Alai

Nádory hlavy a krku jsou sedmým nejčastějším typem nádorových onemocnění z hlediska výskytu a úmrtnosti, v roce 2018 se celosvětově vyskytlo 890 000 nových případů a 450 000 úmrtí. Léčba zůstává náročná, přičemž současné terapie vedou u pacientů s lokálně pokročilým onemocněním k pětiletému přežití pod 50 % . Léková rezistence a toxicita omezují účinnost chemoterapeutik, jako jsou cis- nebo karboplatina, 5-fluorouracil a taxany. Zavedení cílených látek, jako je cetuximab, nivolumab nebo pembrolizumab, zlepšilo výsledky, ale nepřekonalo problém primární nebo získané rezistence na léčbu u většiny pacientů . Jen velmi málo biomarkerů se v současné době používá v klinické praxi nebo skutečně postoupilo k validaci pro rutinní použití . Spolehlivé preklinické modely mají proto zásadní význam pro lepší pochopení molekulárních mechanismů podílejících se na rezistenci k léčbě a progresi HNSCC a pro vývoj účinnějších léčebných strategií.

Immortalizované buněčné linie odvozené z nádorů HNSCC představují cenný nástroj pro funkční analýzu rezistence k léčbě. Screening léčiv v monovrstvých buněčných kulturách zůstává běžným přístupem k identifikaci nových terapeutických látek. Trojrozměrné (3D) kultury, které lépe reprezentují architekturu nádorové tkáně a buněčné prostředí, by však mohly být lepší pro predikci účinnosti léčiv u pacientů. Ve studiích využívajících 3D buněčné kultury byly totiž prokázány velké rozdíly v citlivosti na záření a léčiva, podobné těm, které byly zjištěny u nádorů in vivo. I když jsou 3D kultury užitečné pro studium interakcí mezi různými buněčnými populacemi, plně nereprodukují složitost HNSCC. Vývoj nových léčebných postupů tak může nakonec vyžadovat klinicky relevantní zvířecí modely HNSCC, které přesně reprezentují buněčné a molekulární změny spojené s iniciací a progresí lidského karcinomu. V tomto ohledu vstoupily na pole výzkumu HNSCC modely HNSCC indukované karcinogeny, transgenní zvířata a transplantovatelné xenografty. Tento přehled popisuje nejčastěji používané preklinické modely HNSCC (schematicky znázorněné na obr. 1) a podává přehled jejich silných stránek a omezení. Diskutujeme také nové přístupy personalizované volby léčby založené na těchto modelech.

Ex vivo modely

Imortalizované buněčné linie HNSCC

Před čtyřmi desetiletími byly popsány první protokoly pro ex vivo kultury buněk HNSCC . Po vyřešení předchozích překážek, jako je přerůstání fibroblastů a závislost na napájecích vrstvách, byly pomocí těchto protokolů úspěšně vytvořeny buněčné linie HNSCC. Od té doby byly kultivační techniky dále zdokonalovány a byly vytvořeny různé buněčné linie HNSCC stabilně rostoucí v mnoha pasážích. Podrobný popis všech dostupných buněčných linií HNSCC by přesahoval rámec tohoto přehledu. Rádi bychom proto čtenáře odkázali na dva předchozí přehledové články . Vzhledem k tomu, že imortalizované buněčné linie HNSCC lze snadno udržovat a rozšiřovat, byly široce využívány ke studiu genetických změn a biologických odpovědí na chemické a genetické perturbace, k identifikaci potenciálních molekulárních cílů a k vývoji nových nízkomolekulárních a biologických léčiv . V poslední době se objevily důkazy o tom, že tyto buněčné linie lze použít také ke studiu intratumorální heterogenity a klonální evoluce probíhající pod tlakem terapie . Údaje z těchto komplexních molekulárních a funkčních studií na těchto modelech byly shromážděny v knihovnách, jako je Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), které představují cenné úložiště rozmanitosti lidských nádorových onemocnění .

