze několik zpráv o antirevmatických účincích vosího jedu.

V současné práci byl přijat model kolagenem indukované artritidy (CIA), který věrně kopíruje patogenezi RA. Změny objemu tlapek byly klasicky používány pro hodnocení protizánětlivých účinků na RA jako obvykle . Kromě toho jsme na stejném modelu hodnotili účinek WV (vosího jedu Vespa magnifica). Nakonec byla účinnost WV na protizánětlivý účinek a imunomodulaci sledována pomocí barvení H&E kloubní tkáně, průtokové cytometrie subsetů T-buněk ve slezině, jakož i ELISA sérových IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 a revmatoidních faktorů (IgG, IgA a IgM).

2. Materiály a metody

2.1. Experimentální zvířata

Samci potkanů SD (60 potkanů, 180-220 g) byli získáni od společnosti Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.. Zvířata byla umístěna ve standardních polypropylenových klecích vyložených surovými slupkami (obnovovanými po 48 h). Zvířata byla chována v cyklu 12 hodin světlo/tma při teplotě přibližně 22 ± 2 °C a relativní vlhkosti 60-70 % a měla volný přístup k vodě a standardnímu krmivu. Potkani byli náhodně rozděleni do 8 kontrolních skupin a 52 modelů a poté byla ponechána minimální doba 7 d pro adaptaci na každý experiment. Všechny experimentální postupy byly prováděny v souladu s Příručkou pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání (National Institutes of Health) a schváleny etickou komisí univerzity v Dali.

2.2. Zkoušky na potkanech byly prováděny v souladu s Příručkou pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání (National Institutes of Health). Zvířecí model CIA a protokol léčby

Potkani byli dezinfikováni alkoholem a subkutánně jim byl do pravého vola pedis, hřbetu a ocasu aplikován emulgátor CCII (kuřecí kolagen typu II) o koncentraci 1 mg/ml pro první imunizaci, který je tvořen CCII (C9301, Sigma) emulgovaným 1 : 1 s neúplným Freundovým adjuvans (F5506, Sigma). Indukční den byl navržen jako den 0. Posilovací dávka byla znovu aplikována do oblasti břicha, zad a ocasu spolu s 1 ml emulgátoru CCII 8. den. Injektovaná noha byla definována jako zánětlivá noha, zatímco druhá noha bez injekce byla zaznamenána jako sekundární noha. Poté byli potkani s kolagenem indukovanou artritidou (CIA) léčeni 14. den a léčba byla ukončena 28. den. Po nástupu CIA byli modeloví potkani náhodně rozděleni do pěti skupin podle klinického skóre. Skupina I: modelová skupina, která dostala podkožní injekci (1 ml/kg) fyziologického roztoku jako vehikulum. Skupiny II-IV: potkani s CIA dostali jako léčebné skupiny podkožní injekci 0,125, 0,25 a 0,5 mg/kg WV (vosí jed, z Vespa magnifica (Smith) z Yunnanu v Číně, lyofilizovaný prášek vyrobený z exudátu vosích ocasních žláz , zředěný normálním fyziologickým roztokem). Skupina V: pozitivní kontrolní skupina dostávala stejným způsobem TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, č. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) 9 mg/kg. Současně byl normálním potkanům v kontrolní skupině podán stejný objem samotného fyziologického roztoku. Všem výše uvedeným potkanům bylo podáváno denně po dobu 14 dnů.

2.3. Základní hodnocení experimentální artritidy

Závažnost CIA byla pravidelně hodnocena na základě otoku tlapek a skóre artritidy. Potkani byli váženi ve dnech 0-28 studie a tloušťka a obvod kotníků u zánětlivého chodidla (pravá noha) a sekundárního chodidla (levá noha) byly měřeny odděleně pomocí noniového měřítka a pásky v den 0, 14 a 28. V den 28 byly měřeny tloušťky a obvody kotníků u zánětlivého chodidla (pravá noha) a u sekundárního chodidla (levá noha). Skóre artritidy bylo hodnoceno na základě nezávislého pozorování tří vědců. Každá tlapka byla hodnocena na stupnici 0-4, což znamená, že maximální celkové skóre pro oba klouby zadní tlapky bylo 8. Kritéria hodnocení byla následující: 0 = žádný edém ani žádné vizuální změny; 1 = mírný edém a omezený erytém; 2 = lehký edém a erytém; 3 = zjevný edém a výrazný erytém; a 4 = těžký edém a rozsáhlý erytém . V den 28 byla zvířata utracena a poté bylo odebráno sérum a sekundární klouby hlezenního kloubu a zpracovány pro další analýzu.

