Alai

3. Charakteristika peroxidas(y)

Peroxidasy jsou oxidoreduktasy, které katalyzují řadu reakcí, například redukci peroxidů, jako je peroxid vodíku, a oxidaci různých organických a anorganických sloučenin. Jsou to hemové proteiny a obsahují protoporfyrin IX železa (III) jako prostetickou skupinu. Jejich molekulová hmotnost se pohybuje od 30 do 150 kDa. Termín peroxidáza představuje skupinu specifických enzymů, jako je NADH peroxidáza (EC 1.11.1.1), glutathion peroxidáza (EC 1.11.1.9) a jodová peroxidáza (EC 1.11.1.8), jakož i řada nespecifických enzymů, které se jednoduše označují jako peroxidázy.

4. Aplikace a biokatalýza peroxidáz v řízení znečišťujících látek v životním prostředí

4.1. Peroxidázové biokatalýzy a jejich využití v praxi Dekolorizace syntetických barviv

Odpady barviv představují jednu z nejproblematičtějších skupin znečišťujících látek považovaných za xenobiotika, která nejsou snadno biologicky odbouratelná . Tato barviva se většinou používají při barvení textilu, tisku papíru, barevné fotografii a jako přísada do ropných produktů. Pokud jsou tato syntetická barviva vypouštěna do průmyslových odpadních vod, způsobují znečištění životního prostředí. Textilní průmysl hraje zásadní roli v hospodářském růstu Indie. Voda je jedním z hlavních produktů přírody, které člověk enormně využívá, a není nepřirozené, že každá rostoucí komunita produkuje obrovské množství odpadních vod nebo splašků . K dosažení biodegradace sloučenin nebezpečných pro životní prostředí se jako cenná alternativa jeví houby bílé hniloby. Schopnost oxidace je založena na schopnosti hub bílé hniloby produkovat oxidační enzymy, jako je lakáza, manganová peroxidáza a ligninová peroxidáza . Tyto oxidázy a peroxidázy byly zaznamenány jako vynikající oxidační činidla pro rozklad barviv .

Několik bakteriálních peroxidáz bylo použito pro odbarvování syntetických textilních barviv. Bylo studováno odstraňování chromanu Cr (VI) a azobarviva Acid Orange 7 (AO7) pomocí Brevibacterium casei za podmínek omezujících živiny. AO7 byl použit jako donor elektronů redukčním enzymem Brevibacterium casei pro redukci Cr (VI). Redukovaný chroman Cr (III) komplexovaný s oxidovaným AO7 tvořil fialový meziprodukt . Dekolorizace různých azobarviv pomocí Phanerochaete chrysosporium RP 78 za optimalizovaných podmínek byla studována pomocí reakčního mechanismu přes azobarvivo. Peroxidasa byla produkována za aerobních podmínek jako sekundární metabolit ve stacionární fázi. Bacillus sp. VUS izolovaný z půdy kontaminované textilními odpadními vodami prokázal schopnost degradovat řadu barviv . U hub byla popsána produkce ligninolytických peroxidáz přímo oxidujících aromatické sloučeniny . U mikroorganismů zodpovědných za biodegradaci průmyslových barviv byly společně s lignin peroxidázou zjištěny i další peroxidázy . Jedlá makroskopická houba Pleurotus ostreatus produkovala extracelulární peroxidasu, která může dekolorizovat remazolovou brilantní modř a další strukturně odlišné skupiny včetně triarylmethanu, heterocyklických azobarviv a polymerních barviv. Nejlépe byla dekolorizována bromfenolová modř (98 %), zatímco methylenová modř a toluidinová modř O byly dekolorizovány nejméně, a to 10 % . Bylo zjištěno, že HRP rozkládá průmyslově významná azobarviva, jako je remazolová modř. Toto barvivo obsahuje ve své struktuře nejméně jednu aromatickou skupinu, což z něj činí možný substrát HRP . Znečišťující látky z barvicí a bělicí jednotky prosakující do půdy znečistily podzemní vodu a učinily ji nevhodnou ke konzumaci (tabulka 1).

