Alai

RTT fibroblasty vykazují defektní aktivaci autofagie v podmínkách hladovění

S cílem ověřit hypotézu o defektní autofagii u pacientů s RTT, jsme analyzovali aktivaci autofagie za podmínek hladovění u kožních primárních fibroblastů izolovaných od pacientů s RTT (n = 4) a zdravých osob (n = 4)17,19.

Nejprve jsme stanovili životaschopnost v průběhu času zdravých fibroblastů a fibroblastů s RTT kultivovaných v hladovém médiu pomocí MTT testu i testu vyloučení Trypanovy modři. Pokud jde o životaschopnost fibroblastů RTT kultivovaných ve standardním médiu, životaschopnost fibroblastů RTT se snížila po 4 hodinách hladovění (20 ± 3,3 % odumírajících buněk, p < 0,05); tento podíl se výrazně zvýšil po 6-8 hodinách hladovění (60 ± 5,1 % odumírajících buněk, p < 0,05) (obr. 1a). Naopak zdravé fibroblasty byly plně životaschopné i po 4 h hladovění, přičemž po 6-8 h došlo pouze k velmi malému snížení životaschopnosti (10 ± 1,2 % umírajících buněk, p < 0,01) s ohledem na životaschopnost fibroblastů pěstovaných ve standardním médiu (obr. 1a). Z přímého srovnání životaschopnosti obou buněčných linií v jednotlivých časových bodech tedy vyplynulo, že životaschopnost fibroblastů RTT byla vážně narušena již od času 4 h (viz podrobnosti v legendě obrázku, p < 0,05). Analýza Western blottingu (WB) navíc ukázala, že u fibroblastů RTT, které byly hladověny po dobu 4 h, se výrazně zvýšil pás odpovídající fragmentu p25 poly(ADP-ribóza)polymerázy-1 (PARP) (96 ± 4 %, p < 0,001) oproti slabé detekci v čase 0. Tento fragment se uvolňuje při degradaci proteinu závislé na kaspáze během časné fáze indukce apoptózy (obr. 1b)35 . Fragment p25 byl u zdravých fibroblastů za stejných experimentálních podmínek téměř nedetekovatelný.

Tyto údaje potvrdily, že fibroblasty RTT nesnášejí růst v hladovém médiu a rychle podléhají apoptóze. Proto jsme dále zkoumali autofagický tok sledováním clearance markeru LC3B-II v přítomnosti a v nepřítomnosti inhibitoru lysozomů, jako je chlorochin (CQ)24,25,26,27,28,29,30 .

Po vyloučení cytotoxického účinku spojeného s CQ (doplňkový obr. S1) byly zdravé fibroblasty a fibroblasty RTT kultivovány buď v klidovém, nebo hladovém médiu po dobu 2 h v přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 µM CQ, aby bylo možné kvantifikovat poměr LC3B-II/GAPDH pomocí WB (obr. 2a). Průběh poměru LC3B-II/GAPDH (nebo jiné vnitřní kontroly, která není modulována autofagií) za podmínek aktivace autofagie a v přítomnosti a nepřítomnosti CQ (nebo jiného lysozomálního inhibitoru) se považuje za platnou strategii sledování toku autofagie.

U zdravých fibroblastů kultivovaných ve standardním médiu byl LC3B-I jasně imuno-detekován, zatímco LC3B-II byl slabý. Poměr LC3BII/GAPDH zdravých fibroblastů kultivovaných ve standardním médiu v nepřítomnosti a v přítomnosti CQ byl srovnatelný (obr. 2a, levý panel). Toto pozorování naznačuje, že bazální autofagie byla u zdravých fibroblastů téměř nedetekovatelná (obr. 2a, levý panel).