2.4. Histopatologie hlezenních kloubů

Levé zadní končetiny bez vyřazení sousedních tkání byly ihned 2-3krát promyty PBS, fixovány 10% formalínem po dobu 48 hodin a dekalcifikovány 5% kyselinou dusičnou po dobu 24 hodin, dokud se kostní kůra snadno neprojela hrotem jehly. Vzorky byly vloženy do parafínových řezů a nakrájeny na plátky (5 μm) pro rutinní barvení hematoxylinem-eosinem (H&E). Patologické změny kloubů byly zjištěny světelným mikroskopem (Olympus, Japonsko) a vyfotografovány. Snímky byly pořízeny při zvětšení 200x. Byly rovněž zjištěny změny hyperplazie synoviocytů a infiltrace zánětlivými buňkami. Histopatologické změny byly hodnoceny podle následujících kritérií: 0 = žádné zjistitelné změny; 1 = mírné; 2 = středně závažné; 3 = závažné .

2,5. Analýza viscerálního indexu

Krysy byly usmrceny a kompletní játra, slezina a brzlík byly resekovány s pečlivě oddělenou okolní tukovou tkání a fascií. Vlhká hmotnost jater, sleziny a brzlíku byla změřena pomocí elektronických vah a viscerální index (zahrnující index jater, sleziny a brzlíku) byl vypočten podle následujícího vzorce. Viskózní index = hmotnost orgánu (mg)/hmotnost těla (g) × 100 %.

2,6. ELISA biochemických indexů séra

Sérum pokusných potkanů bylo odebráno a koncentrace TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 a PGE2 byly zjišťovány pomocí souprav ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Nanjing JianCheng, Čína) podle pokynů výrobce. Soupravy ELISA pro detekci hladiny exprese IgA (ERC015), IgG (ERC016) a IgM (ERC017) byly zakoupeny od společnosti NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Čína.

2.7. Průtoková cytometrie sleziny při artritidě

Počet podskupin T-buněk byl zjišťován pomocí průtokové cytometrie. Lymfocyty byly odebrány z potkaní sleziny, která byla homogenizována průchodem přes nylonové síto s 200 oky. Buňky byly přefiltrovány do pufru PBS obsahujícího 10% fetální hovězí sérum. Koncentrace buněk byla upravena na přibližně 2 × 106/ml a byly přidány 3 ml lyzačního pufru pro červené krvinky (Solarbio, Čína), aby se červené krvinky rozpustily na dobu kratší než 5 minut. Poté byly buňky centrifugovány při 1200 otáčkách za minutu po dobu 5 min, dvakrát promyty pufrem FBS-PBS, který obsahuje 10% fetální hovězí sérum, a poté centrifugovány při 1200 otáčkách za minutu po dobu 5 min. Každých 100 μl buněčné suspenze bylo umístěno do centrifugačních zkumavek. Lymfocyty byly následně obarveny pomocí anti-CD3-FITC (č. 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (č. 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (č. 558824; BD, USA) a anti-CD25-PE (č. 554866; BD, USA). Monoklonální protilátky byly přidány do každé zkumavky, znovu promíchány a ponechány 30 minut na ledu. Do každé zkumavky se vzorkem byl přidán pufr FBS-PBS (1 ml) a centrifugován při 1200 otáčkách za minutu po dobu 5 minut a supernatant byl vypuštěn. Předchozí krok byl dvakrát opakován, aby byly buňky bez vazby na monoklonální protilátky zcela vymyty. Experimentální buňky byly smíchány s 500 μl pufru FBS-PBS. Poměry CD25+/CD4+ a CD4+/CD8+ T-buněk byly stanoveny pomocí průtokového cytometru FACS Canto (BD, USA) .