4.2. Bioremediace odpadních vod: Odstraňování fenolických kontaminantů a příbuzných sloučenin

Průmyslové znečištění je hlavním faktorem způsobujícím degradaci životního prostředí kolem nás a ovlivňuje vodu, kterou používáme; její kvalita a lidské zdraví jsou přímo souvisejícími problémy. Zlepšení kvality a zvýšení množství vody by přineslo zdravotní výhody. Bezpečná voda eliminuje infekční agens spojená s nemocemi přenášenými vodou; dostupnost většího množství vody může zlepšit zdraví tím, že umožní zlepšení osobní hygieny. Znečištění vody způsobilo vypouštění průmyslových odpadních produktů do jezer, řek a dalších vodních ploch, které způsobují, že mořský život přestává být přívětivý. Peroxidázy byly použity k bioremediaci odpadních vod kontaminovaných fenoly, krezoly a chlorovanými fenoly . Aromatické sloučeniny včetně fenolů a aromatických aminů představují jednu z hlavních tříd znečišťujících látek. Nacházejí se v odpadních vodách z nejrůznějších průmyslových odvětví, včetně zpracování uhlí, rafinace ropy, výroby pryskyřic a plastů, konzervace dřeva, povrchové úpravy kovů, výroby barviv a jiných chemikálií, textilního, těžebního a úpravárenského průmyslu a průmyslu celulózy a papíru . Fenoly a halogenované fenoly přítomné ve vodě zpracovávané v textilním průmyslu jsou známé jako toxické a některé z nich jsou také nebezpečné karcinogeny, které se mohou hromadit v potravním řetězci .

Peroxidázy zahrnují důležitou třídu enzymů schopných katalyzovat oxidační spojovací reakce široké škály fenolových sloučenin . Ligninová peroxidasa z Phanerochaete chrysosporium, HRP, myeloperoxidasa, laktoperoxidasa, mikroperoxidasa-8, univerzální peroxidasa z Bjerkandera adusta a chloroperoxidasa z Caldariomyces fumago byly schopny oxidativní dehalogenací v přítomnosti H2O2 přeměnit pentachlorfenol na totetrachlor-1,4-benzochinon. Extracelulární manganová peroxidasa produkovaná P. chrysosporium, P. sordida, C. subvermispora, P. radiata, D. squalens a P. rivulosu. Dvouelektronovou oxidací této extracelulární peroxidasy H2O2 vzniká sloučenina I, která prochází dvěma po sobě jdoucími jednoelektronovými redukčními kroky oxidací Mn2+ na Mn3+ , který následně oxiduje fenolové sloučeniny . V odpadních vodách řady průmyslových odvětví se vyskytuje mnoho toxických aromatických a alifatických sloučenin. Mezi nimi je nejběžnějším aromatickým polutantem fenol, který se vyskytuje i v kontaminované pitné vodě. Fenol může být toxický, pokud je přítomen ve zvýšené koncentraci, a je známo, že je karcinogenní. Na zdraví působí i při nízkých koncentracích. Laboratorní fenol byl ošetřen enzymovým extraktem z kořene tuřínu (peroxidázou) v přítomnosti H2O2 jako oxidantu za vzniku odpovídajících volných radikálů. Volné radikály polymerují a vytvářejí látky, které jsou méně rozpustné ve vodě. Sraženiny byly odstraněny odstředěním a byl odhadnut zbytkový fenol . Výsledky ukázaly, že enzymový extrakt z kořene tuřínu rozkládá fenol účinněji. Další univerzální peroxidáza produkovaná P. eryngii a P. ostreatus oxidoval Mn2+ na Mn3+ podobně jako MnP a také aromatické sloučeniny s vysokým redoxním potenciálem, stejně jako LiP měl širokou specifitu a oxidoval nefenolové sloučeniny .

4.2.1. Mechanismus reakce HRP-H2O2-fenol

Křenová peroxidáza prochází při reakci s fenolickými substráty cyklickou reakcí. Tento sled je shrnut v následujících reakcích: Enzym začíná ve své nativní formě (E) a je oxidován H2O2 za vzniku aktivní mezisloučeniny známé jako sloučenina 1 (Ei). Sloučenina 1 oxiduje jednu molekulu fenolu (PhOH) za vzniku volného fenolového radikálu (PhO) a stává se sloučeninou II (Eii). Sloučenina II oxiduje druhou molekulu fenolu za vzniku dalšího volného radikálu fenolu a dokončí cyklus návratem do své původní formy E. Volné radikály polymerují a vytvářejí nerozpustné sloučeniny, které se srážejí z roztoku . Polymerizační reakce je znázorněna na obrázku Další peroxidasa, označená jako dye-decolorizing peroxidase (EC 1 : 1 : 1 : ) z hub typu Agaricus, byla popsána jako katalyzátor oxidace barviv a fenolových sloučenin (obrázek 2).

