Laboratorní medicína dosáhla v posledních dvou desetiletích významného pokroku. Testy virové zátěže se vyvíjely od testů vnořené PCR přes amplifikaci zprostředkovanou transkripcí až po PCR v reálném čase a dále se vyvíjejí díky metodám, jako je digitální PCR. Tento pokrok vedl k citlivějším testům virové nálože s širším dynamickým rozsahem, což lékařům umožňuje lépe porozumět odpovědi pacienta na léčbu a vývoji onemocnění.
Jedním z příkladů zlepšení léčby pacientů díky pokroku v molekulární diagnostice je léčba pacientů s HIV-1 viry. Podle současných pokynů pro léčbu je úspěch léčby definován jako koncentrace HIV-1 RNA pod 75 kopií/ml.1 Definice selhání léčby se liší podle celosvětových, národních a specifických pokynů jednotlivých zemí, ale obvykle je definována jako koncentrace HIV-1 RNA v rozmezí 50-1000 kopií/ml.1-3
Tyto hraniční hodnoty pro léčbu jsou na spodní hranici dynamického rozsahu testů PCR v reálném čase, kde může být problém s přesností a reprodukovatelností. Faktory, které by mohly ovlivnit výkonnost testu virové nálože, jsou automatizovaná platforma, chemie extrakce nukleových kyselin, výběr a návrh primerů/sond PCR, podmínky amplifikace PCR a strategie kalibrace testu. V tomto článku se budeme zabývat různými přístupy k návrhu a jejich potenciálním dopadem na výkonnost testu a klinické výsledky. (Obrázek 1)
Extrakční proces
Při výběru extrakční chemie je třeba pečlivě zvážit typ vzorku a analytu. Například v případě HIV-1 doporučuje Ministerstvo zdravotnictví a lidských služeb (DHHS), aby se jako marker virémie HIV-1 používala HIV-1 RNA.1
Rozlišení mezi HIV-1 RNA a provirovou DNA je důležité, protože provirová DNA není markerem aktivní virové replikace, ale spíše uvolnění latentního rezervoáru z viru, který již byl integrován do buněk. Extrakční chemie, která purifikuje jak HIV-1 RNA, tak provirální DNA, by lékaři neposkytla přesnou reprezentaci skutečné virové replikace; proto by v případě tohoto viru měla být použita pouze extrakční chemie, která specificky purifikuje HIV-1 RNA, aby se z následné kvantifikace vyloučila provirální DNA.
Případně by použití extrakční chemie celkové nukleové kyseliny (TNA) pro kvantifikaci HIV-1 mohlo potenciálně vést k falešně pozitivním výsledkům nebo nepřesné kvantifikaci, což by mělo nepříznivý vliv na léčbu pacienta. Extrakční chemii TNA lze využít pro obtížnější typy vzorků, jako je moč nebo stolice, nebo pro testy, které musí detekovat oba cílové kmeny RNA/DNA.
Výběr cíle
Velká virová rozmanitost, s níž se setkáváme mezi kmeny HIV, HBV a HCV, je nanejvýš důležitá pro zajištění toho, aby molekulární diagnostické testy (MDx) poskytovaly správný výsledek bez ohledu na kmen(y) přítomný(é) ve vzorku.
Pro řešení této obavy by optimální návrh testu měl začít výběrem primerů/cílových sond v geneticky konzervativní oblasti, kde bude mít virová diverzita nejmenší potenciální dopad. Geneticky konzervativní oblasti lze určit pouze porovnáním sekvencí z různých virových kmenů.
Pro splnění této potřeby je rozhodující globální program surveillance, který komplexně posoudí stávající virovou diverzitu v oběhu kmenů HIV, HBV a HCV.4 V programu surveillance se sekvence vytvořené z kmenů shromážděných v geograficky různorodých oblastech používají k určení, které oblasti virového genomu jsou nejkonzervativnější a dají se detekovat pomocí molekulárně diagnostického testu. Použitím cirkulujících virových sekvencí pro návrh testu se významně snižuje riziko, že kmeny budou testem přehlédnuty.
Kromě výběru cílové oblasti je při snaze o zajištění přesné kvantifikace virové nálože rozhodující také návrh sondy a podmínky cyklování PCR. Návrh sondy musí být tolerantní k přirozeně se vyskytujícím polymorfismům a následně k potenciálním neshodám, které se mohou vyskytnout v dané cílové oblasti. V průběhu času se technologie sond vyvíjela, stejně jako metodika PCR. Širší spektrum aplikací MDx založených na technologii PCR nad rámec kvantifikace virů vyžaduje využití různých návrhů sond. Pro genotypizaci a detekci jednonukleotidového polymorfismu se obvykle používají sondy vázající se na malé drážky.
