Alai

Stanovení teplotního rozmezí

Obvykle používané laboratorní podmínky pro kultury Macrostomum lignano jsou následující: teplota 20 °C, vlhkost 60 % a cyklus světlo/tma 14 h/10 h. Tyto podmínky byly zvoleny především proto, že jsou optimální pro růst diatomie Nitzschia curvilineata, která je pro červy hlavním zdrojem potravy . Pro posouzení teplotních podmínek, které lze v experimentu použít, jsme nejprve stanovili teplotní rozmezí, ve kterém červi přežívají. Zatímco zmrazení se ukázalo jako smrtelné, červi dokázali přežít, pokud byli uchováváni při teplotě 4 °C po dobu nejméně dvou týdnů. Protože však diatomie v těchto podmínkách neroste, rozhodli jsme se teplotu 4 °C z dalších pokusů vyloučit. Z pokusu byly vyloučeny i další teploty nižší než 20 °C, protože hlavním cílem studie bylo najít podmínky, které urychlují růst a vývoj. Na druhé straně teplotního spektra se červi rozpouštějí při dvouhodinovém držení při 42 °C a hynou po týdnu kultivace při 37 °C. Proto jsme se rozhodli použít 20 °C, 25 °C, 30 °C a 35 °C jako naše experimentální podmínky pro studium dlouhodobého vlivu teploty na M. lignano (obr. 1).

Odpověď na tepelný šok

Pro zjištění, které teploty vyvolávají u červů stresovou odpověď, jsme sledovali aktivitu promotoru tepelného šoku 20 (Mlig-hsp20). Nejprve jsme provedli kvantitativní RT-PCR, abychom změřili úroveň exprese Mlig-hsp20 při teplotách 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C a 35 °C. Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v úrovni exprese Hsp20 mezi 20 °C a 25 °C (obr. 2a). Bylo však pozorováno malé (2násobné), ale významné (P = 0,027, t-test) zvýšení exprese při 30 °C ve srovnání s 20 °C (obr. 2a). Při teplotě 33 °C bylo pozorováno více než desetinásobné zvýšení úrovně exprese, které se při nejvyšší testované teplotě 35 °C zvýšilo na více než stonásobek (obr. 2a). Ve druhém testu jsme vytvořili transgenní linii exprimující protein mScarlet-I pod kontrolou promotoru Mlig-hsp20 (obr. 2b) a měřili jsme úroveň fluorescence 24 hodin po dvouhodinové inkubaci při různých teplotách od 20 °C do 37 °C (obr. 2c, d). Více než dvojnásobné a desetinásobné zvýšení fluorescence bylo pozorováno při teplotách 34 °C a 37 °C (obr. 2c).

Rychlost embryonálního vývoje

Podle Morrise a kol. trvá přibližně 120 h (pět dní), než se vajíčka Macrostomum plně vyvinou, jsou-li uchovávána při 20 °C. Abychom zjistili, jak teplota ovlivňuje rychlost embryonálního vývoje a líhnutí, odebrali jsme čerstvě nakladená embrya a sledovali jejich vývoj až do vylíhnutí při různých teplotách. Pro zkoumání možných rozdílů způsobených genetickým pozadím jsme použili dvě linie M. lignano, které se v současnosti používají ve většině studií o M. lignano, linie DV1 a NL10. Tyto linie jsou nezávisle odvozeny z divokých populací ze stejné zeměpisné polohy a liší se celochromozomovou duplikací, ale jinak se v laboratorních podmínkách chovají velmi podobně. Nejprve jsme studovali vliv nízké teploty. Při teplotě 4 °C je vývoj vajíček zastaven a mohou být skladována po dobu nejméně jednoho měsíce a po návratu do vyšších teplot pokračují ve svém vývoji. Dále jsme zkoumali, jak rychle se vajíčka vyvíjejí při teplotách mezi 20 °C a 35 °C. Jak ukazuje obr. 3, při skladování za standardních podmínek (20 °C) se vajíčka začala líhnout po šesti dnech. Zvýšení teploty vedlo k úměrně rychlejšímu embryonálnímu vývoji a dřívějšímu líhnutí, které bylo při 35 °C dvakrát rychlejší než při 20 °C a trvalo pouze tři dny. Za zmínku stojí, že po osmi dnech inkubace při 20 °C zůstalo přibližně 10 % vajec nevylíhnutých, zatímco při vyšších teplotách to bylo méně než 5 %, což naznačuje, že ani nejvyšší testovaná teplota 35 °C nemá škodlivý vliv na přežití embryí.