Ačkoli buněčné linie HNSCC pěstované ve dvourozměrných (2D) jednovrstvých kulturách jsou i nadále důležitými modely při hledání nových terapeutických přístupů k tomuto onemocnění, obecně trpí tím, že nemohou odrážet histologickou povahu, trojrozměrnou (3D) architekturu a strukturální a funkční rozdíly nádoru in vivo. Tato omezení významně ovlivňují vypovídací hodnotu in vitro studií hodnotících účinnost zavedených a nových léčebných modalit HNSCC v monovrstvých kulturách. Byly totiž zaznamenány pozoruhodné rozdíly v citlivosti 2D a 3D kultur z buněčných linií HNSCC na ozařování a léčbu léky, např. cisplatinou , cetuximabem a inhibitorem mTOR AZD8055 . Srovnávací molekulární analýza buněk rostoucích ve 2D versus 3D kulturách poskytla možná vysvětlení nižší citlivosti buněk ve 3D kulturách, jako je exprese a aktivace genů spojených s opravou DNA , a zvýšená úroveň exprese genů spojených s epiteliálně-mezenchymálním přechodem a kmenovostí v 3D podmínkách.

Genetická nestabilita a výskyt klonální selekce během kultivace in vitro jsou dalšími potenciálními omezeními nádorových buněčných linií a mohou vysvětlit, proč je často obtížné reprodukovat zjištění zahrnující buněčné linie. Komplexní analýza kmenů běžně používaných buněčných linií rakoviny prsu MCF7 a plic A549 totiž odhalila rozsáhlou genomickou variabilitu napříč kmeny, která byla spojena s rozdíly v biologicky významných buněčných vlastnostech. Důležité je, že když byly kmeny testovány proti 321 protinádorovým sloučeninám, byly pozorovány značně rozdílné reakce na léčiva, přičemž nejméně 75 % sloučenin některé kmeny silně inhibovalo, ale u jiných byly zcela neúčinné. Tato studie jasně podtrhuje naléhavou potřebu zdokonalených modelů ex vivo na podporu maximálně reprodukovatelného výzkumu rakoviny.

Pokročilé modely ex vivo HNSCC

Köpf-Maier a jeho kolegové jako první zavedli metodu, která umožnila lidským karcinomovým buňkám různých histologických jednotek včetně dlaždicobuněčných karcinomů (SCC) hltanu reorganizovat se in vitro do „organoidních struktur“ . Ukázali, že tyto organoidní kultury si zachovávají kritické vlastnosti stavu in vivo, jako je 3D architektura, růst heterogenních typů buněk z jednotlivého karcinomu a morfologická diferenciace za relativně jednoduchých experimentálních podmínek . V následné studii tatáž skupina prokázala, že tyto organoidní kultury lze použít k testování léčiv a že údaje o odpovědi, které z nich byly získány, se shodovaly s odpovědí pacientů na léčbu . Autoři jako první navrhli organoidní kultury jako personalizovanou platformu pro testování léčiv in vitro, která umožňuje předpovědět individuální chemosenzitivitu karcinomů během několika dnů .

Od té doby se zdokonalily techniky pěstování tkání in vitro ve 3D jako organotypové struktury. Byly vyvinuty protokoly pro vytvoření organoidů z dospělých a embryonálních kmenových buněk, které jsou schopny samoorganizace do 3D struktur odrážejících tkáň původu (přehled viz Clevers, 2016 ). První organoidní kultury odvozené z dospělých kmenových buněk byly založeny z myších střevních kmenových buněk, které byly umístěny do podmínek napodobujících střevní kmenovou niku . Bylo prokázáno, že podmíněné přeprogramování vyvolané přidáním R-spondinu-1, epidermálního růstového faktoru (EGF) a Nogginu do kultivačního média a vložením buněk do extraktu z bazálních membrán poskytujících extracelulární matrix stimuluje dospělé kmenové buňky k sebeobnově, proliferaci a tvorbě diferencovaných potomků připomínajících střevní epitel . Tato technika, původně vyvinutá pro studium infikované, zánětlivé a neoplastické tkáně z lidského gastrointestinálního traktu, byla použita nejen pro založení organoidních kultur z různých lidských normálních tkání, ale také z nádorové tkáně odvozené od pacienta. Tyto studie významně rozšířily a zkvalitnily soubor dostupných nádorových modelů.

