Alai

Kronaviry způsobily v posledních dvou desetiletích dvě rozsáhlé pandemie, SARS a blízkovýchodní respirační syndrom (MERS)8,9. Obecně se předpokládá, že SARSr-CoV – který se vyskytuje hlavně u netopýrů – by mohl v budoucnu způsobit vypuknutí nemoci10,11. Zde uvádíme sérii případů způsobených neidentifikovaným ohniskem pneumonie ve městě Wuhan v provincii Hubei ve střední Číně. Toto ohnisko onemocnění – které začalo na místním trhu s mořskými plody – se značně rozrostlo a k 26. lednu 202012 nakazilo v Číně 2 761 osob, je spojeno s 80 úmrtími a vedlo k nákaze 33 osob v dalších 10 zemích. Typickými klinickými příznaky těchto pacientů jsou horečka, suchý kašel, dýchací obtíže (dyspnoe), bolest hlavy a zápal plic. Nástup onemocnění může vyústit v progresivní respirační selhání v důsledku poškození alveolů (pozorované na příčných snímcích počítačové tomografie hrudníku) a dokonce v úmrtí. Onemocnění bylo klinickými lékaři určeno jako způsobené virem vyvolanou pneumonií podle klinických příznaků a dalších kritérií, včetně zvýšení tělesné teploty, poklesu počtu lymfocytů a bílých krvinek (ačkoli hladiny bílých krvinek byly někdy normální), nových plicních infiltrátů na rentgenografii hrudníku a žádného zjevného zlepšení po třídenní léčbě antibiotiky. Zdá se, že většina prvních případů byla v minulosti v kontaktu s původním trhem s mořskými plody; nyní se však onemocnění přeneslo z člověka na člověka.

Vzorky od sedmi pacientů s těžkým zápalem plic (šest z nich jsou prodavači nebo doručovatelé z trhu s mořskými plody), kteří byli na začátku epidemie hospitalizováni na jednotce intenzivní péče nemocnice Wuhan Jin Yin-Tan, byly zaslány do laboratoře ve Wuhanském virologickém institutu (WIV) za účelem diagnostiky původce nákazy (tabulka rozšířených údajů 1). Jako laboratoř vyšetřující CoV jsme k testování těchto vzorků nejprve použili pan-CoV PCR primery13 vzhledem k tomu, že k epidemii došlo v zimě a na trhu – ve stejném prostředí jako u infekcí SARS. Zjistili jsme, že pět vzorků bylo PCR pozitivních na CoV. Jeden vzorek (WIV04), odebraný z tekutiny z bronchoalveolární laváže (BALF), byl analyzován metagenomickou analýzou pomocí sekvenování nové generace s cílem identifikovat potenciální etiologické agens. Z celkového počtu 10 038 758 čtení – z nichž bylo po odfiltrování čtení z lidského genomu zachováno celkem 1 582 čtení – odpovídalo 1 378 (87,1 %) sekvencí sekvenci SARSr-CoV (obr. 1a). Sestavením de novo a cílenou PCR jsme získali genom 29 891 párů CoV, který měl 79,6% sekvenční identitu se SARS-CoV BJ01 (přístupové číslo GenBank AY278488.2). Vysokého pokrytí genomu bylo dosaženo přemapováním celkových čtení na tento genom (Extended Data Fig. 1). Tato sekvence byla odeslána do GISAID (https://www.gisaid.org/) (přístupové číslo EPI_ISL_402124). Podle názvu, který mu dala Světová zdravotnická organizace (WHO), jej předběžně nazýváme nový koronavirus 2019 (2019-nCoV). Následně byly pomocí sekvenování nové generace a PCR získány další čtyři sekvence genomu viru 2019-nCoV v plné délce (WIV02, WIV05, WIV06 a WIV07) (přístupová čísla GISAID EPI_ISL_402127-402130), které byly vzájemně identické z více než 99,9 %, od dalších čtyř pacientů (tabulka 2 rozšířených údajů).

Genom viru se skládá ze šesti hlavních otevřených čtecích rámců (ORF), které jsou společné koronavirům, a řady dalších akcesorních genů (obr. 1b). Z další analýzy vyplývá, že některé z genů 2019-nCoV sdílely méně než 80% identitu nukleotidových sekvencí s genem SARS-CoV. Aminokyselinové sekvence sedmi konzervovaných domén replikázy v ORF1ab, které byly použity pro klasifikaci druhu CoV, však byly mezi 2019-nCoV a SARS-CoV shodné z 94,4 %, což naznačuje, že oba viry patří ke stejnému druhu, SARSr-CoV.