Reprodukce

Reprodukční rychlost je pro modelový organismus velmi důležitým faktorem, protože zvířata s kratší generační dobou umožňují rychlejší generování dat v genetických experimentech. Kromě toho, pokud zvířata produkují velký počet potomků, budou mít vygenerovaná data ve většině případů vyšší statistickou sílu.

Pro posouzení vlivu teploty na rychlost reprodukce M. lignano jsme porovnali počet potomků vygenerovaných v průběhu pěti týdnů červy chovanými za různých teplotních podmínek. Pokus byl zahájen s líhnoucími se mláďaty, aby byl do studie zahrnut postembryonální vývoj, a byly použity linie DV1 i NL10. Líhnicím obou linií trvalo tři týdny, než vyrostly a vytvořily první potomstvo při 20 °C, zatímco při 25 °C byly líhně pozorovány za dva týdny u linie NL10, ale ne u linie DV1. Při teplotách 30 °C a 35 °C obě linie produkovaly potomstvo již po dvou týdnech (obr. 4). Od tří týdnů se počet vylíhnutých mláďat za týden zvyšoval z méně než 200 při 20 °C na více než 300 při teplotách nad 20 °C; počet vylíhnutých mláďat byl nejvyšší u červů chovaných při 30 °C. To platilo pro obě genetická pozadí a nepozorovali jsme významné rozdíly mezi liniemi DV1 a NL10 (obr. 4).

Teplota 30 °C a vyšší sice vedla k většímu počtu vylíhnutých mláďat, ale zároveň aktivovala reakci na tepelný šok (obr. 2). Abychom prozkoumali dlouhodobý účinek zvýšené teploty a potenciální stres, který může na červy působit, uchovávali jsme červy při zvolených teplotách a sledovali morfologické aberace po třech a šesti měsících kultivace. Červi chovaní při 25 °C nevykazovali v obou kontrolních bodech žádné morfologické změny ve srovnání s červy chovanými při 20 °C (obr. 5). Při teplotách 30 °C i 35 °C však byly pozorovány různé aberace v celkové morfologii. Po třech měsících byl u linií DV1 i NL10 běžně přítomen zvýšený počet cyst, poškozená tkáň a zvětšená varlata (obr. 5). Žádný z červů chovaných při 35 °C nepřežil do šestiměsíčního kontrolního bodu a všichni červi, kteří přežili při 30 °C, vykazovali morfologické aberace (obr. 5). Dlouhodobé vystavení teplotám nad 30 °C je tedy pro M. lignano škodlivé.

Doba regenerace

Protože hlavní atraktivitou M. lignano jako modelového organismu je jeho regenerační schopnost, dále jsme studovali, jak teplota ovlivňuje regeneraci. Obecně se má za to, že vyšší teplota vede ke zvýšení celkové metabolické aktivity . Abychom vyhodnotili vliv teploty na dobu potřebnou k úplné regeneraci těla červa po amputaci nad oblastí varlat, sledovali jsme regeneraci varlat a výskyt spermií v semenných váčcích pomocí dříve vytvořené transgenní linie NL22, která exprimuje GFP pod kontrolou promotoru ELAV specifického pro varlata a spermie . Použití takového transgenního markeru poskytuje lepší přesnost, konzistenci a účinnost při zjišťování rozsahu regenerace. Při hodnocení doby objevení se signálu GFP po amputaci jsme skutečně nepozorovali žádné významné rozdíly při všech testovaných teplotách (tabulka 1).

