Von-Willebrand-Faktor, ADAMTS13 und thrombotische thrombozytopenische Purpura
VWF wird von einem großen Gen auf Chromosom 12p13.31 synthetisiert, das sich über 178 kb erstreckt und 52 Exons enthält.49 Die von diesem Gen produzierte Boten-RNA (mRNA) spezifiziert ein Polypeptid mit 2813 Aminosäuren, das ein Signalpeptid mit 22 Aminosäuren, ein Propeptid mit 742 Aminosäuren und eine Sequenz mit 2050 Aminosäuren enthält, die den monomeren Baustein des im Plasma vorkommenden VWF bilden. Nach der Spaltung des Signalpeptids im endoplasmatischen Retikulum werden die propeptidhaltigen Monomere durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten, an denen Cys-Reste in der Nähe des C-Terminus des Moleküls beteiligt sind, zu Dimeren verknüpft. Diese Dimere werden dann in den Golgi-Apparat transportiert, wo das Propeptid Inter-Dimer-Disulfidbindungen zwischen Resten in der D3-Domäne katalysiert, wodurch lange Multimere entstehen, die aus Kopf-an-Kopf-verknüpften Dimeren mit N-Termini an beiden Enden bestehen. Das Propeptid wird dann von einem Furin-ähnlichen Enzym gespalten, und der größte Teil des entstandenen ULVWF wird in Speichergranula für eine spätere regulierte Sekretion verpackt.
Nur zwei Zelltypen sind für die Synthese von VWF bekannt: Endothelzellen und Megakaryozyten. In Endothelzellen wird der VWF in Granula gespeichert, die Weibel-Palade-Körperchen genannt werden; in Blutplättchen wird er in α-Granula gespeichert. Der meiste VWF im Blut ist endothelialen Ursprungs. Viele Stimuli können die Freisetzung von endothelialem VWF auslösen, darunter Epinephrin, Desamino-Vasopressin (DDAVP), Histamin, Thrombin, Shiga-Toxine und proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-8 und IL-6 (im Komplex mit dem IL-6-Rezeptor).50 Auch andere Agenzien können die endotheliale Freisetzung von VWF auslösen, was Hinweise auf einige der auslösenden Faktoren bei TTP liefert. Zu diesen Agenzien gehören Viren wie das Adenovirus51 und Oxidationsmittel wie Superoxid.52 Oxidationsmittel sind nicht nur in der Lage, die Freisetzung von ULVWF zu induzieren; sie können VWF auch oxidieren, so dass er durch ADAMTS1353 nicht mehr spaltbar ist und besser haftet.54 Darüber hinaus können Oxidationsmittel, insbesondere solche, die von Neutrophilen und Monozyten während einer Entzündung produziert werden, einen entscheidenden Methioninrest in der katalytischen Domäne von ADAMTS13 oxidieren und das Enzym inaktivieren.55
Sowohl Endothelzellen als auch Thrombozyten setzen VWF-Multimere frei, die größer sind als die Multimere im normalen Plasma.56 Diese ULVWF-Multimere sind nicht nur viel größer als die normalerweise im Plasma vorkommenden; sie sind auch viel adhäsiver und in der Lage, den Thrombozyten-VWF-Rezeptor Glycoprotein Ib (GPIbα; größtes Polypeptid des GPIb-IX-V-Komplexes) spontan und mit einer höheren Bindungsstärke zu binden als bei der Bindung von Plasma-VWF an GPIbα in Gegenwart der Modulatoren Ristocetin oder Botrocetin.57 In vivo bedeutet dies, dass ULVWF in der Lage ist, Thrombozyten bei keiner oder geringer Scherbeanspruchung zu binden, während prozessierter Plasma-VWF eine durch hohe Scherbeanspruchung induzierte Entfaltung benötigt, um Thrombozyten zu binden.58
Ein Teil des neu freigesetzten ULVWF gelangt direkt in das zirkulierende Blut, während ein anderer Teil am Endothel verbleibt, wo sich die ULVWF-Multimere selbst assoziieren können, um Strings von mehreren hundert Mikrometern bis zu mehreren Millimetern Länge zu bilden, die an der Endotheloberfläche verankert bleiben.59 Oberflächengebundene ULVWF-Strings sind hyperadhäsiv und binden spontan Thrombozyten, um mit Thrombozyten dekorierte Strings mit „Perlen-auf-Strings“-Aussehen auf der Endotheloberfläche zu bilden. Unter physiologischem Scherstress werden die plättchendekorierten ULVWF-Strings durch ADAMTS13 gespalten und von der Endotheloberfläche entfernt. Eine weitere Verarbeitung, die noch nicht vollständig charakterisiert ist, führt dazu, dass der VWF nicht mehr spontan an Blutplättchen binden kann. Die Anhäufung von mit Blutplättchen dekorierten ULVWF-Strings auf der Endotheloberfläche als Folge verringerter Konzentrationen oder des Fehlens von ADAMTS13 im Blutkreislauf löst eine mikrovaskuläre Thrombose aus, die zur Bildung und Ablagerung von plättchenreichen hyalinen Thromben in der Mikrovaskulatur führt – ein charakteristisches Merkmal der TTP.