Sondy TaqMan se často používají v testech, kde cílové oblasti mají vysoký stupeň zachování. Částečně dvouvláknové sondy, které lépe snášejí vysokou míru genetické heterogenity především díky délce sondy a vazebným podmínkám, se využívají v oblastech, kde je vysoký stupeň heterogenity.5
Kromě návrhu sondy jsou často předmětem optimalizace návrhu i podmínky cyklování, aby bylo dosaženo požadavku na výkonnost (např. tolerance potenciálních neshod.) Jedním z přístupů je cyklování s fázovým přizpůsobením, které zahrnuje cykly při nižší teplotě pro snížení počáteční přísnosti, po nichž následují cykly při vysokých teplotách pro zachování specifičnosti. Tento přístup zmírňuje nepříznivý vliv potenciálních neshod primerů na kvantifikaci vzorku. V případě, že je obtížné vyhnout se významnému vlivu vzácných polymorfismů, lze do návrhu testu zahrnout detekci druhého cíle. Pokud sekvenční diverzita ovlivňuje detekci jedné oblasti virového genomu, zajistí detekce druhé oblasti, že bude dosaženo přesného výsledku. Vzhledem ke složitosti molekulárních testů a vysoké úrovni virové diverzity je třeba při navrhování molekulárních testů zvážit komplexní přístup spočívající ve využití globálního dohledu a návrhu sond specifických pro daný cíl. Pouhé přizpůsobení jedné strategie, jako je duální cíl, může poskytovat falešný pocit bezpečí.
Kalibrační strategie
Kalibrační strategie je nedílnou součástí návrhu molekulárních testů a je rozhodující pro zajištění reprodukovatelnosti v širokém dynamickém rozsahu. Většina kvantitativních metodik pro řízení terapie v současné době používá externí kalibrační křivku pro stanovení koncentrace analytu.
V těchto testech se signál analytu ve vzorku pacienta porovnává se souborem vzorků se známou koncentrací a k výpočtu virové zátěže se používá jednoduchá lineární regrese (y=mx+b). Tento přístup obvykle používá kalibrátory, které jsou zpracovány jako vzorky pacientů v průběhu celého procesu, což umožňuje kalibraci jak extrakčních, tak amplifikačních činidel a přístrojů.
Alternativně by bylo možné použít kalibrátory, které nejsou zpracovány v průběhu extrakce, nicméně tento přístup s sebou nese riziko, že by nebyl zohledněn rozdíl ve výtěžnosti nebo změna složení činidla, což by mohlo vést k rozdílům v kvantifikaci.
Další méně často používanou strategií je vnitřní kvantitativní standard. Tato aplikace používá polynomickou regresní přímku 3. řádu (y = ax3 + bx2 + cx + d) v celém lineárním rozsahu s přípustnou maximální odchylkou od linearity. Předchozí studie naznačily, že přijatelný přípustný rozdíl od linearity u některých testů byl ± 0,2 Log10.6 Tento přípustný rozdíl od linearity a kalibrační přístup také vysvětluje často pozorovanou odchylku mezi metodikami a také větší nepřesnost na dolním konci dynamického rozsahu, kde se často činí klinická rozhodnutí.
Závěr
Přesný a přesný výkon molekulárních testů je rozhodující pro vhodné řízení terapie. Nepřesné výsledky virové nálože by mohly vést k nevhodnému managementu a pacient by mohl být ponechán na neúspěšné terapii. Tato chybná diagnóza má mnohem širší důsledky než léčba jednoho pacienta, protože by mohla vést také ke zvýšení přenosu rezistentního virového kmene. Z hlediska řízení terapie je virus s mutacemi spojenými s rezistencí náročnější léčit pomocí užších možností terapie. Kromě toho může falešná pozitivita zvýšit zbytečné náklady na opakované testování nebo dražší testování rezistence, stejně jako úzkost pro pacienta a lékaře.
- Pokyny pro používání antiretrovirotik u dospělých a dospívajících s HIV vypracované Ministerstvem zdravotnictví a lidských služeb. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Dostupné v září 2019.
- Evropská klinická společnost pro AIDS (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, duben 2015, přístup 2. srpna 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Částečně dvouvláknové lineární DNA sondy: nový design pro citlivou detekci geneticky polymorfních cílů. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Development of the second version of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatitis C virus quantitative test with improved genotype inclusivity. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Poděkování: Autor by chtěl vyjádřit uznání a poděkovat Mary Rodgersové a Shihai Huangovi za recenzi tohoto článku.