Když byly tyto buňky kultivovány v hladovém médiu a v nepřítomnosti CQ po dobu 2 h, poměr LC3B-II/GAPDH se zvýšil (60 ± 4 .8 %, p < 0,05) ve srovnání se zdravými fibroblasty kultivovanými ve standardním médiu buď v nepřítomnosti, nebo v přítomnosti CQ (což bylo, jak již bylo uvedeno, shodné) (obr. 2a, levý a pravý panel). Toto chování skutečně naznačuje, že LC3-I skutečně podléhal lipidaci za vzniku LC3B-II, což je časný marker aktivace autofagie24,25,26,27,28,29,30. Abychom ověřili přítomnost této aktivace autofagie, kultivovali jsme buňky v hladovém médiu v přítomnosti CQ po dobu 2 h a ty vykazovaly další zvýšení poměru LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5 %, p < 0,001) vzhledem ke zdravým fibroblastům kultivovaným ve standardním médiu (obr. 2a, levý a pravý panel).

Dále byl rozdíl mezi poměrem LC3B-II/GAPDH zdravých fibroblastů kultivovaných v hladovém médiu v nepřítomnosti a v přítomnosti CQ statisticky významný (p < 0,05, obr. 2a, 2 a 3). 2a, levý panel)

Podle standardní interpretace vzorce LC3B-II pomocí WB analýzy tedy celkový výsledek naznačuje, že v nepřítomnosti živin zdravé fibroblasty stimulují tvorbu autofagozomů, které v přítomnosti CQ podléhají akumulaci. Toto chování je slučitelné s normálním autofagickým tokem24,25,26,27,28,29,30. Zajímavé je, že v případě fibroblastů RTT pěstovaných ve standardním médiu byl sice LC3B-I jasně imuno-detekován, ale LC3B-II byl v buňkách v nepřítomnosti i v přítomnosti CQ velmi slabý (obr. 2a, levý panel). Za podmínek hladovění a v nepřítomnosti CQ výskyt slabého proužku odpovídajícího LC3B-II ve fibroblastech RTT až po dlouhé expozici filtru naznačuje, že došlo alespoň k minimální lipidaci LC3B-I (obr. 2a, levý panel). Proto byl poměr LC3B-II/GAPDH mezi fibroblasty RTT pěstovanými v hladovém médiu v nepřítomnosti CQ zvýšen (93 ± 5,5 %, p < 0,001) vzhledem k poměru fibroblastů RTT pěstovaných ve standardním médiu v nepřítomnosti CQ (obr. 2a, pravý panel).

Podávání CQ fibroblastům RTT pěstovaným v hladovém médiu však dále nezvýšilo poměr LC3B-II/GAPDH, který se zvýšil (95 ± 3,5 %, p < 0,001), pokud se porovná s buňkami pěstovanými ve standardním médiu v nepřítomnosti CQ, ale nebyl významně zvýšen vzhledem k poměru LC3B-II/GAPDH fibroblastů RTT pěstovaných v hladovém médiu v nepřítomnosti CQ (obr. 2a, levý panel). Toto zjištění naznačuje, že v buňkách RTT nedochází k akumulaci autofagosomů, a WB analýza podpořila blokádu, na určité úrovni, toku autofagie24,25,26,27,28,29,30,31.

Pro další posílení naší hypotézy týkající se možného defektního autofagického toku jsme ověřili degradaci dvou rozpoznaných reporterových substrátů autofagie ve zdravých fibroblastech a fibroblastech RTT hladověných po dobu 2 a 4 h v nepřítomnosti CQ, a sice (i) proteinu p62/SQSMT1, který napomáhá odstraňování poly-ubikvitinovaných proteinových agregátů a sám je degradován lysozomálními hydrolasami36; (ii) proteasomu 20 S, který je za podmínek hladovění rychle degradován37,38 . S ohledem na bazální hladinu obou proteinů (tj. čas 0) byl u zdravých fibroblastů pozorován pokles v čase poměru p62/tubulin (44 ± 10 % po 4 h, p < 0,001) a poměru PSMA-3/GAPDH (tj. α7 podjednotky 20 S proteasomu) (45 ± 3,1 % po 2 h, 11 ± 5,2 % po 4 h, v obou případech p < 0,001) (obr. 2b, horní panel).