ULVWF-Strings bestehen aus Bündeln von VWF-Multimeren, und jeder String ist an mehreren Verankerungsstellen an der Endotheloberfläche gebunden. In Abwesenheit (oder bei niedrigen Konzentrationen) von Ca2+ und Mg2+ binden die ULVWF-Strings an die Endotheloberfläche durch Bindung an P-Selektin.60 In Gegenwart physiologischer Konzentrationen zweiwertiger Kationen verankern sich ULVWF-Stränge durch ihre Wechselwirkung mit Integrin αvβ3 an der Endotheloberfläche.61 An dieser Verankerung von VWF-Strängen sind zweifellos weitere Moleküle beteiligt, die jedoch noch nicht identifiziert sind.
Die Fähigkeit von VWF oder ULVWF-Multimeren, sich selbst zu dickeren Fasern und Kabeln zu assoziieren, wird zu einem wichtigen Mechanismus für die Regulierung der Hafteigenschaften von VWF. Savage et al. zeigten, dass VWF-Multimere in der flüssigen Phase unter Scherbelastung und in Gegenwart von Blutplättchen homotypisch und reversibel mit VWF-Multimeren assoziieren, die auf einer Kollagenoberfläche immobilisiert sind; die selbstassoziierten VWF-Multimere unterstützen die Adhäsion von Blutplättchen unter Scherbelastung.62 VWF-Multimere in der Flüssigphase können auch mit ULVWF-Strängen assoziieren, die an der Endotheloberfläche befestigt sind,63 und die Selbstassoziation wird durch eine teilweise Entfaltung der VWF-Moleküle, die durch Scherbelastung64,65 oder durch die Bindung von Ristocetin erleichtert.66 Die selbstassoziierten VWF-Multimere bilden ein Netzwerk vernetzter Fasern auf Kollagenoberflächen64 oder in Lösung.66 Unter Scherbelastung können VWF-Multimere in der Flüssigphase auch mit VWF-Multimeren assoziieren, die durch Interaktion mit GPIbα auf Thrombozytenoberflächen an diese gebunden sind.67 Die Selbstassoziation von VWF auf Thrombozytenoberflächen kann die Thrombozytenaktivierung auslösen, die Thrombozytenaggregation fördern und das Thrombuswachstum verstärken.
Die Fähigkeit von VWF zur Selbstassoziation ermöglicht es ihm, Stränge zu bilden, die mit der Länge und Dicke der durch Fibrinpolymerisation erzeugten Stränge konkurrieren oder diese sogar übertreffen. In synthetischen Mikrogefäßen, die durch Stimulation mit Agonisten zur Sekretion von VWF angeregt werden, kann sich der von der Gefäßwand abgesonderte VWF zu Strängen zusammenfügen, die das Gefäßlumen überspannen können, insbesondere an Bifurkationen und Kurven.68 Die Fähigkeit von VWF, Stränge und Kabel von solch enormen Ausmaßen zu bilden und diese Kabel quer durch den Fluss zu spannen, erhöht nicht nur die Wahrscheinlichkeit, dass die Stränge Thrombozyten einfangen, sondern auch ihre Fähigkeit, Erythrozyten in Schistozyten zu zerfetzen.
Die VWF-Selbstassoziation selbst wird nicht nur durch Scherbelastung, sondern auch durch Plasmafaktoren reguliert, die wahrscheinlich den Verlauf und die Schwere von TTP-Episoden verändern können. Die VWF-Selbstassoziation wird durch High-Density-Lipoprotein (HDL) und Apoliprotein (Apo) A-I, die wichtigste Proteinkomponente im HDL, abgeschwächt. Beide reduzieren die Länge und Dicke der auf der Endotheloberfläche immobilisierten VWF-Fasern erheblich. Die Thrombozytenadhäsion an diesen hyperadhäsiven Strukturen ist ebenfalls proportional zur Verringerung des selbstassoziierten VWF reduziert. In einem Modell der TMA bei ADAMTS13-Knockout-Mäusen verringerte HDL auch signifikant die Thrombozytopenie, die durch die Infusion hoher Dosen von humanem VWF ausgelöst wurde.69 In Übereinstimmung mit der Fähigkeit von ApoA-I, die VWF-Selbstassoziation zu modulieren, korreliert seine Plasmakonzentration umgekehrt mit der Höhe der hyperadhäsiven VWF bei Patienten mit TTP und Sepsis. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Beeinflussung der VWF-Selbstassoziation ein neuer Ansatz zur Behandlung thrombotischer Erkrankungen sein könnte, die mit hyperadhäsivem VWF verbunden sind, einschließlich TTP.