Nejnověji byla několika nezávislými studiemi potvrzena první zjištění Köpf-Maiera a jeho kolegů o tom, že organoidní kultury HNSCC jsou vhodnou platformou pro testování léčiv in vitro. Ačkoli byly zaznamenány značné rozdíly v úspěšnosti založení primárních dlouhodobě rostoucích organoidních kultur z pacientů s HNSCC (30 % versus 65 % ), všechny dosavadní studie shodně popsaly, že organoidy si zachovávají mnoho vlastností původního nádoru, včetně intratumorální heterogenity , mutačního profilu a vzorců exprese proteinů. Kromě toho bylo prokázáno, že organoidy si při xenotransplantaci zachovávají svůj tumorigenní potenciál . Bylo zjištěno, že odpovědi na léčbu léčivy in vivo jsou podobné hodnotám IC50 vypočteným z organoidů pomocí testů citlivosti na léčiva in vitro Údaje o radiosenzitivitě z testování organoidů navíc korelovaly s klinickou odpovědí u pacientů . Důležité je, že na organoidních modelech lze studovat nejen účinky související s léčbou v nádorech, ale také nežádoucí vedlejší účinky léčby v normální tkáni. Například organoidy slinných žláz odvozené od pacientů byly použity pro pitvu molekulární podstaty hyposalivace, častého závažného vedlejšího účinku záření .

Další studie identifikovala primární 2D buněčné kultury z nádorů pacientů s HNSCC jako další cenný model HNSCC ex vivo . Individualizovaný rozsáhlý screening protinádorových léčiv zde reprodukovatelně identifikoval léčiva vykazující protinádorovou aktivitu v odpovídajících xenograftových modelech odvozených od pacientů (PDX), čímž poskytl další důkaz, že primární kultury HNSCC by mohly být použity k podpoře terapeutického rozhodování v běžném klinickém prostředí .

Organoidní kultury lidských normálních, dysplastických a maligních tkání jazyka byly rovněž použity k reprodukci hlavních kroků tumorigeneze jazyka . Histomorfometrické, imunohistochemické a elektronmikroskopické analýzy 3D kokultur primárních keratinocytů jazyka a fibroblastů v kolagenové matrici ukázaly, že stratifikační růst, buněčná proliferace a diferenciace byly srovnatelné mezi kokulturami a jejich příslušnými nativními tkáněmi, avšak značně se lišily u kultur pěstovaných bez fibroblastů . Tyto výsledky podporují předchozí studie ukazující důležitou roli nádorově asociovaných fibroblastů v patogenezi HNSCC . Tyto údaje spolu s rozsáhlými důkazy z literatury o nádorově podporujících účincích nádorového mikroprostředí (TME) důrazně hovoří pro budoucí využití pokročilejších preklinických modelů zahrnujících všechny hlavní složky TME. V současné době jsou k dispozici nové protokoly pro tvorbu organoidů obsahujících kromě stromálních buněk také imunitní buňky pacienta . Ačkoli tedy organoidní kultury mají svá omezení, jako je spotřeba značného množství času a zdrojů a zahrnutí nedefinovaných vnějších faktorů, které mohou ovlivnit výsledek experimentů (tabulka 1), mohou tyto kultury představovat vhodné modely pro vývoj a optimalizaci budoucích léčebných strategií včetně imunologických léčiv.

Zvířecí modely

Zvířecí modely rakoviny ústní dutiny indukované karcinogeny

Většina lidských SCC je známa jako vyvolaná chronickou expozicí karcinogenům. Zpočátku experimentální přístupy k vyvolání zhoubných nádorů dutiny ústní chemickou cestou vždy selhaly, protože sliznice dutiny ústní byla vůči působení chemických látek odolnější než kůže. Nakonec se pomocí 9, 10 dimethyl-1, 2, benzantracenu (DMBA) podařilo úspěšně indukovat HNSCC v křeččím lícním vaku jako zvířecím modelu . Podobně jako u pacientů probíhala karcinogeneze sliznice ve čtyřech po sobě jdoucích stadiích: hyperplazie, atypická hyperplazie, karcinom in situ a spinocelulární karcinom . Bylo však obtížné rozlišit mezi změnami epitelu způsobenými přímým kontaktem s karcinogenem a skutečnou premaligní transformací, protože změny byly u nádorů tváře vyvolaných DMBA přechodné a reverzibilní. Kromě toho nádory vyvolané DMBA neměly mnoho histologických znaků diferencovaného HNSCC a příliš se nepodobaly časným lidským lézím. A co je ještě důležitější, nádor se vyskytoval v křeččím lícním vaku, který představuje imunodeficitní oblast, jež se u lidí nevyskytuje, takže tento model příliš nenapodoboval lidský HNSCC. Ačkoli byl DMBA následně široce používán v modelech rakoviny dutiny ústní u křečků a potkanů, ukázalo se, že vyvolat karcinom dutiny ústní pomocí DMBA u myší je obtížné . Poté byl zaveden 4-nitrochinolin 1-oxid (4-NQO), ve vodě rozpustný derivát chinolonu, jako silný induktor nádorů dutiny ústní. Podávání 4-NQO s pitnou vodou nebo jeho lokální aplikace vedlo po dlouhodobé léčbě u potkaních i myších modelů k četným dysplastickým, preneoplastickým a neoplastickým lézím, přičemž tyto léze se velmi podobaly neoplastické transformaci v ústní dutině u lidí. Po několika modifikacích byl model standardizován Tangem a kol. , kteří prokázali, že podávání 4-NQO v pitné vodě myším C57BL/6 po dobu 16 týdnů podporuje karcinogenezi dutiny ústní s vysokou incidencí.

