Alai

Vakuolární ATPáza (V-ATPáza) je vícesubjednotková protonová pumpa poháněná ATP, která okyseluje intracelulární vezikuly a extracelulární prostředí, a tím se podílí na velkém množství biologických funkcí . Předchozí přehledy elegantně popsaly strukturu a funkci V-ATPázy . Zde podáváme přehled nejnovější literatury týkající se funkce V-ATPázy a jejího podílu na různých buněčných procesech v normální fyziologii s důrazem na rakovinu. Podrobně také představujeme regulaci Notch a dalších signálních drah pomocí V-ATPázy, čímž odhalujeme dosud méně známou funkci V-ATPázy v buněčné signalizaci.

Izoformy podjednotek

Strukturálně je V-ATPáza rotační nanomotor složený z několika podjednotek, z nichž každá má několik izoforem . Podjednotky jsou uspořádány do dvou domén: periferní domény V1, která je zodpovědná za hydrolýzu ATP, a integrální membránové domény VO, která funguje při translokaci protonů. Struktura V-ATPázy je vysoce konzervovaná mezi všemi eukaryotickými buňkami a podílí se na různých funkcích napříč druhy. U savců má doména V1 osm různých podjednotek (A, B, C, D, E, F, G a H), zatímco doména VO se skládá ze šesti různých podjednotek (a, c, c‘, c“, d, e) . Rozdílné požadavky na okyselení intracelulárních vezikul a extracelulárního prostředí určují funkci a regulaci V-ATPázy. Pro snížení nebo zvýšení účinnosti pumpy řídí V-ATPáza spojení mezi hydrolýzou ATP a pumpováním protonů. Tento proces zajišťuje podjednotka „a“ V-ATPázy . Podobně je na izoformách podjednotky „a“ závislé i buněčně a kompartmentově specifické zaměření V-ATPázy. VOa je integrální membránový protein o velikosti 100 kDa s N-koncovým cytosolickým ocasem a 9 transmembránovými doménami. Byly identifikovány čtyři izoformy podjednotky „a“ (a1, a2, a3 a a4) s odlišnou vezikulární a buněčnou distribucí. VOa1 je exprimován na synaptických vezikulách a VOa2 je exprimován na intracelulárních vezikulách, jako jsou golgi a časné endozomy. VOa3 je exprimován na plazmatické membráně osteoklastů, zatímco VOa4 je exprimován na plazmatické membráně interkalárních buněk ledvin. Dále je N-konec podjednotky „a“ důležitým motivem, který připoutává doménu V1 k membráně a byl také popsán jako jedinečný pH senzor v lysozomech . Exprese a izoformní lokalizace podjednotky „a“ je rozhodující pro fungování V-ATPázy .

Fyziologická funkce V-ATPázy

V-ATPáza je všudypřítomně exprimována a plní různé biologické funkce v buňkách většiny tkání prostřednictvím vezikulární, luminální a extracelulární acidifikace . K dosažení četných buněčných funkcí usnadňuje V-ATPáza lokalizovanou koncentraci protonů v kyselých vezikulách endocytární a exocytární dráhy .

Vezikulární acidifikace

Endosomy a lysosomy

V-ATPáza je nejznámější pro svou úlohu při acidifikaci intracelulárních vezikul, jako jsou endosomy a lysosomy. Na povrchu endozomů V-ATPáza okyseluje, a tím moduluje důležité buněčné procesy, jako je endocytóza receptorů a vezikulární obchodování . Acidifikace endozomů V-ATPázou je klíčová pro endocytickou internalizaci komplexů receptorových ligandů. Po zahájení signalizace nižší pH v endozomech uvolňuje ligand a recykluje ho do plazmatické membrány . V lysozomech pomáhají V-ATPázy udržovat nízké pH 4,5 a jsou také důležité pro transport nově syntetizovaných kyselých hydroláz z Golgiho do lysozomů. Dále fagozomy a autofagozomy v makrofázích, respektive nádorových buňkách, také závisí na kyselém pH udržovaném V-ATPázou pro aktivitu degradačních enzymů v těchto kompartmentech .

Golgi

Třídění exocytických a endocytických strojů začíná v Golgiho komplexu. Důležité je, že většina proteinů prochází glykosylací, což je klíčová posttranslační modifikace v Golgiho aparátu . Mutace v podjednotce a2 V-ATPázy mají za následek cutis laxa, autozomálně recesivní syndrom vrásčité kůže, u kterého je pozorována porucha glykosylace proteinů mimobuněčné matrix . Ačkoli V-ATPáza geneticky souvisí s defektem glykosylace, přesný vztah mezi okyselením Golgiho a zráním proteinů nebyl prozkoumán.