2,8 . Statistické analýzy

Data byla statisticky analyzována pomocí programu SPSS10.0. Údaje byly prezentovány jako průměr ± směrodatná odchylka průměru (S.D.M). Významnost rozdílů mezi jednotlivými skupinami byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA a následného Tukeyho testu. Zejména skóre artritidy a histopatologické skóre byly analyzovány Wilcoxonovým rank sum testem. Za statisticky významné byly považovány hodnoty

3. Výsledky

3.1. WV zmírnil příznaky artritidy u potkanů s CIA

Podáním kolagenu typu II podle návodu byly u potkanů úspěšně vyvolány příznaky artritidy, které ztělesňovaly výrazné makroskopické známky silného zarudnutí a otoku sekundárních tlapek a hlezenního kloubu potkanů s CIA na obrázku1a), pokud byly porovnány se zdravou kontrolní skupinou. Tloušťka a obvod hlezenního kloubu byly u vehikulů 14. den (obrázek 1(b)) ve srovnání s kontrolními skupinami zjevně zvětšeny, avšak 28. den byly po TwHF a u všech skupin ošetřených WV nápadně zmenšeny ve srovnání s modelovou skupinou (všechny ) (obrázek 1(b)). Když jsme měřili tloušťku a obvod hlezenních kloubů u zánětlivého chodidla i u sekundárního chodidla, ukázalo se na základě údajů zřejmé ustoupení otoků (obrázek 1(b)). Výsledky stupně otoku naznačily, že WV může kontrolovat otok tlapky a zmírnit sekundární zánět na tlapce a hlezenním kloubu odpovídající TwHF efektu.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 1

Vliv WV na artritické příznaky jednotlivých skupin. (a) Stupeň otoku tlapek u všech skupin. (b) Tloušťka a obvod hlezenních kloubů jak u zánětlivých tlapek, tak u sekundárních tlapek u všech skupin. (c) Srovnání skóre artritidy mezi všemi skupinami.

Dále bylo skóre artritidy sníženo s různou mírou prostřednictvím léčby WV v závislosti na výši dávky, jak ukazuje obrázek 1(c). Skóre artritidy ve skupině s vehikulem bylo 14. den 6,5 ± 1,0 (oproti dni 0, ). Index se významně snížil ve skupině léčené TwHF 28. den, a to na 2,8 ± 0,8 (oproti 14. dni, ). Podobně byl pokles indexů u WV významný a závislý na dávce (3,2 ± 0,6 u 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 u 0,25 mg/kg a 5,6 ± 0,7 u 0,125 mg/kg) (severně vs 14. den, ). To naznačuje, že účinnost WV v dávce 0,5 mg/kg byla úměrná účinnosti skupiny léčené TwHF.

3.2. WV zmírnil patologické změny kloubů u potkanů s CIA

H&E barvení (obr. 2(a)) ukázalo, že synoviální membrána hlezenních kloubů kontrolních potkanů měla pravidelné buněčné uspořádání, bez hyperplazie synoviocytů, infiltrace zánětlivých buněk a hladký povrch chrupavky. Ve srovnání s tím byla histologická architektura kloubů potkanů z vehikulové skupiny výrazně abnormální s infiltrací imunitních buněk, hyperplazií synoviocytů, zvýšeným počtem cév a erozí chrupavky a kosti. Klouby skupin TwHF a WV byly výrazně oslabeny oproti kloubům skupiny s vehikulem a přiblížily se kloubům kontrolní skupiny. Histopatologické skóre (obrázek 2b) ukazovalo (skupina s vehikulem) na abnormální buňky synoviální výstelky a infiltraci zánětlivých buněk v artritických kloubech; léčba TwHF a WV významně snížila průměrné histopatologické skóre a obnovila chrupavku ve srovnání se skupinou s vehikulem ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 2

Vliv WV na progresi artritidy a histologii kloubů u potkanů CIA. (a) Histopatologie řezů kloubní tkání potkanů s CIA léčených různými dávkami WV a TwHF a normálních potkanů pomocí barvení H&E. Původní zvětšení ×200. a, destrukce kostí; b, infiltrace imunitními buňkami; c, hypertrofické synovium. (b) Histopatologické skóre hyperplazie synoviocytů a infiltrace zánětlivých buněk u všech skupin. , při porovnání s kontrolní skupinou; , při porovnání se skupinou s vehikulem.