Die VWF-spaltende Metalloprotease ist das 13. Mitglied einer Familie von 18 verschiedenen Enzymen des ADAMTS-Typs, die bisher identifiziert wurden und strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen.16,17 ADAMTS13 besteht aus einer N-terminalen Metalloproteasedomäne vom Reprolysin-Typ (M), gefolgt von einer Desintegrin-Domäne (D), einer Thrombospondin-1-ähnlichen Domäne (T), einer cysteinreichen Domäne (C), die eine Arginin-Glycin-Aspartat-Sequenz enthält, eine Spacer-Domäne (S), sieben weitere Thrombospondin-1-ähnliche Domänen (T2-8) und zwei nicht identische Domänen vom CUB-Typ (CUB1-2) am C-terminalen Ende des Moleküls (Abb. 24.2). 24.2). Die CUB-Domänen enthalten Peptidsequenzen, die den Komplementunterkomponenten C1r/C1s, dem embryonalen Seeigelprotein egf und dem bone morphogenic protein-1 ähneln.70 ADAMTS13 ist ein Zn2+- und Ca2+-forderndes 190.000-Dalton-Glykoprotein, dessen Gen sich auf Chromosom 9q34 befindet und vorwiegend in den stellaten Zellen der Leber produziert wird.71,72 ADAMTS13 wird durch EDTA gehemmt; daher werden Funktionstests des Enzyms am besten mit zitrathaltigem Plasma durchgeführt.12,14-17,73-77 Plasma, das mit Heparin, Chlormethylketonen (z. B. Phenylalanin-Prolin-Aspartat-Chlormethylketon), Hirudin und anderen direkten Thrombininhibitoren (DTIs) antikoaguliert wurde, ist ebenfalls für Tests geeignet. Auch mit Proteaseinhibitoren behandeltes Serum ist für Tests geeignet.78
Die Spaltung von VWF durch ADAMTS13 hängt von Konformationsänderungen in VWF ab, die durch Scherbelastung hervorgerufen werden, einer Kraft, die die Konformation von VWF-Multimeren von globulär zu offen verändert.79 Diesem Konformationsübergang folgt die Entfaltung einer oder mehrerer A2-Domänen innerhalb des VWF-Multimers, wodurch die Peptidbindung Tyr1605-Met1606 der Spaltung durch ADAMTS1379 oder der Oxidation von Met1606 durch Hypochlorit ausgesetzt wird.54 Neben der Scherkraft wird der Übergang in die zugängliche Konformation auch durch Veränderungen in der Struktur der A2-Domäne begünstigt, die durch die Anlagerung von Kohlenhydraten verursacht werden,80 durch Aminosäuresubstitutionen bei Typ 2A VWD, die die Faltung der A2-Domäne destabilisieren,81 sowie durch Mutationen bei Typ 2B VWD82 und die Bindung von Ristocetin,83 die beide gleichzeitig die A1-Domäne für die Bindung von Blutplättchen und die ADAMTS13-Spaltstelle freilegen.
Die Erkennung und Spaltung von VWF durch ADAMTS13 wurde umfassend untersucht. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass im nativen ADAMTS13-Molekül die C-terminalen T8-CUB-Domänen in Kontakt mit den N-terminalen MDTCS-Domänen stehen, eine intramolekulare Interaktion, die die Fähigkeit der MDTCS-Domänen zur Bindung und Spaltung des VWF-78-Peptidsubstrats teilweise hemmt. In dieser nativen Konformation ist ADAMTS13 teilweise autoinhibiert.84,85 Die Fähigkeit von ADAMTS13, sich in diese Konformation zu falten, wird offenbar durch die Flexibilität von vier mutmaßlichen Linker-Sequenzen erleichtert, die sich zwischen den Domänen T1 und T2, T2 und T3, T4 und T5 sowie T8 und CUB1 befinden.86 Die Autoinhibition wird aufgehoben, wenn die C-terminalen Domänen entweder abgeschnitten oder von Antikörpern oder multimerem VWF gebunden werden, so dass die MDTCS-Domänen mit dem Substrat in Kontakt treten können.
