Alai

Eine kurze Geschichte von T. reesei

Die ältesten biotechnologischen Praktiken, bei denen Pilze für die Herstellung von Bier, Wein und Käse eingesetzt werden, könnten mehrere Jahrtausende zurückreichen, d. h. bis zum Beginn der schriftlichen Zivilisation selbst. Die Entdeckung des filamentösen mesophilen Ascomyceten Trichoderma reesei (damals noch Trichoderma viride) wegen seines erstaunlichen Potenzials zur Produktion extrazellulärer Cellulasen erfolgte dagegen erst vor gut 70 Jahren. Zunächst wurde das zerstörerische Potenzial des ursprünglichen Trichoderma sp., der während des Zweiten Weltkriegs aus verrottenden Ausrüstungsgegenständen der US-Armee auf den Salomon-Inseln isoliert wurde, als eher problematisch angesehen. Dennoch dauerte es nicht lange, bis Forscher an den Natick Army Research Laboratories unter der Leitung von Mary Mandels und Elwyn T. Reese, dem namensgebenden Forscher, versuchten, dieses problematische Potenzial in zweckmäßige Produkte umzusetzen. In einem Screening von 14.000 Schimmelpilzen aus der Quartermaster Collection zeigte Trichoderma sp. QM6a eine herausragende Fähigkeit, native kristalline Cellulose abzubauen. Die Bezeichnung „QM6a“ für das letzte verbliebene ursprüngliche Trichoderma-Isolat, die es als die sechste von sechs Kulturen des Pilzes identifizierte, die in der Quartermaster Collection in Natick gelagert wurden, blieb erhalten. Dieser Stamm gilt nicht nur als der Referenzstamm von T. reesei, sondern ist auch derjenige, von dem alle heute in der Industrie verwendeten Mutanten abgeleitet wurden.

Damals wie heute wurde die Forschung an T. reesei von der Idee angetrieben, dass seine sekretierten Zellulasen den 200 Jahre alten Kampf um die wirtschaftliche Erzeugung von Brennstoffen aus erneuerbarer, lignozellulosehaltiger Biomasse entscheidend verändern könnten. Die T. reesei-Forschung hat seither Pionierarbeit für das Konzept der enzymatischen Verzuckerung von Cellulose durch eine synergistische Kombination verschiedener Cellulase-Aktivitäten geleistet und den Grundstein für unser heutiges Verständnis der Regulation der beteiligten Enzyme gelegt. Seine wichtigste Cellobiohydrolase CBH1 (CEL7a) war auch die erste eukaryontische Cellulase, die kloniert wurde, und die erste Cellulase, deren Struktur gelöst wurde. Ein wichtiger Schritt zur industriellen Nutzung von T. reesei-Cellulasen war die Entwicklung effizienter Stammmutagenese- und Screening-Verfahren in den 1970er Jahren. In den folgenden zwei Jahrzehnten konnte der Titer des vom ursprünglichen Stamm QM6a produzierten extrazellulären Proteins durch Mutageneseprogramme in Natick und an der Rutgers University um das bis zu 20-fache gesteigert werden. Letzteres gipfelte in der Isolierung des Stammes RUT-C30 (wobei „RUT“ für Rutgers steht). Obwohl der Goldstandard für die Cellulaseproduktion in der Industrie bei über 100 g/l liegt, ist dieser Stamm immer noch der Prototyp eines öffentlich zugänglichen Cellulase-Hyperproduzenten mit Titern des extrazellulären Proteins von bis zu 30 g/l auf dem Cellulase-induzierenden Substrat Laktose.