V případě fibroblastů RTT nebyl pokles poměru p62/tubulin v čase statisticky významný ani po 4 h (89 ± 9 %), zatímco pokles poměru PSMA3/GAPDH po 2 h (81 ± 4,4 %, p < 0,05) a 4 h (78 ± 5,1 %, p < 0,05) se významně lišil, pokud se porovnal s bazální hladinou proteinu (tj. čas 0) (obr. 2b, dolní panel). Rozdíly mezi skupinami zdravých a RTT však byly statisticky významné v případě poměru p62/tubulin pouze ve 4 h (p < 0,05), zatímco poměr PSMA3/GAPDH se mezi experimentálními skupinami významně lišil jak ve 2 h (p < 0,05), tak ve 3 h (p < 0,05).05) i 4 h (p < 0,001) (obr. 2b, spodní panel).

Zajímavé je, že vzorce β-tubulinu a GAPDH, použité jako vnitřní kontroly pro barvení p62, respektive PSMA3, se během 4 h hladovění u zdravých fibroblastů nezměnily. Intenzita β-tubulinového pásu, stejně jako intenzita pásu GAPDH, se však u fibroblastů RTT hladověných po dobu 4 h významně snížila ve srovnání s tím, co bylo u těchto buněk pozorováno v čase 0 nebo v čase 2 h (obr. 2b, vyšší panel). Toto snížení bylo pravděpodobně způsobeno nižším počtem živých fibroblastů RTT odebraných v tomto časovém bodě (v souladu s nízkou životaschopností fibroblastů RTT po 4 h hladovění uvedenou na obr. 1a) a nikoliv poklesem regulace β-tubulinu v průběhu času. Celkově bylo zjištěno, že fibroblasty RTT tyto reportérové substráty autofagie účinně nedegradují, což podporuje hypotézu o defektní autofagii.

Pro další objasnění vlastností tohoto bloku jsme provedli imuno-fluorescenční analýzu pomocí protilátky LC3B. Analyzovali jsme zdravé fibroblasty a fibroblasty RTT pěstované ve standardním médiu v nepřítomnosti CQ (klidový stav) a v hladovém médiu po dobu 2 h v přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 µM CQ (obr. 2c). V souladu s pomalou rychlostí metabolismu primárních buněk jsme zjistili, že klidové zdravé fibroblasty a fibroblasty RTT vykazovaly slabé a difuzní barvení LC3B+ s nízkým procentem buněk vykazujících více než 10 teček (tj. autofagosomů) (8 ± 5 %, resp. 1 ± 0,5 %), což naznačuje, že pomocí imunofluorescence byla bazální autofagie špatně detekovatelná ve shodě s údaji uvedenými na obr. 2a.

Vzhledem k buňkám pěstovaným ve standardním médiu bylo procento zdravých fibroblastů pěstovaných v hladovém médiu (v nepřítomnosti CQ) vykazujících alespoň 10 LC3B+ autofagozomů výrazně zvýšeno (82 ± 10 %, p < 0,005), zatímco RTT fibroblasty pěstované v hladovém médiu vykazovaly mírné zvýšení (17 ± 8 %, p < 0,001). Ve skutečnosti bylo procento zdravých fibroblastů pěstovaných v hladovém médiu vykazujících alespoň 10 autofagosomů významně vyšší než procento RTT fibroblastů pěstovaných za stejných experimentálních podmínek (p < 0,005). Autofagozomy byly lokalizovány především v perinukleární oblasti. V přítomnosti CQ bylo dále pozorováno očekávané difuzní a intenzivní barvení LC3B+, i když v tomto případě difuzní barvení neumožňovalo přesně kvantifikovat počet teček.

Podávání CQ bylo u fibroblastů RTT neúčinné, což jasně svědčí o vážně narušené biogenezi autofagozomů (obr. 2c).

Vzhledem k významu předpokládaného narušení biogeneze autofagozomů byl k potvrzení tohoto pozorování použit další přístup. Jak zdravé fibroblasty, tak fibroblasty s RTT, hladovějící 2 h v nepřítomnosti CQ, byly obarveny specifickým barvivem (Cyto-ID) pro autofagozomální membránu a analyzovány pomocí imunofluorescence. I v tomto případě, zatímco u zdravých fibroblastů bylo skutečně detekováno několik autofagosomů, u fibroblastů RTT byl pozorován pouze omezený počet malých a izolovaných vezikul (doplňkový obr. S2). Rozdíl v procentu buněk vykazujících alespoň 5 Cyto-ID pozitivních teček mezi zdravými a RTT fibroblasty byl výrazně významný (80 ± 4 % vs 8 ± 6 %, p < 0,001). Celková analýza tedy poskytla důkaz, že u primárních fibroblastů RTT dochází k defektní biogenezi autofagozomů.