Auf der Grundlage von Mutationsanalysen, Bindungsstudien, kinetischen Analysen und der Verwendung synthetischer Peptidsubstrate wurden mehrere Interaktionsstellen zwischen dem konformativ aktiven ADAMTS13 und der entfalteten VWF-A2-Domäne identifiziert und in einem molekularen Reißverschlussmodell87 zusammengefasst, das in Abb. 24.3 schematisch dargestellt ist. Wenn der multimere VWF einer kritischen Scherbeanspruchung ausgesetzt wird, wird zunächst ein Exosit in der A2-Domäne freigelegt. Dieses Exosit umfasst die helikale Region Glu1660-Arg1668, die sich 65 Aminosäuren C-terminal zur Spaltstelle befindet, und bindet mit hoher Affinität (KD ~ 10 nM) an die Spacer-Domäne von ADAMTS13.88-90 Scherstress setzt auch ein zweites Exosit in der A2-Domäne mit niedriger Affinität an oder in der Nähe von Asp1614 (P9′-Stelle) frei, das mit Arg349 in der Desintegrin-Domäne von ADAMTS13 interagiert.91 Durch die Wechselwirkung dieser beiden Exosite mit komplementären Regionen in ADAMTS13 wird die Tyr1605-Met1606-Spaltstelle in VWF mit dem aktiven Zentrum in der Metalloproteasedomäne von ADAMTS13 verbunden. Dies beinhaltet die Interaktion von Leu1603 (P3-Stelle) in VWF mit komplementären Leu198, Leu232 und L272 (S3-Stelle) in ADAMTS13, Tyr1605 (P1-Stelle) in VWF mit Leu151 und Val195 (S1-Stelle) in ADAMTS13 und Met1606 (P1′-Stelle) in VWF mit Asp252-Pro256 (S1′-Stelle) in ADAMTS13.92 Phage-Display- und Zufallsmutationsanalysen bestätigen und zeigen, dass auch Aminosäuren in der P3-P2′- und P11′-Region (Ile1616) für die Spaltung wichtig sind.93 Somit erleichtert die sequentielle Interaktion dieser komplementären Regionen in den beiden Multidomänenproteinen die spezifische Spaltung der Spaltbindung.
Das Versagen des Abbaus von ULVWF-Multimeren steht seit langem im Verdacht, familiäre und erworbene idiopathische Formen der TTP zu verursachen oder ein Individuum für diese Erkrankungen zu prädisponieren (Abb. 24.4).11,94 Kritische Experimente zur Verifizierung dieses Konzepts wurden 1997 und 1998 durchgeführt. Bei vier Patienten mit chronisch rezidivierender TTP wurde ein Mangel an Plasma-ADAMTS13-Aktivität festgestellt.12 Da kein Inhibitor des Enzyms nachgewiesen werden konnte, wurde dieser Mangel auf eine Anomalie in der Produktion, dem Überleben oder der Funktion der Protease zurückgeführt. Im darauffolgenden Jahr wurde die Pathogenese der häufigeren erworbenen idiopathischen TTP aufgeklärt.13-15 Patienten mit erworbener idiopathischer TTP wiesen während der akuten Episoden nur eine geringe oder gar keine Plasma-ADAMTS13-Aktivität auf, die sich jedoch nach der Genesung wieder normalisierte. Obwohl die Plasmatests in diesen Studien nicht physiologisch waren, waren sie dennoch innovativ und informativ. Immunglobulin (Ig)-G-Autoantikörper gegen das Enzym sind wahrscheinlich der Grund für die fehlende Proteaseaktivität bei den meisten Patienten mit erworbener idiopathischer TTP.13-15 Die Gründe für diese vorübergehende Immundysregulation sowie für die selektive antigene Ausrichtung der VWF-spaltenden Protease sind noch nicht bekannt.
Patienten mit familiärer chronisch-rezidivierender TTP haben häufig ULVWF-Multimere in ihrem Plasma.11,94 ULVWF-Multimere werden mit einer empfindlichen Agarosegel-Elektrophorese-Methode in einigen Patientenplasmaproben während akuter Episoden der erworbenen idiopathischen TTP nachgewiesen, nicht aber nach der Genesung.94 Diese Befunde wurden von Forschern erklärt, die bei der familiären chronisch-rezidivierenden TTP eine chronische Abwesenheit von ADAMTS13 im Plasma sowie eine vorübergehende Hemmung des Enzyms während akuter Episoden der erworbenen idiopathischen TTP entdeckten.12-15
Die meisten Patienten mit familiärer TTP haben weniger als 5 % der normalen ADAMTS13-Aktivität in ihrem Plasma, unabhängig davon, ob das Plasma während oder nach akuten Episoden gewonnen wird (vorausgesetzt, sie haben nicht kürzlich Plasmainfusionen erhalten). Die meisten Patienten mit erworbener idiopathischer TTP haben nur während akuter TTP-Episoden weniger als 5 % der normalen ADAMTS13-Aktivität in ihrem Plasma.1215,24,95 Ein schwerwiegender Mangel an ADAMTS13-Aktivität im Plasma von Patienten mit TTP korreliert mit der Unfähigkeit, ULVWF-Multimere zu spalten, wenn sie aus der Oberfläche von Endothelzellen austreten (siehe Abb. 24.4).59 Infolgedessen bleiben die von Endothelzellen sezernierten ULVWF-Multimere an diesen Zellen verankert und assoziieren sich selbst zu langen Strängen59 und sind in der Lage, vorbeiziehende Thrombozyten durch Bindung von Thrombozyten-GPIbα einzufangen (Abb. 24.5). 24.5).68 (Thrombozyten binden nicht spontan an die kleineren VWF-Formen, die nach der Spaltung von ULVWF-Multimeren zirkulieren.)56 Weitere Thrombozyten schließen sich anschließend dem wachsenden Thrombozytenaggregat an (das über aktiviertes αIIbβ3 rekrutiert wird), das bis zum Verschluss des Gefäßes wachsen kann (siehe Abb. 24.4).59,96 Obwohl die meisten Fälle von idiopathischer TTP einen schweren ADAMTS13-Mangel aufweisen, ist die Enzymaktivität bei einem Teil der Patienten nicht so stark vermindert, wie dies mit den derzeit verfügbaren Assays gemessen wird.97 Es ist noch nicht klar, ob dies auf eine Beeinträchtigung der Enzymaktivität durch Antikörper, die mit den verfügbaren Assays nicht nachgewiesen werden können, auf eine Resistenz des VWF gegenüber der Spaltung (z. B. aufgrund einer oxidativen Modifikation) oder auf andere Ursachen zurückzuführen ist.53 Dennoch ist es wahrscheinlich, dass viele Patienten dieser Kategorie von einer Plasmaaustausch-Therapie profitieren werden.98 Es sollte auch betont werden, dass ein ADAMTS13-Mangel weder empfindlich noch spezifisch für die Diagnose einer erworbenen TTP ist (die ADAMTS13-Aktivität ist bei vielen anderen Erkrankungen vermindert)99.