Obrázek 2

Reakční schéma zapojené do produkce hydroxylového radikálu houbami bílé hniloby prostřednictvím chinonového redoxního cyklu . 1,4-benzochinon (BQ) je redukován chinonreduktázou (QR) za vzniku hydrochinonu (BQH2), který je oxidován některým z enzymů modifikujících lignin na semichinony . Produkce superoxidových aniontových radikálů autoxidací je katalyzována především Fe3+ , který je redukován na Fe2+ . Tvorba Fentonova činidla se uskutečňuje přeměnou O2 na H2O2.

4.3. Tvorba superoxidových radikálů. Odstraňování chemických látek narušujících endokrinní systém (EDC)

Několik tříd oxidačních enzymů se ukázalo jako slibné pro účinné odstraňování EDC, které jsou odolné vůči běžným úpravám odpadních vod. Ačkoli kinetika reakcí mezi jednotlivými EDC a vybranými oxidačními enzymy, jako je HRP, je v literatuře dobře zdokumentována, reakce se směsmi EDC byly dosud málo zkoumány . EDC jsou skupinou sloučenin, které díky své chemické struktuře mohou působit jako agonisté nebo antagonisté hormonů. Mohou narušit syntézu, sekreci, transport, vazbu, působení a eliminaci endogenních hormonů, které jsou odpovědné za udržování homeostázy, reprodukce, vývoje a integrity živých organismů a jejich potomstva . Jsou široce rozptýleny v životním prostředí, ale vyskytují se především v odpadních vodách. Několik prací uvádí oxidaci EDC manganatou peroxidázou. Při použití 10 U/ml manganaté peroxidázy z Pleurotus ostreatus bylo 0,4 mM bisfenolu eliminováno za 1 h . Peroxidázy jsou také užitečné při odstraňování nebo degradaci dalších silných znečišťujících látek životního prostředí, jako jsou chloroaniliny a polycyklické aromatické uhlovodíky .

4.4. Peroxidáza se používá i při odstraňování nebo degradaci dalších silných znečišťujících látek životního prostředí. Rozklad polychlorovaných bifenylů (PAH) Pesticidy

Pesticidy zahrnují širokou škálu látek nejčastěji používaných k regulaci hmyzu, plevelů a hub. Expozice pesticidům u člověka je spojena s chronickými zdravotními problémy nebo zdravotními příznaky, jako jsou dýchací problémy, poruchy paměti, dermatologická onemocnění, rakovina, deprese, neurologické deficity, potraty a vrozené vady . Biologický rozklad pesticidů je nejdůležitějším a nejúčinnějším způsobem odstraňování těchto sloučenin z životního prostředí. Mikroorganismy mají schopnost chemicky i fyzikálně interagovat s látkami, což vede ke strukturálním změnám nebo úplnému rozkladu cílové molekuly .

Peroxidázy získané z některých druhů hub mají velký potenciál přeměnit několik pesticidů na neškodnou formu (formy). Byla studována transformace organofosforových pesticidů houbami bílé hniloby , a byla popsána transformace několika organofosforových pesticidů chloroperoxidázou z Caldariomyces fumago. PAH se skládají ze dvou nebo více sloučených aromatických kruhů a jsou složkami ropy, kreozotu a uhlí . Většina kontaminace PAU pochází z rozsáhlého využívání fosilních paliv jako zdrojů energie. Peroxidázy a fenoloxidázy mohou působit na specifické PAH tak, že je přeměňují na méně toxické nebo snáze rozložitelné produkty. PAH jsou oxidovány peroxidázami, jako je ligninová peroxidáza a manganová peroxidáza . Navzdory své univerzálnosti a potenciálnímu využití v environmentálních procesech se peroxidázy zatím neuplatňují ve velkém měřítku. Pro uplatnění peroxidáz v transformaci znečišťujících látek je třeba řešit různé problémy, jako je stabilita, redoxní potenciál a produkce velkého množství . Peroxidasy extrahované z některých druhů hub mají velký potenciál k přeměně několika pesticidů na neškodnou formu (formy). Navzdory jejich všestrannosti a potenciálnímu využití v environmentálních procesech se peroxidázy zatím neuplatňují ve velkém měřítku. Pro uplatnění peroxidáz při transformaci polutantů je třeba vyřešit různé problémy, jako je stabilita, redoxní potenciál a produkce velkého množství.