Zralé RBC pacientů s RTT nesoucích mutaci R255X MeCP2 si zachovávají mitochondrie

Dále jsme se snažili zjistit, zda lze u pacientů s RTT ex vivo pozorovat další známky defektní autofagie. Vzhledem k tomu, že clearance mitochondrií je klasický mechanismus založený na autofagii, ke kterému dochází v cirkulujících retikulocytech v konečné fázi zrání na RBC32,33,34 , rozšířili jsme naše zkoumání také na lidské RBC ex vivo, abychom ověřili, zda jsou mitochondrie v těchto buňkách zachovány.

RBC od pacientů s RTT (n = 15) a od zdravých dárců (n = 11) byly proto analyzovány transmisní elektronovou mikroskopií (TEM). Vyšetření TEM poukázalo na přítomnost struktur připomínajících mitochondrie (SRM) v RBC bi-konkávního tvaru izolovaných od většiny pacientů s RTT (11 z 15). Z těchto 11 pacientů s RTT vykazovali tři z nich nejzávažnější kohortu příznaků a také vysokou frekvenci RBC (20 ± 4 %) (obr. 3a-h). Podle očekávání byly SRM ve zdravých RBC nedetekovatelné (obr. 3I). Rozdíly mezi zdravými osobami a osobami s RTT byly statisticky významné (p < 0,0004; obr. 3, dolní panel).

Závažnost příznaků nicméně vycházela z klinického hodnocení, a proto ti tři pacienti s nejzávažnějšími příznaky nesli všichni mutaci R255X genu MeCP2, která je spojena s těžkou prognózou39.

V důsledku toho a s ohledem na skutečnost, že jsme neměli možnost zařadit větší počet subjektů nesoucích jiné mutace, které by vykazovaly nízkou nebo nulovou frekvenci RBC obsahujících mitochondrie, jsme zaměřili naši pozornost na analýzu těchto tří pacientů. Analýza TEM dokumentovala v těchto třech výše uvedených případech přítomnost struktur připomínajících intaktní nebo částečně strávené mitochondrie (buď elektronově husté, nebo prosvícené), které měly normální nebo činkovitý (protáhlý) tvar a byly zpravidla malé se slabými krystami (obr. 3a-h). Ve skutečnosti bylo zjištěno, že velikost a celkový tvar těchto struktur odpovídají mitochondriím zachovaným ve zralých RBC u myších modelů bez RTT s defektní makroautofagií (tj. u myší Ulk1-/-) nebo mitofagií (tj. u myší Nix-/-), které uvádějí jiní autoři32,33 . Je zajímavé, že námi pozorované morfologické změny mitochondrií, jako je zmenšený rozměr, protáhlá (tj. činkovitá) struktura a zejména přítomnost slabých kryst již byly popsány ve svalech a v mozečku pacientů s RTT20,21 . Abychom potvrdili mitochondriální identitu SRM, obarvili jsme RBC zdravých dárců a těchto pacientů s RTT s těžkými příznaky protilátkou anti-COX-IV (cytochrom c oxidáza). Statisticky významný počet RBC od tří pacientů s RTT ve srovnání s RBC zdravých osob(35 ± 5 % vs 0,2 ± 0,01 %, resp. p < 0,005) vykazoval tečkovaný vzor COX-IV+, který naznačoval retenci mitochondrií (obr. 4). Průměrný obsah mitochondrií na buňku byl vypočten na 1,2 ± 0,2 organel na RBC u pacientů s RTT a 0,002 ± 0,0002 u zdravých osob (p < 0,005) (obr. 4). Rozdíly v procentuálním zastoupení RBC vykazujících mitochondrie mezi vyšetřeními TEM a IF lze přičíst skutečnosti, že možnost detekce organel pomocí TEM je striktně závislá na tenkém řezu buňkou, který může bránit jejich přítomnosti, zatímco IF přístup není tímto způsobem omezen.