Když výše popsané zvířecí modely indukované karcinogenem rekapitulují sled událostí a typ lézí pozorovaných během lidské karcinogeneze, poskytují vynikající systém in vivo pro studium klíčových hybných událostí karcinogeneze dutiny ústní. Tyto modely byly také široce využívány pro vývoj strategií chemoprevence rakoviny, zatímco méně studií využilo tyto zvířecí modely k hodnocení účinnosti léčiv pro léčbu zavedených nádorů. Jedním z hlavních omezení jako platformy pro screening léčiv je prodloužená doba potřebná k dokončení hodnocení účinků testované sloučeniny (tabulka 1). Většina zvířecích modelů HNSCC indukovaných karcinogeny potřebuje až 40 týdnů k rozvoji plnohodnotného karcinomu a ještě déle, pokud je konečným cílem studie metastazování. V této souvislosti nabízí nedávná zpráva Wanga a kolegů potenciální zkratku pomocí xenograftu jazyka indukovaného buněčnou linií 4NQO jako alternativního účelnějšího syngenního myšího modelu .

Hlavní výhodou zvířecího modelu indukovaného 4NQO je jeho vhodnost pro studium účinků karcinogenních a genetických faktorů v tumorigenezi, zejména v imunokompetentním prostředí. Poskytuje tak vhodnou platformu pro urychlení vývoje imunoterapeutických režimů u HNSCC . Tento model byl také úspěšně použit ke zkoumání role domnělých nádorových kmenových buněk v rezistenci na léčbu, recidivě a metastazování. Byl prokázán jeho potenciál pro vývoj nových léčebných strategií zaměřených nejen na proliferativní nádorovou masu, ale také na relativně klidnou subpopulaci nádorových kmenových buněk .

Geneticky upravené myší modely

Když k poškození DNA chemickými látkami dochází náhodně, podle teorie evoluce nádorů po náhodném získání mutací v celém genomu následuje selekce klonů nesoucích genetické změny, které usnadňují přežití a proliferaci buněk. Studie molekulárního profilování identifikovaly několik předpokládaných řídicích genů, které přispívají k rozvoji rakoviny u HNSCC. Tyto molekulární studie však neposkytly přímý důkaz kauzality ani podrobný vhled do biologických mechanismů, kterými tyto geny řídí vývoj nádoru. Ačkoli zvířecí modely indukované karcinogeny mohou věrně napodobovat heterogenní krajinu genomických změn v lidských primárních nádorech , pouze zlomek těchto mutací řídí nádorové bujení tím, že ovlivňuje onkogeny nebo tumor supresorové geny, ale mnoho mutací je cestujících bez jasného příspěvku k rozvoji nádoru. Tyto studie také neodhalují, zda jsou ovladače nezbytné pro udržení nádoru, a proto mohou mít omezený význam pro navrhování účinných terapeutických strategií. Naproti tomu preklinické modelové systémy, jako jsou geneticky upravené myší modely (GEMM), poskytují experimentálně schůdný přístup, v němž lze podrobně studovat biologické účinky specifických mutací na kontrolovaném genetickém pozadí. V následujících kapitolách popisujeme klíčové poznatky z předchozích studií založených na GEMM u HNSCC.