ULVWF-Stränge sind in der Lage, sich bei fehlender ADAMTS13-Aktivität von den Endothelzellen abzulösen, da sie durch die zunehmende Spannung, die durch die Flüssigkeitsscherung beim Anhaften und Aggregieren von Thrombozyten entsteht, mechanisch durchtrennt werden.59 Die abgelösten ULVWF-Plättchen-Stränge können stromabwärts gelegene Mikrogefäße verstopfen und so zur Organischämie beitragen.
Die Plasma-ADAMTS13-Aktivität ist bei Patienten mit familiärer TTP fast immer nicht vorhanden oder stark reduziert,12,100,101 als Folge von homozygoten oder compound heterozygoten Mutationen des ADAMTS13-Gens.18,24,95,102,103 Mutationen bei der familiären TTP wurden im gesamten Gen in Regionen nachgewiesen, die für verschiedene Domänen kodieren (siehe Abb. 24.2). Bei einem schweren angeborenen Mangel an ADAMTS13-Aktivität beginnen die TTP-Episoden gewöhnlich im Säuglings- oder Kindesalter. Bei einigen Patienten treten jedoch erst nach Jahren (z. B. während der ersten Schwangerschaft), wenn überhaupt, offene TTP-Episoden auf102. Die letztgenannte Beobachtung deutet darauf hin, dass bei einigen Patienten eine Restaktivität von ADAMTS13 verbleibt und akute TTP-Episoden ausgelöst werden, wenn die Freisetzung von ULVWF aus Endothelzellen die begrenzte Kapazität ihres ADAMTS13 übersteigt, diese zu verarbeiten. Ein Fall, in dem dies regelmäßig vorkommen kann, ist die Schwangerschaft: Es ist bekannt, dass der VWF-Spiegel während der Schwangerschaft ansteigt.104-106 In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung wird bei Frauen mit kongenitaler TTP häufig während der ersten Schwangerschaft diagnostiziert.29 Bei Säuglingen mit neonatalem Beginn der kongenitalen TTP und weniger als 5 % ADAMTS13-Aktivität ist vorübergehendes oder fortschreitendes Nierenversagen oft eine wichtige Komponente der Erkrankung.107 Diese Patienten ähneln klinisch zwei Patienten, die 1960 von Schulman und Kollegen108 und 1978 von Upshaw109 beschrieben wurden; daher wird diese pädiatrische Untergruppe manchmal als „Upshaw-Schulman-Syndrom“ bezeichnet.
Bei vielen Patienten mit erworbener TTP ist die Plasma-ADAMTS13-Aktivität während akuter Schübe entweder nicht vorhanden oder stark reduziert und steigt bei der Genesung an, unabhängig davon, ob es sich um einzelne oder wiederkehrende Schübe handelt.1315 IgG-Autoantikörper, die die Plasma-ADAMTS13-Aktivität hemmen, lassen sich bei 44 % bis 94 % dieser Patienten nachweisen.13-15,102,110,111 Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei vielen Patienten mit erworbener idiopathischer TTP, die mit einem ADAMTS13-Mangel einhergeht, ein vorübergehender oder intermittierend wiederkehrender Defekt in der Immunregulation vorliegt. Antikörper, die Plasma-ADAMTS13 hemmen, wurden auch bei einigen wenigen Patienten mit Ticlopidin- oder Clopidogrel-assoziierter TTP identifiziert.34,112 Es ist noch nicht bekannt, ob ein vorübergehender schwerer Defekt der ADAMTS13-Produktion oder des Überlebens bei Patienten mit erworbener TTP auftritt, die keine nachweisbaren Autoantikörper gegen das Enzym haben. Alternativ könnte das Versäumnis, hemmende Autoantikörper bei einigen Patienten nachzuweisen, auf die begrenzte Empfindlichkeit der derzeit verwendeten Testsysteme zurückzuführen sein. Nicht-inhibitorische Autoantikörper, die ADAMTS13 binden und potenziell die immunologische Clearance von ADAMTS13 vermitteln könnten, werden von den derzeitigen Testsystemen nicht erkannt.