4.5. Působení peroxidáz v praxi Degradace chlorovaných alkanů a alkenů

Kontaminace půdy a vodonosných vrstev alifatickými halogenovanými uhlovodíky trichlorethenem (TCE) a perchlorethenem (PCE) široce používanými jako odmašťovací rozpouštědla představuje závažný problém znečištění životního prostředí. TCE podléhá in vitro reduktivní dehalogenaci katalyzované LiP z P. chrysosporium v přítomnosti terciárního alkoholu, H2O2 a EDTA (nebo oxalátu), což vede k produkci odpovídajících redukovaných chlorovaných radikálů . Z půdy kontaminované IMZT byl izolován jeden kmen bakterie IM-4 schopný rozkládat imazethapyr (IMZT). Tento kmen rovněž prokázal schopnost rozkládat další imidazolinonové herbicidy, jako je imazapyr, imazapic a imazamox . Bylo rovněž prokázáno, že extracelulární hydroxylové radikály produkované T. versicolor prostřednictvím chinonového redoxního cyklu katalyzují rozklad PCE a TCE . TCE je mineralizován aerobně pěstovanými kulturami P. chrysosporium. Tito badatelé navrhli, že TCE podléhá in vitro reduktivní dehalogenaci katalyzované LiP P. chrysosporium v přítomnosti terciárního alkoholu, H2O2 a EDTA (nebo oxalátu), což vede k produkci odpovídajících redukovaných chlorovaných radikálů .

4.6. Zkoumání TCE v podmínkách in vitro. Rozklad fenoxyalkanových a triazinových herbicidů

Nejčastěji používanými širokolistými herbicidy na celém světě jsou kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) a kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová (2,4,5-T). 2,4-D a možná i 2,4,5-T jsou součástí látky Agent Orange, která byla široce používána jako defoliant. 2,4-D je poměrně náchylný k bakteriálnímu rozkladu a obecně se v životním prostředí dlouho neudrží. Naproti tomu 2,4,5-T je relativně odolnější vůči mikrobiálnímu rozkladu a má tendenci v životním prostředí přetrvávat. Byl obviňován z vážných onemocnění mnoha veteránů vietnamské války, kteří byli vystaveni působení Agent Orange, který byl používán jako defoliant. Uvádělo se také, že se jedná o mutagenní látky, a proto jsou pro člověka velmi toxické. Ligninolytické peroxidázy P. chrysosporium a Dichomitus qualens se podílely na rozkladu chlorovaných fenolických meziproduktů 2,4-D a 2,4,5-T. Tyto výsledky byly založeny na zvýšené degradaci 2,4,5-T a 2,4-D značených kruhovým a postranním řetězcem pomocí D. Squalens po přidání Mn2+ (známý induktor MnP) do média a na zvýšené degradaci P. chrysosporium v médiu s omezeným obsahem dusíku (ve kterém je indukována produkce LiP i MnP). Atrazin je běžně používaný triazinový herbicid a je rozkládán řadou hub bílé hniloby produkovaných lakasou a peroxidázou .

4.7. Rozklad chlorovaných dioxinů

Polychlorované dibenzodioxiny (PCDD) jsou skupinou vysoce toxických látek znečišťujících životní prostředí, které jsou potvrzenými karcinogeny pro člověka a díky svým lipofilním vlastnostem mají tendenci se bioakumulovat u lidí a zvířat. Bylo prokázáno, že polychlorované dibenzodioxiny (PCDD) a polychlorované dibenzofurany (PCDF) jsou rozkládány několika druhy hub bílé hniloby, což naznačuje možnou účast LiP a MnP. Houba P. sordida produkovala MnP, ale žádný LiP; a surový MnP vykazoval rozklad dioxinů.