Specializované vezikuly

V-ATPáza je hlavní protein exprimovaný ve specializovaných kompartmentech specifických typů buněk. Během neurotransmise V-ATPáza zajišťuje klíčovou protonovou hybnou sílu nezbytnou pro tvorbu synaptických vezikul a následnou akumulaci neurotransmiterů . V buňkách slinivky břišní je acidifikace závislá na V-ATPáze důležitá pro exocytózu inzulinu . V-ATPáza také řídí rovnováhu mezi štěpením a fúzí vezikulárního systému tím, že interaguje s receptorem SNARE (Soluble NSF Attachment protein Receptor) a GTPázou .

Okyselení lumina

V-ATPázy byly původně identifikovány na intracelulárních vezikulách, ale význam V-ATPáz na plazmatické membráně enormně vzrostl . V epiteliálních buňkách proximálního tubulu ledvin udržuje izoforma a4 V-ATPázy acidobazickou rovnováhu a acidifikaci moči (systémová acidóza) . Podobně v průhledných buňkách nadvarlete okyseluje V-ATPáza plazmatické membrány luminální kompartment a pomáhá při zrání a ukládání spermií . V kostních osteoklastech se lysozomální V-ATPáza během kostní resorpce přemisťuje do plazmatické membrány a okyseluje lakuny . Plazmatická V-ATPáza má zásadní význam pro fungování mezizubních buněk ucha, epiteliálních buněk nosu a zraku . Dysfunkce V-ATPázy je spojena s patologickými stavy, jako je renální tubulární acidóza, hluchota, porucha čichu a osteoporóza Schéma, které nastiňuje úlohu V-ATPázy ve vezikulární a luminální acidifikaci, je znázorněno na obrázku . 1.

Úloha v rakovině

V poslední době se V-ATPáza v plazmatické membráně intenzivně studuje u rakoviny, kde pomáhá udržovat zásadité intracelulární prostředí příznivé pro růst a kyselé extracelulární prostředí příznivé pro invazi . V nádorech byla prokázána vyšší exprese V-ATPázy směrem k přednímu okraji proliferujících nádorových buněk rakoviny prsu, prostaty, plic, vaječníků, jater, slinivky břišní, melanomu a jícnu . Konkrétně buňky karcinomu prsu exprimují V-ATPázu na plazmatické membráně za účelem okyselení extracelulárního prostoru a kvantitativní exprese V-ATPázy koreluje s invazivitou a metastatickým potenciálem buněčné linie . Přesného příspěvku V-ATPázy k rostoucímu nádoru je dosaženo jejím vlivem na molekulární mechanismy/cesty, o nichž je pojednáno níže.

Imunomodulace

Vakuolární ATPáza izoforma a2 (VOa2 nebo a2V) má imunomodulační úlohu v těhotenství a při rakovině. Studie zahrnující a2V v reprodukční biologii odhalily dosud neznámou roli této molekuly v normálním zrání a produkci spermií kromě implantace embrya . V nádorovém mikroprostředí N terminální doména a2V polarizuje makrofágy na makrofágy asociované s nádorem (typ M2) a stimuluje různé podskupiny monocytů cestou endocytózy . V návaznosti na tato zjištění bylo dále prokázáno, že nedostatek a2V v nádorových buňkách mění rezidentní populaci makrofágů v nádorovém mikroprostředí a ovlivňuje růst nádoru in vivo . a2V je exprimován na primárních granulích neutrofilů a pomáhá udržovat pH v exocytické dráze během aktivace neutrofilů . Ošetření lidských neutrofilů rekombinantním N terminálním peptidem a2V (a2NTD) podpořilo migraci a polarizaci neutrofilů . Tyto studie společně zdůrazňují imunomodulační úlohu V-ATPázy při vyvolávání silných imunitních reakcí.

Warburgův efekt

Poznávacím znakem rakoviny je Warburgův efekt, kdy buňky přecházejí z oxidativní fosforylace na aerobní glykolýzu . Několik studií poukazuje na hypotézu, že rakovinné buňky jsou při dosahování příznivého zásaditého intracelulárního pH a kyselého extracelulárního pH závislé na V-ATPáze více než na jiných regulátorech pH, jako jsou Na+H+ výměníky, bikarbonátové transportéry a proton-laktátové symportéry . Alkalizace cytosolu aktivuje glykolýzu a zároveň potlačuje oxidativní fosforylaci . Dále jsou některé onkogeny související s glykolýzou, jako je faktor indukovaný hypoxií (HIF-1), regulovány změnou pH vyvolanou V-ATPázou .