Dosud bylo popsáno jen málo GEMM spojených se spontánní tvorbou HNSCC bez chronické expozice karcinogenům (tabulka 2). Geneticky upravený myší model rakoviny dutiny ústní poprvé představili Schreiber a kolegové . Po zkřížení myší transgenních pro gen v-Ha-ras s transgenními myšmi, které nesly E6/E7 lidského papiloma viru (HPV)-16, byl pozorován vznik nádorů v ústech, uchu a oku počínaje přibližně 3 měsíci věku . Do 6 měsíců se u 100 % bi-transgenních zvířat objevily nádory v ústech, zatímco výskyt v obou jednotransgenních skupinách byl 0 % . Předpoklad druhého genetického zásahu pro nádorové bujení byl rovněž zaznamenán u transgenního modelu K-rasG12D, v němž byla pro cílení endogenního lokusu K-ras použita tamoxifenem indukovaná Cre rekombináza pod kontrolou promotoru keratinu-14 (K14) . V modelu s jedním transgenem byly po 1 měsíci léčby tamoxifenem pozorovány pouze velké papilomy v ústní dutině a hyperplazie v jazyce . Pokud však byly myši zkříženy s myší s podmíněným knockoutem floxovaného p53, vyvinuly se u 100 % kombinovaných myší karcinomy jazyka již 2 týdny po indukci tamoxifenem . Vedle exprese virových onkogenů E6/E7 a ztráty TP53 byly jako druhé genetické hity identifikovány homozygotní delece transkripčního faktoru krüppel-like-factor 4 (KLF4) a heterozygotní delece SMAD4 , které v součinnosti s onkogenní řídící mutací podporují vznik nádorů dutiny ústní s vysokou prevalencí (tabulka 2).

Přes rekapitulaci progrese HNSCC zůstává vhodnost výše popsaných modelů HNSCC jako platformy pro zkoumání nových molekulárních cílených léčebných přístupů poněkud sporná vzhledem k tomu, že genetické změny řídící tumorigenezi u těchto zvířat se u pacientů s HNSCC nevyskytují nebo jen zřídka. Celkově byly mutace HRAS a KRAS zjištěny pouze u 6 a 0,2 % pacientů s HNSCC a homozygotní delece KLF4 a SMAD4 u 0 a 4 % případů. V kohortě The Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC navíc nebyly identifikovány případy nesoucí jeden ze složených genotypů náchylných k nádorům GEMM popsaných výše . GEMM spontánního HNSCC, který se více podobá molekulárním rysům lidského onemocnění, by mohl být model s jediným vyřazeným genem SMAD4 v epitelu hlavy a krku (HN-Smad4del/del), který uvedli Bornstein a kolegové . Ačkoli je homozygotní delece vzácná, heterozygotní ztráta SMAD4 je skutečně detekována u 30-35 % primárních HNSCC spojených se snížením hladiny exprese Smad4 . Nedávno byla zaznamenána významná intratumorální heterogenita ztráty SMAD4 u primárních nádorů HNSCC . Je zajímavé, že v ex vivo kulturách odvozených z PDX subpopulace buněk vykazující heterozygotní ztrátu SMAD4 delecí nebo sníženou expresí předčila buňky s divokým genotypem SMAD4 z rodičovského nádoru, což naznačuje výhodu buněk s deficitem Smad4 v přežití . Na další podporu vhodnosti tohoto single-knockout GEMM vykazoval HNSCC z HN-Smad4del/del myší zvýšenou genomickou nestabilitu , která korelovala se sníženou expresí a funkcí genů kódujících proteiny v dráze opravy DNA Fanconiho anémie/BRCA , která je rovněž spojena s náchylností k HNSCC u lidí . Navíc jak normální tkáň hlavy a krku, tak HNSCC z myší HN-Smad4del/del vykazovaly silný zánět, který byl rovněž spojen s patogenezí u lidí, kde ústní bakterie a zánětlivé mediátory spojené s parodontálním onemocněním mohou být kofaktory při iniciaci a podpoře ústního SCC .

Od původní zprávy z roku 2009 se model HN-Smad4del/del používá k podrobné analýze molekulárních procesů zapojených do tumorigeneze HNSCC. Pokud je nám známo, nebyl dosud využit pro vývoj nových terapeutických strategií. Toto omezení lze vysvětlit průměrnou dobou vzniku nádoru v tomto modelu, která činí 40 týdnů, což je podobné omezení jako u zvířecích modelů rakoviny dutiny ústní vyvolaných karcinogenem (tabulka 2). Začlenění kancerogenní léčby k urychlení tvorby nádorů u GEMM s jedním transgenem by tak mohlo představovat vhodný způsob, jak toto omezení vyřešit, jak již bylo úspěšně prokázáno ve studiích GEMM nesoucích deleci v tumor supresorovém genu (GRHL3 , PTEN ) nebo nadměrně exprimujících onkogenní mikroRNA (tabulka 1).