Pro další potvrzení těchto výsledků jsme provedli cytofluorimetrickou analýzu RBC zdravých subjektů i tří pacientů s RTT pomocí protilátek anti-CD71 (transferinový receptor) a anti-COX-IV. Frekvence pozitivity CD71, markeru nezralých RBC, se u zdravých a pacientů s RTT významně nelišila (1,34 ± 0,13 % vs 1,03 ± 0,3 %; doplňkový obr. S3). Je třeba zdůraznit, že pacienti s RTT zařazení do studie vykazovali normální hematologické parametry, a i když byl index retikulocytů alespoň u několika jedinců nižší než u zdravých, celkové rozdíly mezi oběma skupinami pacientů nebyly statisticky významné (tab. 1). Naopak, v RBC zdravých osob byla pozorována velmi slabá populace COX-IV+, zatímco v RBC RTT byla zjištěna vyšší frekvence COX-IV+ buněk (0,056 ± 0,004 % vs 1,15 ± 0,19 %, p < 0,01). Tyto výsledky byly dále potvrzeny pomocí barvení Mitotracker Green (MT) (doplňkový obr. S3), které dokumentovalo zvýšení počtu MT+ RBC u jednoho pacienta s RTT (nesoucího mutaci R255X MeCP2) oproti jednomu zdravému pacientovi (0,37 % vs 0,16 %), podobně jako u dříve popsané protilátky COX-IV.

Pro další ověření identity SRM byl stejný počet RBC lyzován a analyzován pomocí WB za denaturačních a redukčních podmínek. Filtry byly obarveny protilátkami proti sirtuinu-3, deacetyláze specificky exprimované v mitochondriální matrix40. Sirtuin3 byl v tomto přístupu vybrán jako mitochondriální marker, protože na rozdíl od COX-IV a jiných mitochondriálních markerů se jeho molekulová hmotnost v elektroforetickém vzorci nepřekrývá s molekulovou hmotností hemoglobinových řetězců nebo hemoglobinových oligomerů. U tří zkoumaných pacientů s RTT bylo u každého pacienta pozorováno statisticky významné zvýšení poměru sirtuin-3/GAPDH vzhledem ke stejnému poměru v lyzátech ze zdravých RBC (p < 0. 001) (doplňkový obr. S4).

Tito tři pacienti, všichni nesoucí mutaci MeCP2 (tj. R255X), vykazovali nejhorší fenotyp s velmi vysokým procentem RBC vykazujících alespoň 1 mitochondrii. Vzhledem k velmi omezenému počtu pacientů, které jsme měli k dispozici, však bylo obtížné vyvodit jakýkoli statisticky významný závěr ohledně možnosti vztahu mezi závažností onemocnění a mírou retence mitochondrií uvnitř zralých RBC. Dalším bodem, který zřejmě stojí za zmínku, je skutečnost, že retence mitochondrií uvnitř zralých RBC u dříve citovaných myších modelů Ulk1-/- a Nix-/- vedla k anémii nebo jiným krevním patologiím pravděpodobně podmíněným zvýšenou clearance těchto abnormálních erytrocytů makrofágy sleziny32,33 . U pacientů s RTT zařazených do této studie byl zaznamenán pouze velmi omezený a statisticky nevýznamný pokles hematologických hodnot a zdálo se, že netrpí anémií ani jinými krevními patologiemi. Rozdíl mezi našimi výsledky a výsledky z myších modelů by mohl být způsoben tím, že vyřazení genů pro makroautofagii nebo mitofagii (tj. u myší Ulk1-/- a Nix-/-) vyvolává velmi vysoké procento RBC obsahujících mitochondrie a retenci několika organel v RBC, což je podstatně závažnější porucha ve srovnání s poruchou dokumentovanou u pacientů s RTT32,33 . Přestože jsme u pacientů nesoucích mutaci R255X pozorovali výrazně vysoký počet RBC obsahujících mitochondrie (obr. 4), počet organel v každé buňce byl u RTT RBC velmi nízký (obr. 4). To by nemuselo stačit k tomu, aby došlo k významným morfologickým a funkčním změnám v RBC. Stojí za zmínku, že ačkoli retence mitochondrií uvnitř RBC by mohla být přinejmenším jedním z faktorů určujících závažnou redoxní nerovnováhu pozorovanou u RTT RBC ve spojení s výraznou změnou energetického stavu a metabolismu (tj, ATP/ADP a poměru NADH/NAD), nedávné studie uvádějí, že kinetika vazby kyslíku na hemoglobin a difúze kyslíku se téměř překrývá s kinetikou zdravých pacientů16,17,23,41 .