3.3. Srovnání s kontrolní skupinou. Vliv WV na viscerální index a hladiny imunitního sérového globulinu u potkanů s CIA

V porovnání s kontrolní skupinou se jaterní index skupiny s vehikulem výrazně snížil () a WV (0,25 a 0,5 mg/kg) výrazně zvýšil (). Ve srovnání s kontrolní skupinou se u skupiny s vehikulem výrazně zvýšil index sleziny a thymu (); TwHF a WV na ně působily inhibičně, což se projevilo zejména v účinku dávky 0,5 mg/kg WV na index thymu (obrázek 3 a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 3

Vliv WV na viscerální index a hladiny imunitního globulinu v séru u potkanů CIA. (a) Změny indexu sleziny, brzlíku a jater u všech skupin. (b) Hladiny exprese IgG, IgA a IgM v séru všech skupin. , ve srovnání s kontrolní skupinou; , ve srovnání se skupinou s vehikulem.

Hladiny exprese IgG, IgA a IgM se u potkanů CIA () ve srovnání s kontrolní skupinou výrazně zlepšily, zatímco po zpracování TwHF () se snížily. A hladiny IgG v séru byly sníženy ve skupině WV (0,5 mg/kg) ve srovnání se skupinou s vehikulem (). Tato inhibice se týkala také IgA a IgM ve skupinách WV (0,25 a 0,5 mg/kg) (obrázek 3 b)).

3.4. Inhibice IgA a IgM ve skupinách WV (0,25 a 0,5 mg/kg). Účinky WV na podskupiny T buněk ve slezině potkanů CIA

Počet CD4+ T buněk se ve skupinách s vehikulem významně zvýšil ve srovnání s kontrolní skupinou (), zatímco ve skupinách TwHF a WV (0,5 mg/kg) byl významně nižší než ve skupině s vehikulem (obrázek 4(a)). Ve srovnání s kontrolní skupinou se počet CD4+CD25+ T buněk ve skupině s vehikulem významně snížil (), zatímco ve skupinách TwHF a WV (0,5 mg/kg) se významně zvýšil (), ale u ostatních skupin nebyl zřejmý (obrázek 4(a)). Ve srovnání s kontrolní skupinou bylo snížení počtu CD8+ T buněk ve skupině s vehikulem pozoruhodné, ale pouze u WV (0,125 a 0,25 mg/kg) se jejich počet zvýšil (, ) na obrázku 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 4

Počet podskupin buněk T ve slezině pomocí průtokové cytometrie. (a) Výsledky FCM o počtu Th buněk a Tc buněk (vlevo); výsledky FCM o počtu Treg buněk (vpravo). (b) Sloupcový graf ukazuje negativní účinek WV a TwHF na Th buňky a pozitivní účinek na Tc buňky a Treg buňky. , při porovnání s kontrolní skupinou; , při porovnání se skupinou s vehikulem.

3,5. WV regulované sérové cytokiny a mediátory u potkanů s CIA

ELISA soupravy (obr. 5) ukázaly, že ve srovnání s kontrolní skupinou byly sérové hladiny IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 a IL-8 významně zvýšeny ve skupině s vehikulem a byly výrazně obnoveny pomocí TwHF (9 mg/kg) a WV (0,5 mg/kg) (). Mezitím byly exprese IL-6 a PGE2 potlačeny dávkami 0,125 a 0,25 mg/kg WV (). WV (0,125 a 0,25 mg/kg) podobně snížil expresi COX-2 a IL-8 ve srovnání s vehikulem (, ). To naznačuje, že zánět vyvolaný CCII pravděpodobně zprostředkovává patologické změny pozorované u potkanů trpících artritidou a WV může zánětlivou reakci zmírnit.

Obrázek 5

Vliv WV na hladiny IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 a COX-2 v séru potkanů CIA. , ve srovnání s kontrolní skupinou; , ve srovnání se skupinou s vehikulem.

4. Diskuse

RA je chronické autoimunitní onemocnění charakterizované bolestí, otokem a postupnou destrukcí kloubů, což vede ke ztrátě jejich funkce. cAčkoli jsou tablety methotrexátu (MTX) offen považovány za lék pro léčbu revmatoidní artritidy , jsou obvykle spojeny s nežádoucími účinky léků (ADR). Proto jsme se snažili zhodnotit, zda by vosí jed (WV) mohl představovat potenciální alternativní lék na RA.