Zunächst wurden jedoch andere kommerzielle Anwendungen für Cellulasen entwickelt, als klar wurde, dass eine effiziente und vollständige Verzuckerung von Lignozellulose-Biomasse zu fermentierbaren Zuckern viel mehr enzymatische Aktivitäten erfordert als ursprünglich angenommen. Auch hier hat die Forschung mit T. reesei neue Wege in der Enzymologie des Cellulose- und Hemicelluloseabbaus beschritten und tut dies auch heute noch. Mit Hilfe der Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskopie konnte nun auch der Celluloseabbau sichtbar gemacht werden, wobei gezeigt wurde, wie die wichtigste Cellobiohydrolase CBH1/CEL7A in einer Richtung entlang der Celluloseoberfläche gleitet. Anfang der 1990er Jahre wurden Transformationstechniken verfügbar, die die gentechnische Veränderung von T. reesei erleichtern. In den folgenden zehn Jahren trugen diese Technologien dazu bei, neue Erkenntnisse über die Regulierung seiner Enzyme zu gewinnen und das vom Pilz ausgeschiedene Enzymprofil zu verändern. Zu dieser Zeit war T. reesei auch einer der ersten Wirte für die Expression von Säugetierproteinen, wie z.B. die Expression von Kälberchymosin unter cbh1 (cel7a) Expressionssignalen.

Ende der 1990er Jahre entdeckten Kuhls et al., dass Hypocrea jecorina tatsächlich die sexuelle Form von T. reesei ist, was der Grund dafür ist, dass in einer Reihe von nachfolgenden Veröffentlichungen H. jecorina als Artname anstelle von T. reesei verwendet wurde. Eine detailliertere Untersuchung der sexuellen Entwicklung führte zu der Hypothese, dass der Stamm QM6a tatsächlich weiblich steril ist, was in der Folge mit einer Mutation im MAP-Kinase-Gerüst kodierenden Gen ham5 in Verbindung gebracht werden konnte.

Mit der Jahrtausendwende, die in der Genetik als eine Abkehr von der Untersuchung isolierter Gene und Signalwege hin zur Untersuchung ganzer Genome betrachtet werden kann, begann für T. reesei das so genannte Genomische Zeitalter. Der erste globale Ansatz zur Untersuchung der Genexpression von T. reesei im Jahr 2003 war eine transkriptomische Studie von Foreman et al., die DNA-Mikroarrays auf der Grundlage von cDNAs konstruierten, die über 5000 verschiedenen Transkripten des T. reesei-Genoms entsprachen. Fünf Jahre später legte die Genomsequenzierung und -analyse des ursprünglichen T. reesei-Isolats QM6a den Grundstein für die breite Anwendung von genomweiten Studien. In den folgenden Jahren führte die vergleichende Genomanalyse einer Reihe von Cellulase-Hyper- und Nullproduzentenstämmen zur Entdeckung potenziell neuer Faktoren, die an der Cellulase-Hyperproduktion beteiligt sind, wie z. B. der nukleozytoplasmatische Transport, der vakuoläre Proteinverkehr und der mRNA-Umsatz. Diese vergleichenden Analysen profitierten von der Tatsache, dass alle in Wissenschaft und Industrie verwendeten T. reesei-Stämme vom Stamm QM6a abgeleitet sind. Fünfundsechzig Jahre nach den ersten Studien von Elwyn Reese zum Zelluloseabbau durch T. reesei beträgt die weltweit installierte Produktionskapazität für zellulosehaltige Biokraftstoffe heute 480,5 Millionen Liter Ethanol pro Jahr (MMLY), von denen 380,5 MMLY (oder etwa 80 %) unter Verwendung von T. reesei-Enzymformulierungen wie Accellerase und Cellic hergestellt werden (Abb. 1a). Zweifelsohne erforderten diese Anstrengungen eine Weiterentwicklung der zugrunde liegenden Technologie auf mehreren Ebenen, einschließlich der Verfahrenstechnik und der Substratvorbehandlung. Die Herstellung und Optimierung von Enzymformulierungen für den Verzuckerungsschritt der Biomasse war und ist einer der Schlüsselfaktoren für die Kosteneffizienz von Zellulose-Ethanolprozessen. Darüber hinaus ist die Enzymproduktion mit T. reesei keineswegs auf die Produktion von Bioraffinerie-Enzymen beschränkt. Tatsächlich werden etwa 11 % aller technischen Enzymformulierungen, die von der Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products registriert sind, mit T. reesei als Expressionswirt hergestellt (Abb. 1b, c). Nicht zuletzt hat T. reesei nach wie vor eine große Bedeutung in der Forschung, was sich in mehr als 100 jährlich veröffentlichten Forschungsartikeln über den Pilz oder seine Enzyme zeigt (Abb. 1d).