Podle očekávání se rychlost regenerace zvyšovala s teplotou (tabulka 1). Pokud vezmeme dobu regenerace při 20 °C jako standardní rychlost, pak pro regeneraci testes jsou vypočtené teplotní koeficienty Q10 = 4 při 25 °C a Q10 = 3 pro 30 °C a 35 °C. Z toho vyplývá, že největšího účinku se dosáhne při zvýšení teploty na 25 °C a nejrychlejší regenerace probíhá při 30 °C, aniž by zvýšení teploty mělo další přínos na dobu regenerace. Proto by se při pokusech s regenerací M. lignano měly brát v úvahu teploty 25 °C a 30 °C, protože zkracují dobu trvání pokusu dvakrát až třikrát (tabulka 1).

RNA interference

Snížení exprese genů pomocí RNA interference (RNAi) je v současné době hlavním přístupem pro studie ztráty funkce u M. lignano . Při tomto přístupu jsou zvířata napuštěna dvouřetězcovou RNA proti cílovému genu a k pozorování fenotypu je často nutné dlouhodobé ošetření po dobu několika týdnů . Testovali jsme, jak teplota ovlivňuje rychlost vývoje fenotypu po ošetření RNAi . Za tímto účelem jsme vyřadili gen Mlig-ddx39, který je známý svou funkcí v buněčné proliferaci u M. lignano a robustním letálním fenotypem . Podobně jako v případě testu rozmnožování jsme pro tento experiment použili linie DV1 a NL10 (tabulka 2). Při teplotě 20 °C trvalo přibližně 20 dní, než všechna zvířata po knockdownu Mlig-ddx39 uhynula. Pokud byli červi chováni při vyšších teplotách, došlo k úhynu rychleji: za 11, resp. 8 dní u červů chovaných při 25 °C a 30 °C. Mezi oběma kmeny použitými k pokusu nebyl žádný viditelný rozdíl (tabulka 2). Dále jsme zjišťovali, zda je pozorované zvýšení rychlosti projevu fenotypu ddx39 RNAi při vyšších teplotách způsobeno vyšší účinností vyřazení genu pomocí RNAi, nebo jinými faktory. Za tímto účelem jsme pomocí qRT-PCR měřili množství transkriptů Mlig-ddx39 v různých časových bodech po zahájení RNAi experimentu při různých teplotách (obr. 6). Jako referenční kontroly byla použita zvířata ošetřená dsRNA proti gfp. Při všech testovaných teplotách nebyly v průběhu experimentu pozorovány žádné významné rozdíly v hladinách exprese Mlig-ddx39 mezi kontrolními vzorky (obr. 6). Současně byl u zvířat ošetřených dsRNA Mlig-ddx39 pozorován pokles hladiny transkriptů ddx39 o ~ 80 % již po jednom dni ošetření při 20 °C nebo 25 °C a dokonce vyšší pokles o ~ 90 % při 30 °C. V dalších dnech se však hladina knockdownu ustálila na přibližně 95 % při všech teplotách. Došli jsme tedy k závěru, že kinetika samotné RNAi není teplotou významně ovlivněna. Místo toho lze pozorované zkrácení doby pro projevení fenotypu Mlig-ddx39 RNAi při vyšších teplotách vysvětlit zvýšenou rychlostí buněčného obratu.

Pro ověření, zda lze urychlení vývoje fenotypů RNAi při zvýšených teplotách zobecnit na jiné geny, jsme zkoumali gen Mlig-sperm1, jehož knockdown vede k abnormální morfologii spermií a zvětšení varlat . Jedná se o pomalý RNAi fenotyp, který se při 20 °C vyvíjí 2-3 týdny . Abychom kvantifikovali rozsah fenotypu při různých teplotách, počítali jsme ve 4. dni léčby RNAi podíl zvířat s varlaty zvětšenými do té míry, že se vzájemně dotýkala. (Obr. 7). Podobně jako u výsledků s Mlig-ddx39 RNAi vedly vyšší teploty k rychlejšímu rozvoji fenotypu, a zatímco po čtyřech dnech léčby dsRNA při 20 °C nebyla pozorována dostatečně zvětšená varlata, při 25 °C mělo zvětšená varlata 25 % a při 30 °C 85 % zvířat (tabulka 2). Z toho vyplývá, že podobně jako u regenerace lze u M. lignano fenotypy RNAi urychlit s teplotou a vyšší teploty lze použít ke zkrácení doby trvání pokusů.

.