In einer Studie wurden die ADAMTS13-Epitope untersucht, die von polyklonalen Autoantikörpern bei 25 Patienten mit erworbener TTP erkannt wurden,113 wobei sich herausstellte, dass die Ziele der Antikörper ausnahmslos die cysteinreiche/Spacer-Domäne (CS)-Sequenz umfassten; bei drei Patienten war dies die einzige Region, gegen die die Antikörper gerichtet waren. Die anderen 22 Autoantikörper reagierten mit der CS-Domänensequenz plus den CUB-Domänen (64 %), der Metalloprotease/Disintegrin-ähnlichen/ersten Thrombospondin-1-ähnlichen Domäne (MDT) (56 %) oder der Region mit den zweiten bis achten Thrombospondin-1-ähnlichen Wiederholungen (T2-8, 28 %) (siehe Abb. 24.2). Die Propeptidregion wurde ebenfalls von 20 % der Autoantikörper identifiziert,113 was darauf hindeutet, dass die Entfernung des Propeptids für die Sekretion des aktiven Enzyms nicht erforderlich ist.114 Autoantikörper hemmen die Aktivität von ADAMTS13 oder verringern sein Überleben. In einer anderen Studie mit sieben Patienten identifizierten Luken et al.115 bei sechs Patienten ADAMTS13-Autoantikörper, die sich ausschließlich an die Spacer-Domäne (S) banden; bei dem siebten Patienten banden die Antikörper sowohl an die S-Domäne als auch an T2-8-Wiederholungen. Durch Mutagenese stellten diese Forscher fest, dass die Regionen Thr572-Asn579 und Val657-Gly666 in der Spacer-Domäne von ADAMTS13 die gemeinsamen Epitope für die Autoantikörperbindung waren.116 Wenn Arg660, Tyr661 oder Tyr665 durch Alanin ersetzt wurde, wurde die Bindung der Autoantikörper von den sechs TTP-Patienten eliminiert.117
Autoantikörper gegen ADAMTS13 bei Patienten mit erworbener TTP gehören überwiegend zur IgG-Klasse,118 obwohl auch Antikörper der IgM- und IgA-Klasse nachgewiesen wurden.119 Die Klonierung und Sequenzierung der monoklonalen Antikörper von Patienten mit erworbener TTP zeigen, dass das Gensegment der schweren Kette VH1-69 bevorzugt in die variable Region der Immunglobuline eingebaut wird.120,121 Diese Präferenz lässt vermuten, dass die CDR2- oder CDR3-Region von VH1-69 zur Spezifität für ein Epitop auf der Spacer-Domäne von ADAMTS13 beitragen kann. In einer Analyse der Verteilung von Antikörper-Subtypen bei 58 Patienten mit akut erworbener TTP wurden Antikörper aller IgG-Subtypen nachgewiesen.118 IgG4 war der häufigste Subtyp, der bei 90 % der Patienten entweder allein oder in Kombination mit anderen IgG-Subtypen auftrat.
Die Produktion von ADAMTS13-Autoantikörpern ist mit ziemlicher Sicherheit genetisch beeinflusst. Diese Tatsache wird durch die Entdeckung einer erworbenen TTP bei Zwillingsschwestern unterstrichen, die durch ADAMTS13-Autoantikörper verursacht wird.122 Rückfälle treten bei 23 % bis 44 % der Patienten mit erworbener TTP auf,102,110,123,124 häufig im ersten Jahr nach der ersten Episode.102 Rückfälle treten am häufigsten bei Patienten mit den niedrigsten ADAMTS13-Aktivitätswerten auf (<10 %).