Der T. reesei Biomasse-Enzym-Mix: neue Erkenntnisse und Grenzen

In der Natur wird der Abbau von Lignocellulose selten von einem einzigen Organismus durchgeführt. Vielmehr wird er durch die sequentielle Abfolge und kollektive Anstrengung mehrerer Organismen erreicht, die mehrere kohlenhydrataktive Enzyme (CAZyme) produzieren, um die verschiedenen Polymere abzubauen. Daher ist es nicht überraschend, dass der sekretierte Cellulase-Mix von T. reesei erheblich angepasst werden musste, um eine kostengünstige Enzymformulierung für die vollständige Verzuckerung von Lignozellulose zu liefern. Schon früh erkannten die Forscher, dass die β-Glucosidase-Aktivität von T. reesei nicht ausreichend war, da der größte Teil der Aktivität an die Pilzzellwand gebunden ist. Folglich verbesserte eine erhöhte β-Glucosidaseaktivität den Celluloseabbau, weil sie der Produkthemmung durch Cellobiose entgegenwirkt, die wiederum durch das Zusammenwirken von Endoglucanasen und Cellobiohydrolasen freigesetzt wird. Durch diesen Rückkopplungsmechanismus wird die Verzuckerung von Cellulose ansonsten stark verlangsamt. Ebenso hemmen aus Hemicellulose gewonnene Xylo- und Mannooligosaccharide die Cellobiohydrolasen von T. reesei, was stark darauf hindeutet, dass ausreichende β-Xylosidase- und β-Mannosidase-Aktivitäten für einen effizienten Abbau von Lignocellulose erforderlich sind. Im Jahr 2003 beschrieben Foreman et al. zwei Proteine, die zusammen mit den wichtigsten Cellulasen induziert werden, und nannten sie Cellulose-induziertes Protein 1 und 2 (CIP1 und CIP2). Seitdem wurde nachgewiesen, dass sie für den effizienten Abbau von Lignocellulose wichtig sind. Neuere Ergebnisse zeigen, dass CIP1 strukturelle Ähnlichkeiten mit Lyasen aufweist, obwohl keine Lyaseaktivität nachgewiesen werden konnte, und dass CIP2 eine Glucuronoylesterase der CE15-Familie ist. Ein weiteres wichtiges sekretiertes Protein ist das Swollenin SWO1, das ein Kohlenhydrat-bindendes Modul (CBM) enthält, das mit einer Expansin-ähnlichen Domäne verbunden ist. Trotz seiner celluloseschädigenden Aktivität verstärkt SWO1 synergistisch die Endoxylanase- und nicht die Endoglucanase- oder Cellobiohydrolase-Aktivität während der enzymatischen Hydrolyse von vorbehandeltem Maisstroh. Eine vorgeschlagene Wirkungsweise besteht darin, dass es den Xylananteil der Lignocellulose für den Abbau durch Xylanasen zugänglicher macht und dadurch indirekt die Wirkung von Cellulasen fördert. Die wohl größte Revolution der letzten Jahre im Bereich des Celluloseabbaus war die Entdeckung der lytischen Polysaccharid-Monooxygenasen (LPMO). Diese Enzyme führten einen neuen, oxidativen Mechanismus in den Polysaccharidabbau ein. Es wird angenommen, dass LPMOs beim Zelluloseabbau auf die Oberfläche der kristallinen Zellulosefibrillen einwirken und sie dadurch für Zellulasen leichter zugänglich machen. Interessanterweise können diese Enzyme die für diesen Prozess benötigten Elektronen über einen weitreichenden Elektronentransfer aus dem Lignin der Pflanzenzellwand gewinnen und so die pflanzlichen Abwehrmechanismen gegen sie wenden. Alternativ können auch GMC-Oxidoreduktasen oder Cellobiose-Dehydrogenasen als Elektronenspender fungieren. Diese Erkenntnis könnte gut erklären, wie T. reesei seine LPMOs antreibt, da zuvor gezeigt wurde, dass mehrere solcher GMC-Oxidoreduktasen tatsächlich durch Weizenstroh induziert werden. Dieser oxidative Mechanismus ist jedoch keineswegs auf die Depolymerisation von Cellulose beschränkt. Ursprünglich für Chitin nachgewiesen, spielen LPMOs auch beim Abbau von Xyloglucan und Amylose eine Rolle. In der CAZy-Datenbank wurden die zu dieser Gruppe gehörenden Enzyme im Gegensatz zu ihrer früheren Klassifizierung als Glykosidhydrolasen (z. B. GH61) als „Hilfsaktivitäten“ (AA) neu klassifiziert und sind in den AA-Familien 9-11 und 13 zu finden. Wie bereits erwähnt, sind hemicellulolytische Aktivitäten für die vollständige Verzuckerung von Lignozellulose wichtig (siehe Harris et al.). Je nach den im Substrat vorhandenen Hemicellulosetypen sind unterschiedliche Mengen an einzelnen Aktivitäten erforderlich. Es ist daher bemerkenswert, dass das enzymatische Repertoire von T. reesei für bestimmte Arten von Hemicellulose-spezifischen Verknüpfungen einige deutliche Einschränkungen aufweist. Eine solche fehlende Aktivität ist die α-Xylosidase. Die Zugabe von α-Xylosidase zu einer kommerziellen T. reesei-Enzymformulierung verbesserte die Freisetzung von Xylose und Glucose aus vorbehandeltem Maisstroh. In ähnlicher Weise verbesserte der Zusatz einer Cellulase der GH-Familie 5 mit Aktivität gegen Glucomannan und Xylan eine synthetische T. reesei-Enzymzubereitung erheblich. Zu den anderen Aktivitäten, die in der T. reesei-Cellulasemischung fehlen oder sehr begrenzt sind, gehören Endo-Arabinase und verschiedene Pektinase-Aktivitäten. Die Ergänzung handelsüblicher Cellulasemischungen mit diesen Enzymaktivitäten verbesserte folglich die Verzuckerung verschiedener Substrate. Eine weitere noch zu klärende Frage ist die In-vivo-Funktion der sekretierten Laccase-ähnlichen Multikupferoxidasen, die im Genom von T. reesei kodiert sind.