Poté jsme zjistili, že krátká oblast RNA-dependentní RNA polymerázy (RdRp) z netopýřího koronaviru (BatCoV RaTG13) – který byl dříve zjištěn u Rhinolophus affinis z provincie Yunnan – vykazuje vysokou sekvenční identitu s 2019-nCoV. U tohoto vzorku RNA jsme provedli sekvenování v plné délce (přístupové číslo GISAID EPI_ISL_402131). Simplotova analýza ukázala, že virus 2019-nCoV je v celém genomu velmi podobný viru RaTG13 (obr. 1c) s celkovou sekvenční identitou genomu 96,2 %. Pomocí zarovnaných sekvencí genomů 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV a dříve popsaných netopýřích SARSr-CoV nebyly v genomu 2019-nCoV zjištěny žádné důkazy o rekombinačních událostech. Fylogenetická analýza genomu v plné délce a sekvencí genů RdRp a spike (S) ukázala, že – pro všechny sekvence – RaTG13 je nejbližším příbuzným 2019-nCoV a tvoří odlišnou linii od ostatních SARSr-CoV (obr. 1d a rozšířená data obr. 2). Protein hrotu vázajícího receptor kódovaný genem S byl vysoce odlišný od ostatních CoV (Extended Data Fig. 2), s méně než 75% identitou nukleotidové sekvence se všemi dříve popsanými SARSr-CoV, s výjimkou 93,1% identity nukleotidů s RaTG13 (Extended Data Table 3). Geny S u 2019-nCoV a RaTG13 jsou delší než u ostatních SARSr-CoV. Hlavními rozdíly v sekvenci S genu 2019-nCoV jsou tři krátké inserce v N-koncové doméně a také změny čtyř z pěti klíčových zbytků v receptorovém vazebném motivu ve srovnání se sekvencí SARS-CoV (Extended Data Obr. 3). Je třeba dále studovat, zda inserce v N-koncové doméně S proteinu 2019-nCoV propůjčují aktivitu vázající sialové kyseliny, jako je tomu u MERS-CoV. Blízký fylogenetický vztah k RaTG13 poskytuje důkaz, že 2019-nCoV mohl vzniknout u netopýrů.

Rychle jsme vyvinuli metodu detekce založenou na qPCR na základě sekvence receptorově vazebné domény S genu, která byla nejvíce variabilní oblastí genomu (obr. 1c). Naše údaje ukazují, že primery dokázaly odlišit virus 2019-nCoV od všech ostatních lidských koronavirů včetně netopýřího viru SARSr-CoV WIV1, který má se SARS-CoV společnou 95% identitu (rozšířená data, obr. 4a, b). Ze vzorků získaných od sedmi pacientů jsme zjistili, že šest vzorků BALF a pět vzorků výtěru z ústní dutiny bylo při prvním odběru pozitivních na 2019-nCoV, jak bylo vyhodnoceno pomocí qPCR a konvenční PCR. V ústních výtěrech, análních výtěrech a vzorcích krve odebraných těmto pacientům během druhého odběru jsme však již virus pozitivní nedetekovali (obr. 2a). Pro rutinní detekci viru 2019-nCoV však doporučujeme použít jiné cíle qPCR, včetně RdRp nebo obalových genů (E). Na základě těchto zjištění předpokládáme, že by se onemocnění mohlo přenášet vzdušnou cestou, ačkoli nemůžeme vyloučit jiné možné cesty přenosu, protože je zapotřebí dalšího šetření, včetně většího počtu pacientů.

Pro sérologickou detekci 2019-nCoV jsme použili dříve vyvinutý nukleokapsidový (N) protein z netopýřího SARSr-CoV Rp3 jako antigen pro enzymatické imunosorbentní testy (ELISA) IgG a IgM, protože tento protein měl 92% aminokyselinovou identitu s N proteinem 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) a nevykazoval žádnou zkříženou reaktivitu proti jiným lidským koronavirům s výjimkou SARSr-CoV7. Od sedmi pacientů s virovou infekcí se nám podařilo získat pouze pět vzorků séra. U jednoho pacienta (ICU-06) jsme sledovali hladiny virových protilátek 7, 8, 9 a 18 dní po začátku onemocnění (Extended Data Table 2). Byl pozorován jasný trend u titrů IgG a IgM, které se v průběhu času zvyšovaly, s výjimkou toho, že titr IgM byl v posledním vzorku snížen (obr. 2b). Jako druhou analýzu jsme testovali vzorky od 5 ze 7 pacientů pozitivních na virus přibližně 20 dní po začátku onemocnění na přítomnost virových protilátek (Extended Data Tables 1, 2). Všechny vzorky pacientů – nikoli však vzorky zdravých jedinců – byly silně pozitivní na virové IgG (obr. 2b). Byly také tři vzorky pozitivní na IgM, což svědčí o akutní infekci.

