Alai

Abstrakt

Sepse je systémová odpověď na infekci mikrobiálními organismy. Diferenciální diagnostika infekce způsobené buď bakteriemi, nebo jinými mikrobiálními organismy je nezbytná pro účinnou léčbu a posouzení prognózy. Současné klinické laboratorní metody v diagnostice bakteriálních infekcí jsou buď nespecifické, nebo vyžadují delší dobu zpracování. Prokalcitonin (PCT) je biomarker, který vykazuje větší specifičnost než jiné prozánětlivé markery (např. cytokiny) při identifikaci pacientů se sepsí a může být použit při diagnostice bakteriálních infekcí. V tomto článku podáváme přehled současných poznatků o PCT a jeho využití v klinické laboratoři.

Důležitou oblastí vývoje v klinické laboratoři je určení, zda je příčina zánětu u pacientů bakteriálního původu. K diagnostice sepse bylo použito několik klinických laboratorních testů.1 Metoda bujónové kultivace je zlatým standardem pro diagnostiku bakteriální infekce, ale definitivní výsledek může trvat 24 hodin nebo déle, než je diagnóza definitivní. V diagnostice zánětu a infekce se uplatňuje řada zánětlivých markerů, jako je počet leukocytů, C reaktivní protein (CRP) a cytokiny (TNF-α, IL-1β nebo IL-6), ale jejich nedostatečná specifičnost vyvolala trvalý zájem o vývoj specifičtějších klinických laboratorních testů.2 Jedním ze slibných markerů je prokalcitonin (PCT), jehož koncentrace je u sepse zvýšená. Díky své specifičnosti pro bakteriální infekce byl PCT navržen jako relevantní marker pro rychlou diagnostiku bakteriální infekce, zejména pro použití na odděleních urgentního příjmu nemocnic a na jednotkách intenzivní péče. Od jeho identifikace a spojení se sepsí v 90. letech 20. století bylo provedeno velké množství studií zahrnujících PCT a jeho klinické použití. Test na stanovení hladiny PCT je v Evropě k dispozici již několik let a nedávno byl schválen FDA pro použití ve Spojených státech.3

Biochemie PCT

Procalcitonin je peptid o 116 aminokyselinách, který má přibližnou MW 14,5 kDa a patří do superrodiny peptidů kalcitoninu (CT). Lze jej rozdělit na 3 části zahrnující aminoterminální oblast PCT, nezralý kalcitonin a kalcitoninový karboxylový terminální peptid-1 (CCP-1, nazývaný také katakalcin) (obr. 1).4 Prokalcitonin je kódován genem CALC-1 umístěným na 11. chromozomu. Štěpením v 1 místě primárního transkriptu genu CALC-1 vzniká pre-PCT, který dále podléhá proteolytickému štěpení své signální sekvence za vzniku PCT.5,6 Mezi další členy superrodiny peptidů CT patří peptid související s kalcitoninovým genem I, II (CGRP-I, CGRP-II), amylin a adrenomedullin. Peptid I související s kalcitoninovým genem je rovněž kódován genem CALC-1 a vzniká alternativním sestřihováním primárního transkriptu mRNA CALC-1. Peptid II související s kalcitoninovým genem, amylin a adrenomedulin jsou kódovány jinými geny (tabulka 1).

Exprese kalcitoninu probíhá tkáňově specifickým způsobem. V nepřítomnosti infekce je transkripce genu CALC-1 pro PCT v non-neuroendokrinní tkáni potlačena, s výjimkou C buněk štítné žlázy, kde jeho exprese produkuje PCT, prekurzor CT u zdravých a neinfikovaných jedinců.5 Syntetizovaný PCT pak prochází posttranslačním zpracováním za vzniku malých peptidů a zralého CT, který vzniká v důsledku odstranění C-koncového glycinu z nezralého CT pomocí peptidylglycin α-amidující monooxygenázy (PAM).7 Zralý CT je uložen v granulích sekretů a je vylučován do krve za účelem regulace koncentrace vápníku. V přítomnosti mikrobiální infekce exprimují gen CALC-1 i jiné než neuroendokrinní tkáně a produkují PCT. Mikrobiální infekce vyvolává podstatné zvýšení exprese genu CALC-1 ve všech parenchymových tkáních a diferencovaných typech buněk v těle produkujících PCT.8 Jeho hladiny se ve srovnání s jinými parametry mikrobiálních infekcí významně zvyšují u závažných systémových infekcí.9 Funkce PCT syntetizovaného v non-neuroendokrinních tkáních při mikrobiální infekci je v současné době nejasná; jeho detekce však pomáhá v diferenciální diagnostice zánětlivých procesů.