Schwangerschaft und Wochenbett stellen im Hinblick auf die TTP eine besondere Herausforderung dar. Erstens weisen Präeklampsie und HELLP-Syndrom (Hämolyse, erhöhte Leberenzyme, niedrige Blutplättchen) viele klinische Merkmale auf, die sich mit der TTP überschneiden, und können bestimmte pathophysiologische Merkmale wie systemische endotheliale Dysfunktion und Proteinurie gemeinsam haben (siehe Kapitel 32).125 Das HELLP-Syndrom kann insofern besonders schwer von der TTP zu unterscheiden sein, als es auch eine mikroangiopathische hämolytische Anämie, erhöhte LDH-Werte und eine Thrombozytopenie (wenn auch in der Regel nicht so schwerwiegend wie bei der TTP) aufweist.126 Die TTP in der Schwangerschaft kann mit Autoantikörpern gegen ADAMTS13 assoziiert sein, und die Krankheit manifestiert sich in der Regel kurz vor oder nach der Geburt.127 Die Schätzungen des Risikos eines erneuten Auftretens bei nachfolgenden Schwangerschaften variieren stark und reichen von 26 % bis 73 % pro Schwangerschaft.102
Die ADAMTS13-Aktivität im Plasma gesunder Erwachsener liegt zwischen etwa 50 % und 178 % des normalen gepoolten Plasmas unter Verwendung der derzeit verfügbaren statischen Assays. Eine verringerte ADAMTS13-Aktivität wurde auch bei Lebererkrankungen, disseminierten malignen Erkrankungen,128 systemischen Entzündungssyndromen, z. B. durch Endotoxin verursacht,129 akuter Pankreatitis,130 schwerer Sepsis und septischem Schock,131 sepsisbedingter DIC,132 und sepsisbedingter Organdysfunktion festgestellt.133-135 Darüber hinaus können niedrige ADAMTS13-Spiegel in der Schwangerschaft und bei Neugeborenen festgestellt werden.136 Mit Ausnahme der peripartalen Frauen, die eine offene TTP entwickeln,102,110 ist die ADAMTS13-Aktivität bei Patienten mit diesen Erkrankungen nicht auf die extrem niedrigen Werte (<5 % des Normalwerts) reduziert, die bei den meisten Patienten mit familiärer oder erworbener TTP zu finden sind.
ADAMTS13-Assays
ADAMTS13-Assays bestimmen die proteolytische Aktivität, den Antigengehalt und den Gehalt an Anti-ADAMTS13-Autoantikörpern. Frühe ADAMTS13-Aktivitätstests basierten auf dem Abbau von gereinigten VWF-Multimeren in Gegenwart von Denaturierungsmitteln und der Quantifizierung der Spaltprodukte durch Immunoblotting,74,75 Restkollagenbindung,137 oder verringerte Ristocetin-induzierte Thrombozytenaggregation.138 Obwohl diese Tests empfindlich sind, sind sie umständlich und zeitaufwändig in der Durchführung und erfordern den Einsatz von Denaturierungsmitteln. Diese Assays wurden ersetzt, nachdem Untersuchungen der rekombinanten VWF-Fragmente minimale Sequenzen ergaben, die für Aktivitätsmessungen erforderlich sind. Kokame und Mitarbeiter führten partielle Deletionen der VWF-A2-Domäne durch und identifizierten ein Minimalpeptid von 73 Aminosäuren (VWF73, Asp1596-Arg1668), das von ADAMTS13 in Abwesenheit von Denaturierungsmitteln unter statischen Bedingungen effizient gespalten wurde.88 In der Folge wurden mehrere Assays entwickelt, die auf der Spaltung von Peptiden basieren, die VWF73 umfassen, wie z. B. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET),97 ein HRP-gebundener VWF78,139 ELISA,140 Immunoblotting,141 und Massenspektrometrie142.
Im Jahr 2008 wurde eine zweite internationale Gemeinschaftsstudie durchgeführt, um die Leistung von acht funktionellen und drei Antigen-Assays für ADAMTS13 zu vergleichen.143 Der Vergleich dieser Methoden zeigte, dass Spalt-Assays, die auf modifizierten VWF-Peptiden als Substraten basieren, eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine geringe Varianz und Variabilität zwischen den Methoden bieten. Der FRET-VWF73-Assay wird seitdem häufig zur Quantifizierung der ADAMTS13-Aktivität in Patientenproben eingesetzt. Obwohl der FRET-basierte Assay einfach durchzuführen ist, hat er mehrere Einschränkungen. Erstens sollte die FRET-VWF73-Spaltung unter Verwendung von zitrathaltigem Plasma als ADAMTS13-Quelle unter 33 °C durchgeführt werden, da bei 37 °C eine signifikante irreversible Inaktivierung von ADAMTS13 durch die Zitrat-vermittelte Kalziumchelation stattfindet. Zweitens erfordert eine optimale Detektion des Fluoreszenzsignals die Spaltung des FRET-VWF73-Substrats bei einem pH-Wert von 6,1, was die Spaltgeschwindigkeit verringert. Drittens bilden einige hemmende Autoantikörper bei diesem suboptimalen pH-Wert keine stabilen Komplexe mit ADAMTS13, und diese Antikörper bleiben in Hemmungsstudien unerkannt. Viertens wird das Fluoreszenzsignal durch Hämoglobin und Bilirubin aufgrund der spektralen Überlappung erheblich gestört. Es wurde ein verbessertes FRET-basiertes Peptidsubstrat, FRETS-rVWF71, entwickelt. Mit diesem verbesserten Substrat kann die ADAMTS13-Aktivität in Serum und zitriertem oder heparinisiertem Plasma bei physiologischem pH-Wert, Ionenstärke und Kalziumkonzentration gemessen werden, ohne dass es zu Störungen durch endogene VWF-Multimere, Bilirubin oder Hämoglobin im Plasma kommt.78 Eine weitere Einschränkung dieser peptidbasierten Aktivitätsassays besteht darin, dass die Fähigkeit von ADAMTS13, multimeres VWF unter Scherbelastung zu spalten, nicht bewertet wird. Obwohl gezeigt wurde, dass die durch ständiges Vortexen erzeugte Scherbeanspruchung die Spaltung von VWF-Multimeren fördert,144 ist die Quantifizierung der Spaltprodukte durch Immunoblotting weiterhin zeitaufwändig. Es sind mindestens vier kommerzielle Kits für die Messung der ADAMTS13-Aktivität erhältlich, die auf bekannten Methoden basieren. Diese Kits wurden jedoch nicht in direkten Vergleichs- und Standardisierungsstudien evaluiert.