Kyselé proteázy

Důsledkem extracelulární acidifikace v nádorech je aktivace kyselých proteináz, což jsou enzymy, které štěpí extracelulární matrix během nádorové invaze. Tyto enzymy patří do třídy kyselých proteináz, jako jsou katepsiny , matrixové metaloproteinázy (MMP) a želatinázy, a jsou aktivní při kyselém pH. Kromě toho je aktivita intracelulárních enzymů, jako je γ-sekretáza, které jsou aktivní při kyselém pH, také zvýšena zvýšenou aktivitou V-ATPázy ve vezikulách . To následně vede k dysregulaci onkogenních drah, jako je Notch.

Léková rezistence a inhibitory V-ATPázy

Změněné pH nádorového mikroprostředí může ovlivňovat citlivost na chemoterapeutika . Antracykliny a alkaloidy mají pKa 7 až 8 a jsou internalizovány do endozomálního kompartmentu . Nedávné údaje naznačují, že použití inhibitorů V-ATPázy způsobuje nejen změny cytosolického pH vedoucí k buněčné smrti, ale také zvyšuje absorpci léčiv, čímž se stává účinnou součástí kombinované léčby rakoviny . U rakoviny vaječníků je a2V exprimována na předním okraji nádorových buněk a moduluje aktivitu MMP9 . Dále a2V přispívá k lékové rezistenci zprostředkované cisplatinou u karcinomu vaječníků a selektivní inhibice a2V by mohla sloužit jako účinná strategie léčby chemorezistentního karcinomu vaječníků . Inhibitory V-ATPázy bafilomycin a konkanamycin patří do třídy pleomakrolidů, které se zaměřují na sektor VO a účinně inhibují aktivitu V-ATPázy. V poslední době byly jako silné a specifické inhibitory V-ATPázy popsány apikularen a archazolidy . Všechny dostupné inhibitory na bázi malých molekul však mají značnou toxicitu vzhledem k zapojení V-ATPázy do normální buněčné fyziologie . Proto by vývoj specifických neutralizačních protilátek proti izoformě podjednotky „a“, která má specifickou buněčnou expresi, mohl být účinnou alternativou, která by způsobila přímou inhibici V-ATPázy a zároveň by kombinovaným použitím nepřímo řešila rezistenci vůči více léčivům .

Autofagie

Autofagie je proces selektivní degradace nebo recyklace kargů dodávaných autofagosomy do lysosomů . Nádorové buňky vykazují různou závislost na autofagii při přechodu od primárního nádoru k vysoce metastazujícímu solidnímu nádoru . Buněčný náklad označený k degradaci je autofagickými procesy dopravován do lyzozomů . Protonová pumpovací aktivita V-ATPázy je zodpovědná za aktivaci lysozomálních kyselých hydroláz, které degradují náklad přijatý z autofagozomů . Ačkoli studie poukazují na požadavek funkční V-ATPázy pro autofagii a inhibitor V-ATPázy bafilomycin se používá jako klasický inhibitor autofagie , přesná role V-ATPázy v membránové dynamice autofagického toku není známa. Nedávná studie uvádí, že léčba bafilomycinem, který inhibuje aktivitu V-ATPázy i Ca2+ pumpy SERCA pumpy, vedla k blokádě autofagického toku, zatímco lyzozomy s deficitem V-ATPázy byly stále schopné fúzovat s autofagozomy . Tyto výsledky naznačují zapojení V_ATPázy do degradace autofagického nákladu v lysosomech než do autofagického toku a zdůrazňují potřebu vývoje specifických inhibitorů a technik genové manipulace ke studiu přesné úlohy V-ATPázy v různých důležitých buněčných procesech.

Signalizace

Endolysosomální dráha je důležitá pro pozitivní i negativní regulaci signálních drah . První známá zpráva o zapojení V-ATPázy do signalizace pochází ze studie, která ukázala, že inhibice V-ATPázy bafilomycinem ovlivnila internalizaci EGFR . Od té doby je V-ATPáza spojována s přenosem signálu souvisejícím s regulací signalizace m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β a Notch.