Podle našich znalostí byla současná studie první, která zkoumala terapeutickou roli WV (z Vespa magnifica) u kolagenem indukované artritidy (CIA) vyvolané u SD potkanů a porovnávala ji s klinicky prokázaným účinkem TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), v TČM známý také jako Lei Gong Teng, se v Číně již mnoho let používá k léčbě RA a extrakty z TwHF prokázaly protizánětlivé a imunosupresivní účinky jak ve studiích in vivo, tak in vitro . Vytvořili jsme model CIA potkanů na 14 dní a odstranili jsme 12 zjevných inkompetencí, které mohly být způsobeny selháním injekce, z 52 potkanů, to znamená, že CIA potkani měli 77% míru artritidy. Kontrolní skupina nevykazovala známky edému ani zánětu (obrázky 1 a 5) a naše zjištění jsou v souladu s předchozími studiemi RA a CIA, které uváděly, že emulgátor CCII vyvolal závažnost edému a zánětlivého poškození kloubů . Zlepšení příznaků ve skupině WV (0,5 mg/kg) pak bylo podobné jako u pozitivního léku TwHF, o kterém se uvádí, že inhibuje zánětlivou reakci RA , ale účinek nízké dávky nebyl významný na snížení otoku a inhibici IL-1β a TNF-α (obrázky 1 a 5). Navíc jsme si všimli, že potkani ve skupině s vehikulem měli hrubší srst a horší psychický stav než potkani v kontrolní skupině; tyto stavy se o to více zlepšily v léčené skupině.

Pro další vyhodnocení terapeutické účinnosti WV bylo provedeno barvení H&E ve vzorcích tkáně kloubů levého zadního kotníku pro analýzu patologického rysu a zjistili jsme, že synoviální buňky způsobují zánět, proliferaci a invazi lokalizované chrupavky a kosti ve skupině s vehikulem (obrázek 2) a tyto makroskopické změny jsou v souladu s předchozími zprávami . Kromě toho léčba TwHF a WV po dobu 14 dnů významně snížila hyperplazii synoviálních buněk a infiltraci zánětlivých buněk ve srovnání s neléčenou skupinou (obr. 2). Chronická synovitida je patologickým základem RA . Synoviální zánět je řízen komplexní interakcí mezi synoviocyty a infiltrujícími buňkami vrozeného a adaptivního imunitního systému . Proto byl v tomto experimentu vypočítán viscerální index imunitních orgánů, jako je slezina a brzlík. Za zmínku stojí, že jsme nezjistili významný rozdíl v hmotnosti mezi skupinou s vehikulem a skupinou s léčbou; proto jsme použili reprezentativní viscerální index, který odráží celkový zdravotní stav potkanů. Zjistili jsme, že TwHF a WV dokázaly snížit nárůst viscerálního indexu sleziny a brzlíku u potkanů s CIA (obrázek 3(a)); to by mohlo odrážet jejich roli při zmírňování posílení imunity způsobené RA. Všimli jsme si také změny jaterního indexu během tohoto procesu; naše výsledky ukázaly, že TwHF jaterní index neoživil, ačkoli jeho léčba byla účinná, což nám připomnělo jeho toxicitu pro játra v předchozí zprávě . U skupiny WV se to naštěstí neprojevilo (obrázek 3 a). S výjimkou sníženého jaterního indexu u skupiny s vehikulem a skupiny s TwHF nebyly u těchto potkanů pozorovány žádné vedlejší účinky, což mohlo být způsobeno nízkou dávkou, kterou jsme použili. Kromě toho jsme také detekovali revmatoidní faktory (RF), jako diagnostický marker RA, zahrnující především izotypy IgG, IgA a IgM; u pacientů s RA má vysokou míru detekce . Tato studie zjistila, že neléčení potkani s CIA měli významně vyšší hladiny protilátek IgG, IgA a IgM v séru než potkani ve skupinách TwHF a WV (obrázek 3b); tyto výsledky se dobře shodovaly s uváděnými klinickými údaji. Bylo tedy vidět, že TwHF a WV (0,5 mg/kg) mohou snížit nadměrnou autoimunitní odpověď potkanů CIA na úroveň blízkou normálu. Naproti tomu účinek WV (0,125 a 0,25 mg/kg) nebyl zřejmý, přičemž se teprve ukáže, zda vyšší dávka účinek spíše zlepší, než aby působila jako jed, proto jsme se při zkoumání účinku WV na RA v tomto experimentu ještě zaměřili na tyto tři dávky.