Patient-derived xenograft modely

Vývoj a zdokonalení těžce imunodeficitních myších kmenů pozoruhodně zvýšil dostupnost PDX modelů pro výzkum rakoviny. Úspěšné vytvoření PDX modelů HNSCC bylo zaznamenáno několika výzkumnými skupinami . V naší vlastní sérii byla pozorována celková míra přihojení 48 % , avšak míra přihojení se zřejmě do značné míry lišila mezi jednotlivými podskupinami pacientů . Limitující faktory pro přihojení nebyly dosud jasně identifikovány. Zdá se, že místo implantace a kmeny myší ovlivňují míru přijetí. Kromě toho jsou patologické rizikové faktory, jako je histologie nádoru a stav HPV, důležitými determinanty tvorby PDX. Obecně platí, že nediferencované HPV negativní nádory vykazující agresivní růst mají větší pravděpodobnost přihojení. V souladu s tím byla míra a kinetika přihojení PDX spojena s nepříznivou prognózou pacientů . Na rozdíl od HPV negativních nádorů se HPV asociované nádory HNSCC často neštěpí. Vzhledem k tomu, že tyto nádory rostou v imunitně asociovaných místech, jako jsou tonzily nebo báze jazyka, nese jejich transplantace imunodeficitním myším, kterým chybí imunologická kontrola virově infikovaných buněk, riziko společného přenosu B-buněk pozitivních na virus Epsteina-Barrové (EBV). V důsledku toho často dochází k nekontrolované proliferaci B-buněk a transformaci v EBV+ lymfom . Vzhledem k tomu, že míra proliferace těchto umělých lymfomů je mnohem vyšší než proliferace nádorových buněk v transplantovaných fragmentech tkáně SCC, dochází často k přerůstání původních nádorových transplantátů . Proto je pro potvrzení histologie dlaždicobuněčného karcinomu modelu nezbytná histopatologická validace PDX certifikovaným patologem.

Otázkou, nakolik se PDX podobají primárnímu nádoru pacienta, se zabývalo mnoho skupin. Jak bylo prokázáno u jiných nádorových jednotek, zavedené modely HNSCC na myších vykazují histopatologické znaky jako původní nádor pacienta . Komplexní genetická analýza primárních nádorů a odvozených modelů PDX pomocí sekvenování nové generace odhalila podobné vzorce a alelické frekvence molekulárních aberací . Korelace mezi mutačními profily původních nádorů a odvozených modelů byla významně vyšší u PDX (R = 0,94) ve srovnání s buněčnými liniemi (R = 0,51) . Analýza metylomu rovněž prokázala vysokou shodu mezi PDX a nádory pacientů. V důsledku transplantace nádorů do myší totiž došlo k významným metylačním změnám v průměru pouze u 2,7 % analyzovaných míst CpG . Studie genové exprese navíc ukázaly celkovou příbuznost rodičovských nádorů s jejich PDX, což potvrdilo jejich společné shlukování v neřízené hierarchické shlukové analýze . Na rozdíl od přibývajících důkazů o shodě genomových a transkriptomových profilů mezi PDX a primárními HNSCC existuje jen málo údajů o expresi proteinů. První předběžná analýza tkáně PDX pomocí reverzně fázové proteinové array (RPPA) odhalila proteinové profily srovnatelné s údaji o expresi proteinů HNSCC TCGA , což naznačuje podobnost mezi původní tkání a odvozeným modelem i na této úrovni.

Klíčovým rysem PDX je zachování stromálního kompartmentu. I když je lidské stroma během prvních pasáží nahrazeno myším, integrované stroma zůstává zachováno, což umožňuje hodnocení sloučenin cílených na tento kompartment nebo vzájemné ovlivňování mezi stromálním kompartmentem a nádorovými buňkami. Nádory pěstované v myších dále vytvářejí vlastní nádorovou vaskulaturu, což nabízí možnost hodnocení angiogenní sítě a interference se sloučeninami zaměřenými na angiogenezi. Po vytvoření modelu lze nádory vypěstované v myších odebrat, vitálně zmrazit a v případě potřeby rozmrazit a znovu transplantovat myším. Celkově lze PDX považovat za vhodnou metodu pro expanzi nádorové tkáně a slibný preklinický modelový systém pro mechanistické studie a vývoj terapeutických strategií.