Signalizace Notch

Snad nejlépe prostudovanou signální dráhou regulovanou V-ATPázou je Notch. To lze přičíst skutečnosti, že signalizace Notch závisí na endolysozomální dráze pro její aktivaci, udržování a degradaci klíčových mediátorů dráhy . V-ATPáza udržuje rovnováhu pH v buňce a hraje důležitou roli v endocytóze, aktivaci proteáz a degradaci proteinů. Konkrétně a2V (podjednotka V-ATPázy – VOa2) byla dříve lokalizována do časných endozomů – místa pro endocytózu receptorů . Po vazbě ligandu se receptor Notch vydává endocytickou cestou a je štěpen proteázami za účelem aktivace. Později jsou receptory degradovány v lysozomu . U Drososphily způsobují mutace v Vps25, součásti mechanismu ESCRT, který reguluje endozomální třídění signálních receptorů, akumulaci receptoru Notch v endozomech a zesilují signalizaci Notch . Ve studii analyzující drozofilní mutace Hrs, další složky ESCRT, dochází k hromadění Notch v endozomech, ale nezpůsobuje ektopickou aktivaci signalizace Notch . Ztráta autofagie vede k aktivaci signalizace Notch v buňkách folikulů vaječníků Drosophily v důsledku narušení degradace Notch . Na rozdíl od těchto zpráv nezávislá studie zjistila, že mutace v Rabconnection-3 narušují protonovou čerpací aktivitu V-ATPázy a akumulují Notch v pozdních endozomech po štěpení S2, čímž snižují signalizaci Notch v buňkách Drosophily a savců . Na tato zjištění navázaly zprávy u Drosophily, které dále naznačují, že prostřednictvím acidifikace endolysozomální dráhy je V-ATPáza nezbytná pro aktivaci Notch v endozomech i pro degradaci Notch v lysozomech . Během vývoje savců exprese dominantně negativní podjednotky V-ATPázy v nervových prekurzorech snížila signalizaci Notch a vyčerpala nervové kmenové buňky vedoucí k diferenciaci neuronů . Nedávno bylo studiemi na astrocytech v sítnici potkanů s mutací Nuc1 prokázáno, že dochází k dysregulaci signalizace Notch . Snížení signalizace Notch bylo způsobeno mutovaným βA3/A1-krystalinem, který reguluje aktivitu V-ATPázy, což má za následek zhoršení endozomální acidifikace a aktivity γ-sekretázy, a tím ovlivňuje rychlost zpracování receptorů Notch . To je zajímavé zjištění vzhledem k tomu, že úloha V-ATPázy ve vidění se nyní objevuje . Tato zjištění společně naznačují, že regulace signalizace Notch pomocí V-ATPázy může mít pozitivní i negativní důsledky v závislosti na buněčné lokalizaci ovlivněné aktivity V-ATPázy (endosomy vs. lysosomy) a závislosti zpracování receptoru Notch na endosomální dráze . Ačkoli vzájemné ovlivňování V-ATPázy a Notche bylo zkoumáno v souvislosti s endolysozomální acidifikací závislou na V-ATPáze, která ovlivňuje signalizaci Notche, nedávná zpráva naznačuje, že regulace může být i opačná. Konkrétně autoři naznačují, že presinilin1 (PS1), součást enzymového komplexu γ-sekretázy odpovědného za štěpení receptoru Notch a β-amyloidního peptidu, fyzicky interaguje s izoformou VOa1 V-ATPázy a směruje ji z endoplazmatického retikula do lysozomů . Naše studie zjistily, že V-ATPáza reguluje Notch signalizaci při rakovině prsu a vývoji mléčné žlázy . a2V je exprimována na povrchu proliferujících epiteliálních buněk mléčné žlázy a buněk trojitě negativního karcinomu prsu (TNBC), což naznačuje její roli v buněčné proliferaci během normálního vývoje a onemocnění. U TNBC inhibice a2V zvyšuje signalizaci Notch tím, že blokuje lysozomální a autofagickou degradaci receptoru Notch . Ztráta a2V v myší mléčné žláze vede k abnormální aktivaci Notch a narušuje morfogenezi duktů, což způsobuje defekty laktace . Signalizace Notch se aktivuje během předčasného porodu vyvolaného infekcí PGN + poly(I:C), což vede k upregulaci prozánětlivých reakcí, a její inhibice zlepšuje přežití živých plodů inutero. Dále byla u předčasného porodu vyvolaného zánětlivou reakcí na injekci LPS pozorována up-regulace zánětu souvisejícího s Notch a down-regulace faktorů angiogeneze . Jak u infekce, tak u zánětlivých modelů předčasného porodu se nám podařilo fenotyp zachránit léčbou inhibitory γ-sekretázy (GSI) . To otevírá cestu důležitým směrem do budoucna, zejména proto, že GSI je účinným inhibitorem signalizace Notch a v současné době je v klinických studiích u několika druhů rakoviny. Díky tomu se ukazuje, že vzájemné ovlivňování V-ATPázy a Notche je důležité během normálního vývoje a při onemocněních, jako je Alzheimerova choroba a různé druhy rakoviny .