Předchozí výzkum ukázal, že synoviální zánět rekrutuje a aktivuje imunitní buňky produkcí mediátorů a T buňky hrají zásadní roli v regulaci RA . Pokud jde o roli prozánětlivých cytokinů v autoimunitě, je nezbytné vzít v úvahu rovnováhu mezi různými podskupinami T buněk, které se dělí především na dva hypotypy podle jejich funkce a fenotypu: CD4+ pomocné T (Th) buňky a CD8+ cytotoxické T (Tc) buňky. Th buňky a Tc buňky, charakterizované produkcí různých specifických cytokinů, usnadňují adaptivní imunitní odpověď . Naproti tomu CD4+CD25+ T (Treg) buňky mají klíčovou funkci při udržování imunitní tolerance tím, že kontrolují zánětlivé reakce a potlačují aktivitu výše uvedených imunitních buněk . V této studii jsme zjistili velkou koncentraci Th a Tc buněk ve slezině a také jsme zaznamenali zhoršenou funkci Treg buněk u potkanů s CIA. Naštěstí byla rovnováha mezi podskupinami T buněk chráněna léčbou TwHF a WV (obrázek 4). Za zmínku stojí, že akumulace imunitních buněk je promotorem lokálního kloubního zánětu a aktivované imunitní buňky uvolňují velké množství prozánětlivých cytokinů, které pak vyvolávají aktivaci a proliferaci synoviálních buněk a dále zhoršují progresi kloubního zánětu . Předchozí studie ukázaly, že IL-6 je nejdominantnějším cytokinem v patogenezi RA , a v synoviální tekutině pacientů s RA bylo zjištěno nadměrné množství IL-1β, stejně jako TNF-α a IL-8 . Produkce COX-2 a PGE2 se po stimulaci IL-1β rovněž zvýšila a jejich blokování výrazně zmírnilo příznaky RA . Podobné nálezy byly pozorovány i v našich experimentálních výsledcích a potvrdili jsme, že TwHF a WV (0,5 mg/kg) mohou účinně snížit hladiny IL-6, IL-8, PGE2 a COX-2; také zvýšené koncentrace IL-1β a TNF-α vyvolané RA byly potlačeny s výjimkou WV (0,125 a 0.25 mg/kg) (obr. 5).

Tyto výsledky naznačují, že WV má funkci zmírnění otoku kloubů, potlačení synoviálního zánětu, potlačení nadměrné imunitní odpovědi a ochrany homeostázy imunitního systému, což může zlepšit příznaky a stát se účinným lékem na RA. Bylo zjištěno, že vosí jed obsahuje řadu bioaktivních molekul, včetně aminů, malých peptidů, a dokonce i enzymů, alergenů a toxinů o vysoké molekulové hmotnosti . WV se od BV liší tím, že BV má na RA především protizánětlivé, antioxidační a analgetické účinky a obsahuje řadu různých peptidů, včetně melitinu, fosfolipázy A2, apaminu atd . Mechanismy léčby RA těmito dvěma jedy se mohou lišit a stojí za další studium. Přestože v rozmezí 0,125 až 0,5 mg/kg WV nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky, je nutné další vyhodnocení účinných látek a bezpečnosti extraktu WV.

5 . Závěry

Spasličí jed zmírnil synoviální hyperplazii a destrukci chrupavky způsobenou CIA, pravděpodobně v důsledku snížení prozánětlivého faktoru a imunoregulačního účinku. Tato studie prokázala, že vosí jed mohl být potenciální terapeutickou alternativou RA. Kromě toho, že je WV již mnoho let lidovým receptem, zaslouží si další studium, aby byl objeven, prozkoumán a uznán.

Dostupnost údajů

Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou součástí článku a mohou být volně k dispozici.

Etické schválení

Studie byla schválena Výborem pro institucionální péči o zvířata a jejich použití (IACUC) Univerzity Dali.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo k žádnému střetu zájmů.

Příspěvky autorů

YG napsal rukopis a pomáhal při konstrukci a seskupování zvířecích modelů. WXY a HL provedli barvení H&E a průtokovou cytometrii. XMD a LLN byli zodpovědní za soupravy ELISA. ZBY, HRZ a HX se významně podíleli na psaní rukopisu. ZBY a CGZ projekt administrovali a dohlíželi na něj. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Poděkování

Část této práce byla podpořena Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. Tato studie byla financována National Natural Science Foundation of China (granty č. 81360679 a 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (grant č. 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (grant č. 81360679 a 81703742). 2017FA050) a Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (grant č. ZKLX2019101).