Přehled sepse

Sepse označuje systémovou reakci na infekci mikrobiálními agens, jako jsou bakterie, plísně a kvasinky, kdy se u pacienta typicky objevuje horečka, tachykardie, tachypnoe a leukocytóza. Mikrobiologické kultivace z krve nebo z místa infekce jsou často, i když ne vždy, pozitivní. Těžká sepse je spojena s hypoperfuzí nebo dysfunkcí alespoň 1 orgánu. Pokud je těžká sepse doprovázena hypotenzí nebo selháním více orgánových systémů, označuje se tento stav jako septický šok. Epidemiologické studie uvádějí výskyt přibližně 750 000 případů sepse ročně ve Spojených státech.10 Příznaky a symptomy sepse jsou velmi variabilní a jsou ovlivněny mnoha faktory, včetně virulence a bioburzy patogenu, portálu vstupu a vnímavosti hostitele. Primárním místem vzniku sepse jsou infekce dýchacích cest, následují infekce močopohlavního ústrojí a gastrointestinální infekce.11 V poslední době přibývá zpráv o bakteriálních infekcích hospitalizovaných pacientů v důsledku zvýšeného počtu nozokomiálních infekcí z katetrizační a imunosupresivní terapie, kromě zvýšeného počtu příčin výskytu zlatého stafylokoka rezistentního na meticilin (MRSA).11 Rozlišení zánětu způsobeného bakteriální, jinou mikrobiální infekcí nebo rejekcí orgánu je důležité při léčbě imunitní reakce u hospitalizovaných pacientů. Častým problémem v klinické praxi je, že příznaky bakteriálních a virových infekcí se značně překrývají, zejména u infekcí dýchacích cest. Občas přetrvává diagnostická nejistota, a to i po získání anamnézy, provedení fyzikálního vyšetření, rentgenového vyšetření hrudníku a laboratorních testů. Laboratorní test s větší specifičností by tedy v těchto případech výrazně zlepšil klinickou diferenciální diagnostiku. Kromě toho by diferenciální diagnóza infekce pomohla při rozhodování, zda by byla prospěšná léčba antibiotiky. V této souvislosti je přibližně 75 % všech dávek antibiotik předepisováno na akutní respirační infekce, které mají převážně virovou etiologii.5 Nadměrné užívání antibiotik je hlavní příčinou šíření bakterií rezistentních vůči antibiotikům. Snížení používání antibiotik je tedy nezbytné v boji proti nárůstu mikroorganismů rezistentních vůči antibiotikům.

Diagnostické metody sepse

Tradiční metoda diagnostiky sepse zahrnuje kultivaci vzorků krve, moči, mozkomíšního moku (CSF) nebo bronchiální tekutiny a obvykle trvá 24 až 48 hodin. Bohužel se klinické příznaky často projeví i bez pozitivní kultivace. Tradiční klinické příznaky infekce a rutinní laboratorní testy na sepsi, jako je CRP nebo počet leukocytů, postrádají diagnostickou přesnost a někdy jsou zavádějící. U těžkých infekcí je většina klasických prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF-α, IL-1β nebo IL-6, zvýšena pouze krátkodobě nebo přerušovaně, pokud vůbec. Vzhledem k výše uvedeným diagnostickým a terapeutickým dilematům má jednoznačnější test pro diferenciální diagnostiku infekce a sepse zásadní význam.

Měření PCT v diagnostice bakteriálních infekcí

Od poloviny 90. let 20. století se stále častěji používá měření PCT při identifikaci systémových bakteriálních infekcí.3 Krátký poločas rozpadu (25-30 hodin v plazmě) PCT spolu s jeho faktickou absencí ve zdraví a specifičností pro bakteriální infekce mu dává jasnou výhodu oproti ostatním markerům bakteriální infekce.3,4 Studie také ukázaly, že zvýšení hladiny PCT je u virových infekcí minimální, zatímco po jednorázové injekci endotoxinu se hladina rychle zvyšuje.12,13 Zvýšení PCT navíc není spojeno se specifickými bakteriálními kmeny, ačkoli ve studii Rowthera a kolegů byly identifikovány a uvedeny kmeny od septických pacientů s hladinou PCT v séru >2 ng/ml.14 Jacquot a kolegové nedávno prokázali, že rychlé měření PCT může pomoci vyloučit nozokomiální infekci u novorozenců hospitalizovaných na jednotkách intenzivní péče.15

V jiné studii de Jager a kolegové zkoumali význam měření hladin PCT v krvi pacientů infikovaných komunitní pneumonií (CAP) způsobenou bakterií Legionella pneumophila ve srovnání s jinými běžnými parametry, jako je CRP a počet WBC.16 Zjistili, že počáteční vysoké hladiny PCT svědčí o závažnějším průběhu onemocnění, což se projevilo delším pobytem pacienta na jednotce intenzivní péče (JIP) a/nebo úmrtím v nemocnici. Navíc trvale zvýšené hladiny PCT vždy svědčily o nepříznivém výsledku. Stanovení hladin PCT tak poskytlo cenné informace o prognóze pacienta, které nebylo možné určit z běžných zánětlivých parametrů, jako je CRP a počet WBC. Navíc se ukázalo, že použití měření PCT k efektivní léčbě pacientů antibiotiky zkracuje dobu hospitalizace pacientů. Kristoffersen a jeho kolegové uvedli, že u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí zkrátilo jednorázové stanovení PCT v séru při přijetí průměrnou délku pobytu ze 7,1 dne na 4,8 dne.17

Měření PCT

Prokalcitonin lze měřit pomocí kvantitativního homogenního testu (BRAHMS, Hennigsdorf, Německo). Test je založen na technologii TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) (obrázek 2). Dusíkový laser o vlnové délce 337 nm je namířen na vzorek obsahující PCT a 2 fluorescenčně značené protilátky rozpoznávající různé epitopy peptidu PCT. Princip testu je založen na přenosu nezářivé energie mezi „donorovými“ a „akceptorovými“ molekulami. Donorová molekula po excitaci vyzařuje dlouhodobý fluorescenční signál v rozsahu milisekund při vlnové délce 620 nm, zatímco akceptorová molekula po excitaci vyzařuje krátkodobý signál v rozsahu nanosekund při vlnové délce 665 nm. Když se obě molekuly dostanou do těsné blízkosti vazbou na PCT, výsledný signál se zesílí při 665 nm a prodlouží se na několik mikrosekund. Toto prodloužení zajišťuje, že signál lze měřit i po odeznění fluorescence pozadí (běžné v biologických vzorcích). V testu BRAHMS je donorovou molekulou polyklonální ovčí protilátka značená Europium Cryptate, která rozpoznává epitopy v nezralé oblasti CT, zatímco akceptorovou molekulou je monoklonální protilátka značená XL665, která je namířena proti oblasti CCP-1 PCT.18,19