Wnt signalizace

Signální dráha Wnt hraje významnou roli při udržování buněk a tkání, polaritě a diferenciaci. U lidí se dysregulace signalizace Wnt podílí na vzniku rakoviny . Klasickým příkladem dysregulace signalizace Wnt je kolorektální karcinom, u kterého ztráta Adenomatous Polyposis Coli (APC), negativního regulátoru signalizace Wnt, spouští tumorigenezi . Během signalizace působí ligandy Wnt na cílové buňky vazbou na Frizzed, Fz a LRP (low density-lipoprotein), komplex receptorů na povrchu buněk, což vede k rozpadu glykogen syntázy kinas (GSK-3) a následnému uvolnění β-kateninu. β-katenin je hlavním následným mediátorem dráhy Wnt, který aktivuje cílové onkogeny Wnt, jako jsou c myc a cyklinD1 . (P) RR, proreninový receptor nazývaný také ATP6ap2 působí jako adaptorová molekula mezi V-ATPázou a Wnt receptorovým komplexem LRP 5/6 . U Xenopus a Drosophila bylo prokázáno, že V-ATPáza interaguje s receptorovým komplexem LRP 5/6 a genetické vyřazení i farmakologická inhibice V-ATPázy narušují přenos signálu a výrazně snižují buněčnou odpověď na Wnt signalizaci . Dále bylo prokázáno, že V-ATPáza nepřímo reguluje mediátor signalizace Wnt β-katenin a mediátor Notch NICD prostřednictvím autofagie .

Signalizace TGF-β

Mutace v genu a2V způsobují autozomálně recesivní syndrom Cutis Laxa (ACL), kdy se u pacientů vyskytuje snížené množství proteinů mimobuněčné matrix, jako je kolagen, což vede k fenotypu vrásčité kůže . Na podporu těchto zjištění bylo při mechanistickém zkoumání mutací zodpovědných za cutis laxa u lidí zjištěno, že mutace a2P405L je nestabilní a defektní v golgiho obchodu ve srovnání s divokým typem . Dále zprávy poukazují na defekt glykosylace v ACL, který vede ke zvýšené podpoře signalizace transformujícího růstového faktoru beta (TGF-β) u těchto pacientů s mutací a2V . V-ATPáza podporuje TGF-β indukovaný epiteliálně-mezenchymální přechod proximálních tubulárních epiteliálních buněk potkana . Kromě vlivu na signalizaci Notch aktivovala inhibice a2V dráhu Wnt u TNBC a dráhu TGF-β u epiteliálních buněk mléčné žlázy . To naznačuje, že role a2V v modulaci signálních mediátorů se netýká výhradně Notch. Dále tyto myši také vykazovaly snížení celkového množství kolagenu v důsledku zhoršené glykosylace .

signalizace mTOR

V signalizaci mTOR serin-treoninová kináza mTOR a další složky komplexu mTOR 1 (mTORC1) vnímají dostupnost aminokyselin buněčný stres a modulují růst .Po stimulaci aminokyselinami aktivuje V-ATPáza aktivitu guaninového výměnného faktoru (GEF) Ragulátoru vůči RagA, který následně podporuje hydrolýzu GTP RagC . RagA s navázaným GTP a RagC s nabitým GDP společně rekrutují mTORC1 na povrch lysozomů . Aktivovaný mTORC1 reaguje na signalizaci růstových faktorů a řídí regulační přepnutí z buněčné smrti na proliferaci . Nedávná zpráva naznačuje zapojení regulátoru protonové pumpy osteoklastů Atp6v1c1 do zvyšování růstu karcinomu prsu aktivací dráhy mTORC1 a kostních metastáz zvýšením aktivity V-ATPázy .

.