ADAMTS13-Antigenspiegel wurden mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern quantifiziert.145,146 Der Einfluss von Trunkierung, Mutationen und Autoantikörpern auf die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieser Tests ist nicht klar. Es gibt fünf kommerzielle Testkits zur Messung des ADAMTS13-Antigenspiegels, aber es wurde keine Validierung und kein Vergleich mit anderen Tests durchgeführt.
Im Jahr 2015 wurde der erste internationale Standard für ADAMTS13 erstellt und in 32 Labors aus 14 Ländern auf ADAMTS13-Aktivität und Antigenspiegel im Vergleich zu lokalen Standards getestet.147 Dieser Plasmastandard, der als WHO IS (12/252) bezeichnet wurde, wurde aus gepooltem Plasma von 38 normalen gesunden Spendern gewonnen. Diese Studie ergab einen Konsensmittelwert von 0,91 Einheiten/ml ADAMTS13-Aktivität für dieses Plasma mit einer Variabilität zwischen den Laboren von 12,4 % und 0,92 Einheiten/ml ADAMTS13-Antigen mit einer Variabilität zwischen den Laboren von 16,3 %. Die große Variabilität zwischen den Labors war nicht in erster Linie auf die Verwendung unterschiedlicher lokaler Standards zurückzuführen, sondern auf methodische Unterschiede zwischen den Labors.
Bei der Untersuchung von Anti-ADAMTS13-Autoantikörpern wird in der Regel hitzeinaktiviertes Patientenplasma mit einer bekannten Menge gepoolten normalen Plasmas gemischt und die restliche ADAMTS13-Aktivität gemessen. Nicht neutralisierende Antikörper werden durch Immunoblotting nachgewiesen.148
Obwohl bisher kein ADAMTS13-spezifischer Nicht-Antikörper-Inhibitor identifiziert wurde, können mehrere Proteine und Peptide die ADAMTS13-Spaltung von VWF unter speziellen Bedingungen hemmen. Dazu gehören Hämoglobin, IL-6, Thrombospondin-1 und neutrophile α-Defensine. In allen Fällen binden die hemmenden Substanzen offenbar das Substrat VWF und verhindern so, dass VWF von ADAMTS13 gespalten wird. Es wurde gezeigt, dass Hämoglobin auf diese Weise wirkt, indem es VWF-Stränge auf der Endotheloberfläche unter Strömung bindet und die Spaltung durch ADAMTS13 kompetitiv blockiert.149 Dieser Mechanismus kann zu den vasookklusiven Komplikationen bei Sichelzellkrankheitspatienten mit signifikanter Hämolyse beitragen und die TTP weiter verkomplizieren, wenn die Hämolyseraten hoch sind. Hohe IL-6-Konzentrationen (50 und 100 ng/ml) hemmen auch die ADAMTS13-vermittelte Spaltung endothelialer ULVWF-Stränge unter Fluss in vitro,50 was darauf hindeutet, dass dieser Mechanismus zur Thrombose während eines Zytokinsturms150 oder des Zytokinfreisetzungssyndroms beitragen kann.151 Thrombospondin-1, ein reichlich vorhandenes Protein in den α-Granula der Thrombozyten, das bei der Aktivierung der Thrombozyten in den Blutkreislauf freigesetzt wird, bindet die A2-A3-Regionen von VWF und blockiert und hemmt in vitro die Spaltung durch ADAMTS13.152 Diese prothrombotische Eigenschaft von Thrombospondin-1 steht im Einklang mit der mangelhaften Rekrutierung von Thrombozyten am aktivierten oder verletzten Endothel und der verstärkten Embolisierung von Thrombozyten-Thromben, die bei Thrombospondin-1-Knockout-Mäusen beobachtet wurde.153 Humane neutrophile Peptide, die als α-Defensine bekannt sind und von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden, können die VWF-A2-Domäne binden und die ADAMTS13-vermittelte Spaltung kompetitiv blockieren.154 Die Konzentrationen von α-Defensinen sind im Plasma von Patienten mit erworbener TTP bis zum Siebenfachen erhöht.