S nedávným nástupem imunoterapie do algoritmu léčby mnoha typů rakoviny včetně HNSCC se nedostatek funkčního imunitního prostředí v PDX stal hlavní překážkou, kterou je třeba překonat. K zavedení imunitního systému u imunodeficitních myší byly navrženy různé strategie. V přelomové studii Mosiera a jeho kolegů bylo prokázáno, že injekce lidských periferních mononukleárních buněk (PBMC) vedla ke stabilní dlouhodobé rekonstituci funkčního lidského imunitního systému u myší s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID). Přenosem PBMC pacienta do myší nesoucích PDX tak bylo možné vytvořit imunoproficientní modely PDX. Při tomto přístupu však chybí správný vývoj imunitních buněk a priming T-buněk, což vede k absenci určitých linií lidských imunitních buněk u myší . Následně vyvinuté sofistikovanější protokoly imunitní rekonstituce jsou založeny na přenosu lidských CD34+ kmenových buněk do NSG myší a také na implantaci lidského fetálního brzlíku a jaterní tkáně pod ledvinové pouzdro těchto myší . Tento přístup vedl k dlouhodobému přihojení a systémové rekonstituci kompletního lidského imunitního systému včetně multilineárních lidských imunitních buněk sestávajících z T-, B-, NK-, dendritických buněk a makrofágů . Bohužel tato metoda není proveditelná pro velký počet PDX vzhledem ke složitosti modelu. Slibnější postup byl navržen u melanomu, kde byly T lymfocyty infiltrující nádor (TIL) izolované z nádorové tkáně použité pro tvorbu PDX expandovány in vitro lidským interleukinem 2 (IL2) před injekcí do myší PDX nesoucích nádor .

Potenciál modelů PDX pro vedení léčby pacientů

Cena PDX pro vedení individuálního rozhodnutí o léčbě pacienta musí být ještě objasněna. Obecně platí, že korelace mezi pacienty a PDX u různých nádorových entit porovnávající léčebné odpovědi mezi myšmi a pacienty byly provedeny na základě retrospektivních údajů o klinických výsledcích. Pokud je nám známo, žádné takové srovnání při dostatečně velkém vzorku nebylo provedeno u HNSCC. Překážky pro vhodnost takových přístupů zahrnují dávkování léčiva u myší, které obvykle odráží maximální tolerovanou dávku, variabilitu dávek v rámci různých myších kmenů a zejména definici klinicky významného koncového bodu. V klinickém prostředí se odpověď nádoru určuje podle RECIST. U myší se pro stanovení účinnosti léčby jednotlivými léčivy používá velmi různorodý soubor možných koncových bodů, včetně regrese nádoru vyjádřené jako relativní inhibice růstu, objemu nádoru ve srovnání s kontrolní skupinou, inhibice růstu nádoru a doby do konečného bodu. Dalšími obecnými omezeními modelu jsou vysoké náklady na vytvoření PDX, různá míra přihojení a doba od první transplantace po výsledky screeningu léčby. V naší rozsáhlé sbírce téměř 80 modelů HNSCC PDX se nám zatím nepodařilo stanovit prediktivní hodnotu odpovědi nádoru na léčivo v xenotransplantačním modelu. Přesto několik společností inzeruje PDX jako nástroj pro predikci léčebné odpovědi. V roce 2016 zahájila společnost Champions Oncology studii proveditelnosti (NCT02752932) s cílem prozkoumat prediktivní hodnotu PDX. Bohužel dosud nebyly zveřejněny žádné výsledky.

Hlavní nevýhodou PDX je delší doba potřebná k založení a rozšíření modelu ve srovnání s organoidy, což snižuje pravděpodobnost jejich budoucího využití jako platformy pro individuální screening léčiv v klinické rutině. Kromě toho by se u organoidů mělo mnohem snadněji než u myších xenograftových modelů dosáhnout opětovného osazení složkami TME odvozenými od pacienta, které v obou modelech vytvořených podle současných protokolů chybí. To umožní zahrnout protinádorové terapie ovlivňující TME (např. everolimus, bevacizumab, protilátky anti-PD-1/PD-1 L) do budoucích screeningových přístupů ex vivo.

.