Zjevný rozpor mezi našimi výsledky a výsledky odvozenými z myších modelů by mohl najít vysvětlení také ve skutečnosti, že syndrom RTT je porucha vázaná na chromozom X, která postihuje téměř výhradně ženské pohlaví, a inaktivace jedné ze dvou kopií chromozomu X (XCI) je náhodný jev vyskytující se během embryogeneze, jak je široce zdokumentováno42,43 . V případě syndromu RTT by tedy náhodná XCI měla v somatických buňkách vytvořit mozaiku s polovinou buněk exprimujících alelu divokého typu a se zbývající polovinou exprimující mutovanou alelu genu MeCP2. Zajímavé je, že možnost, že by alespoň některé mutace MeCP2 mohly být spojeny s nenáhodnou XCI v neuronální tkáni, je v souladu s fenotypovou variabilitou pacientů s RTT (a také u známých případů RTT), což je charakteristika, která byla rozsáhle zdokumentována42,43 . Teoreticky, pokud si polovina hematologických progenitorů v kostní dřeni uchovává chromozom X nesoucí mutaci MeCP2, pouze polovina cirkulujících zralých RBC by nesla patologickou alelu, což by omezilo počet cirkulujících RBC obsahujících mitochondrie. Nicméně u sporadických pacientů s RTT byla v cirkulujících leukocytech pozorována zvýšená prevalence non-random XCI ve prospěch alely divokého typu42,43. Pokud jde o tento bod, bylo by velmi náročné zabývat se otázkou, zda pacienti, kteří vykazují nebo nevykazují nízký počet RBC obsahujících mitochondrie, vykazují také méně významnou poruchu mitofágie nebo nerandomní XCI, která by vedla k pozitivní selekci hematologických progenitorů nesoucích alelu MeCP2 divokého typu.

Vzhledem ke komplexnosti patologie RTT se tedy přikláníme k tvrzení, že pacienti s RTT by spolu s pacienty postiženými Pearsonovým syndromem mohli představovat první případy retence mitochondrií v lidských zralých RBC44.

Důkaz defektní autofagie v mozečku Mecp2-nulových myší

Vzhledem k tomu, že RTT je neurovývojová porucha, abychom dále podpořili naše výsledky, které ukazují na systémovou defektní autofagii, provedli jsme imunohistochemické analýzy p62 a ubikvitinu mozečku (tj.tj. orgánu, ve kterém byly pozorovány změny mitochondrií a další významné histologické abnormality)21,45 9týdenních myší divokého typu a 5týdenních (asymptomatických) a 9týdenních (symptomatických) myší Mecp2 -/y. Pro každý experimentální stav byl analyzován orgán izolovaný od tří zvířat. Ve srovnání s wt mozeček RTT vykazoval zvýšení intenzity barvení p62 (obr. 5a) a Ub (obr. 5b) ve všech vrstvách (tj. granule, Purkyňova a kortikální vrstva), které bylo lineární s věkem zvířat. Hyperbarvené struktury navíc připomínaly intracelulární agregáty. Podle semikvantitativního hodnocení intenzity barvení buď p62/SQSTM1, nebo Ub byly rozdíly mezi mozečkem 5týdenních zvířat oproti zdravým zvířatům a 9týdenních zvířat oproti 5týdenním zvířatům statisticky významné (p < 0.).05).

Histologický rozdíl mezi asymptomatickými a symptomatickými zvířaty naznačuje, že změna autofagie by mohla být při narození nepřítomná nebo slabá, zatímco během prvních týdnů života (a pravděpodobně v době, kdy aktivita MeCP2 dosáhne vrcholu) se postupně zvyšuje a dává vzniknout symptomům.

.