4.8. Degradace chlorovaných insekticidů

Lindan (c izomer hexachlorcyklohexanu) byl v minulosti široce používaným pesticidem a odhaduje se, že v letech 1950-2000 bylo celosvětově vyrobeno 600 000 tun lindanu. V současné době platí celosvětový zákaz používání lindanu z důvodu jeho perzistence jako znečišťující látky v životním prostředí. Bylo zjištěno, že P. chrysosporium kultivované za ligninolytických podmínek částečně mineralizuje lindan v kapalných kulturách a v půdě s kukuřičným klasem inokulované P. chrysosporium, ale degradace lindanu nebyla pozorována in vitro při použití purifikovaných LiP a MnP z P. chrysosporium . DDT (1,1,1-trichlor-2,2-bis ethan), první z chlorovaných organických insekticidů, byl po druhé světové válce poměrně hojně používán. Vysoké hladiny DDT nalezené v zemědělské půdě vzbuzují hluboké obavy, protože představují vážnou hrozbu pro potravinovou bezpečnost a lidské zdraví. Bylo prokázáno, že houby bílé hniloby P. chrysosporium, P. ostreatus, T. versicolor a Phellinus weirii mineralizují DDT .

4.9. Peroxidázy jako biosenzory

Biosenzory byly definovány jako analytická zařízení, která těsně kombinují biorozpoznávací prvky s fyzikálními převodníky pro detekci cílové sloučeniny. Několik příkladů biosenzorů vyvinutých pro relevantní látky znečišťující životní prostředí. Biosenzory mohou být užitečné například pro průběžné monitorování kontaminované oblasti . Mohou také představovat výhodné analytické vlastnosti, jako je vysoká specifičnost a citlivost (vlastní konkrétnímu biologickému rozpoznávacímu biosenzoru. H2O2 je považován za mediátor biochemie buněčné patologie a možná se podílí na etiologii stárnutí a progresivních neurodegenerativních onemocnění, jako je Parkinsonova choroba. Vzhledem k jeho zásadní roli v neurochemii je stanovení koncentrace H2O2 značně zajímavou oblastí výzkumu. Elektrochemické metody založené na peroxidázových biosenzorech se ukázaly být pro biologické vědy značně výhodné díky jejich přímému měření v reálném čase a možnosti praktického využití . Nový biosenzor třetí generace pro peroxid vodíku byl zkonstruován zesíťováním HRP na elektrodu modifikovanou vícestěnnými uhlíkovými nanotrubičkami . Zároveň biosenzory nabízejí možnost stanovit nejen konkrétní chemické látky, ale také jejich biologické účinky, jako je toxicita, cytotoxicita, genotoxicita nebo účinky narušující endokrinní systém, tj. relevantní informace, které jsou v některých případech významnější než chemické složení. Enzymatické biosenzory jsou založeny na selektivní inhibici specifických enzymů různými třídami sloučenin, přičemž pokles aktivity imobilizovaného enzymu v přítomnosti cílového analytu je parametr, který se často používá pro kvantifikaci.

Byl vyvinut nový elektrochemický biosenzor na bázi myoglobinu založený na nanokompozitu připraveném z vícestěnných uhlíkových nanotrubiček, které byly potaženy nanočásticemi ceria . Další aplikací celobuněčných biosenzorů je stanovení biologické spotřeby kyslíku (BSK). Pesticidy (herbicidy, fungicidy a insekticidy) jsou díky své vysoké insekticidní aktivitě široce používány v zemědělství a průmyslu po celém světě. Biosenzory jsou potenciálně užitečné, protože rychle detekují pesticidy a v oblasti výzkumu jsou aktivní již několik let. Byl vyvinut další cenný biosenzor na bázi HRP, v němž byla spředena nanovlákna z polyvinylpyrolidonu (PVP) se zabudovaným enzymem HRP. Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) upředených nanovláken byla použita k potvrzení netkané struktury, která měla průměr 155 ± 34 nm. Vlákna obsahující HRP byla testována na změnu aktivity po elektrospinningu a během skladování. K charakterizaci aktivity HRP byla použita kolorimetrická zkouška reakcí s nanovlákennými rohožemi v mikrotitrační destičce a sledováním změny absorpce v čase. Rychlé a citlivé metody detekce jsou nesmírně důležité pro identifikaci patogenů souvisejících se zdravím a bezpečností. Peroxidáza použitá při vývoji testu laterálního toku založeného na sekvenci nukleových kyselin, který dosahuje nízkého limitu detekce pomocí chemiluminiscence a enzymatického zesílení signálu .