Příště jsme úspěšně izolovali virus (nazvaný 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) z buněk Vero E6 i Huh7 pomocí vzorku BALF pacienta ICU-06. Virus byl izolován z buněk Vero E6 i Huh7. Po třídenní inkubaci byly v buňkách pozorovány jasné cytopatogenní účinky (Extended Data Fig. 6a, b). Identita kmene WIV04 byla v buňkách Vero E6 ověřena imunofluorescenční mikroskopií s použitím zkříženě reaktivní virové protilátky N (Extended Data Fig. 6c, d) a metagenomickým sekvenováním, jehož většina čtení byla mapována na 2019-nCoV, a analýza qPCR ukázala, že virová nálož se od 1. do 3. dne zvýšila (Extended Data Fig. 6e, f). Virové částice v ultratenkých řezech infikovaných buněk vykazovaly typickou morfologii koronaviru, jak bylo vizualizováno elektronovou mikroskopií (Extended Data Fig. 6g). Abychom dále potvrdili neutralizační aktivitu virových IgG-pozitivních vzorků, provedli jsme sérové neutralizační testy v buňkách Vero E6 s použitím pěti pacientských sér, která byla IgG-pozitivní. Prokázali jsme, že všechny vzorky byly schopny neutralizovat 100 TCID50 (50 % infekční dávky tkáňové kultury) 2019-nCoV v ředění 1:40-1:80. Ukázali jsme také, že tento virus by mohl být zkříženě neutralizován koňským anti-SARS-CoV sérem (dar od L.-F. Wanga) v ředění 1:40; potenciál zkřížené reaktivity s protilátkami proti SARS-CoV je však třeba potvrdit s anti-SARS-CoV sérem od lidí (Extended Data Table 4).

ACE2 je znám jako buněčný receptor pro SARS-CoV14. Abychom zjistili, zda 2019-nCoV také využívá ACE2 jako buněčný vstupní receptor, provedli jsme studie infikovatelnosti viru pomocí HeLa buněk, které exprimovaly nebo neexprimovaly proteiny ACE2 od lidí, čínských podkovářů, civetů, prasat a myší. Ukázali jsme, že virus 2019-nCoV je schopen využít všechny proteiny ACE2, kromě myšího ACE2, jako vstupní receptor pro vstup do buněk exprimujících ACE2, ale ne do buněk, které ACE2 neexprimovaly, což naznačuje, že ACE2 je pravděpodobně buněčný receptor, přes který virus 2019-nCoV vstupuje do buněk (obr. 3). Ukázali jsme také, že virus 2019-nCoV nevyužívá jiné receptory koronaviru, jako je aminopeptidáza N (APN) a dipeptidylpeptidáza 4 (DPP4) (Obr. 7 s rozšířenými údaji).

Studie poskytuje podrobnou zprávu o 2019-nCoV, pravděpodobném etiologickém agens odpovědném za probíhající epidemii akutního respiračního syndromu v Číně a dalších zemích. U všech testovaných pacientů byla pozorována nukleotidově specifická a virově-proteinová sérokonverze a poskytuje důkaz o souvislosti mezi onemocněním a přítomností tohoto viru. Stále však zůstává mnoho naléhavých otázek, které je třeba zodpovědět. Souvislost mezi virem 2019-nCoV a onemocněním nebyla ověřena pokusy na zvířatech, které by splňovaly Kochovy postuláty pro stanovení příčinné souvislosti mezi mikroorganismem a onemocněním. Dosud neznáme rutinní přenos tohoto viru mezi hostiteli. Zdá se, že virus je stále více přenosný mezi lidmi. Měli bychom pečlivě sledovat, zda se virus dále vyvíjí a stává se virulentnějším. Vzhledem k nedostatku specifických léčebných postupů a s ohledem na příbuznost viru 2019-nCoV s virem SARS-CoV by se k léčbě tohoto viru pravděpodobně mohly použít některé léky a preklinické vakcíny proti SARS-CoV. A konečně, vzhledem k širokému rozšíření SARSr-CoV v jejich přirozených rezervoárech by se budoucí výzkum měl zaměřit na aktivní sledování těchto virů pro širší geografické oblasti. V dlouhodobém horizontu by měla být připravena širokospektrá antivirotika a vakcíny pro nově se objevující infekční onemocnění, která jsou v budoucnu způsobena touto skupinou virů. A co je nejdůležitější, měly by být zavedeny přísné předpisy proti domestikaci a konzumaci volně žijících zvířat.

Poznámka doplněna v důkazu: Od přijetí tohoto článku ICTV označil virus jako SARS-CoV-215; WHO navíc zveřejnila oficiální název onemocnění způsobeného tímto virem, který zní COVID-1916.