4.10 . Použití v celulózo-papírenském průmyslu

Vedlejší produkty rozvlákňování (černý louh) a odpadní voda z celulózky způsobují vážný environmentální problém kvůli vysokému znečištění. Řešení environmentálních problémů celulózo-papírenského průmyslu je nezbytné pro zachování lesního průmyslu a přizpůsobení se měnícím se ekonomickým potřebám lesních společenství . Výroba buničiny v celulózo-papírenském průmyslu zahrnuje dva hlavní procesy, tj. rozklad dřeva a bělení. Při rozkladu dřeva se dřevní štěpka vaří v roztoku hydroxidu sodného a síranu sodného při zvýšené teplotě a tlaku, aby se štěpka rozpadla na vláknitou hmotu. Chemická reakce s dřevními vlákny rozpustí všechny těžko rozložitelné depozitní materiály a tyto deriváty se z vláken odplaví během procesu praní a odvodňování. Různé extrakty během praní zahrnují především ligniny, celulózu, fenoly, pryskyřice, mastné kyseliny a třísloviny, které se smíchají a vytvoří tmavě černý viskózní alkalický odpad známý jako černý louh. Alkalická odpadní voda tvoří pouze 10-15 % celkové odpadní vody, ale podílí se téměř z 90-95 % na celkovém znečištění z hlediska vysokého pH, BSK, CHSK a barvy, což ji činí značně toxickou pro životní prostředí. Proto je vhodné černou louhu před vypouštěním do životního prostředí vhodně upravit. Biologické metody čištění černých kalů zahrnující použití hub, bakterií, řas a enzymů jako jednostupňové čištění nebo v kombinaci s jinými fyzikálními a chemickými metodami se zdají být ekonomičtější a ekologičtější. Z dosud vyzkoušených biologických metod se většina literatury omezuje na několik rodů hub bílé hniloby kvůli jejich nespecifickému extracelulárnímu enzymatickému systému (LiP, MnP a lakasa), který se podílí na biodegradaci ligninu .

5 . Závěr

Důležitost peroxidáz při detoxikaci znečištěného prostředí spočívá v jejich schopnosti katalyzovat redukci peroxidů, jako je peroxid vodíku, a oxidaci různých organických a anorganických sloučenin a polymeraci toxických sloučenin nebo křížovou reakcí s jinými fenolickými látkami nebo s kosubstráty s toxickými a neškodnými vlastnostmi a vytváří polymerní produkty (dimery, trimery, hybridní oligomery), které se budou velmi pravděpodobně hromadit v půdě a/nebo ve vodních systémech. Peroxidázy mají potenciál pro bioremediaci odpadních vod kontaminovaných fenoly, krezoly a jinými průmyslovými odpadními vodami, pro dekolorizaci textilních barviv, odstraňování chemických látek narušujících endokrinní systém, degradaci pesticidů, polychlorovaných bifenylů, chlorovaných alkanů a alkenů z půdy, fenoxyalkanových herbicidů, triazinových herbicidů, chlorovaných dioxinů a chlorovaných insekticidů. Peroxidasy se používají také jako biosenzory. Rychlý pokrok ve využívání peroxidáz k rozkladu znečišťujících látek vrhl více světla na udržitelné bioremediační strategie pro znečišťující sloučeniny a ochranu životního prostředí pomocí různých enzymů. Ochranu životního prostředí ovlivňují tři vzájemně se prolínající faktory: environmentální legislativa, etika a vzdělávání. Každý z těchto faktorů hraje důležitou roli při ovlivňování environmentálních rozhodnutí na národní úrovni a environmentálních hodnot a chování na osobní úrovni. Aby se ochrana životního prostředí stala skutečností, je důležité, aby společnosti a národy rozvíjely každou z těchto oblastí, které budou společně informovat a řídit environmentální rozhodnutí.

Poděkování

Tato práce byla financována Radou pro vědecký a průmyslový výzkum, Nové Dillí, v rámci CSIR-NET Junior Research Fellowship uděleného jednomu z autorů (NB). Autoři děkují CSIR, Nové Dillí, a Katedře biotechnologie, Himáčalpradéšská univerzita, Šimla.