Verbesserung von T. reesei als Wirtspflanze für die Proteinproduktion

Da die Cellulasen und die meisten anderen lignocelluloseabbauenden Enzyme koordiniert und bedingt exprimiert werden, stellt ihre transkriptionelle Regulierung ein logisches Ziel für die Verbesserung der Cellulaseproduktion des Pilzes dar. Einer der Hauptregulatoren ist der C2H2-Typ-Transkriptionsfaktor CRE1, der die Unterdrückung der Kohlenstoffkataboliten vermittelt. CRE1 schaltet die Transkription seiner Zielgene ab, wenn günstigere Kohlenstoffquellen wie Glukose vorhanden sind. Seine Verkürzung ist eine der Hauptursachen für die verbesserte Cellulaseproduktion, die durch zufällige Mutageneseprogramme von T. reesei QM6a erreicht wurde und zum Stamm RUT-C30 führte, der sowohl ein höheres Grundniveau als auch ein induziertes Niveau der Cellulaseproduktion aufweist. In ähnlicher Weise wird durch den Austausch von CRE1-Bindungsmotiven in der Promotorregion der wichtigsten Cellobiohydrolase cel7a durch die eines bekannten Cellulase-Aktivators die Unterdrückung durch Kohlenstoffkataboliten verringert und die Transkription von cel7a unter aktivierenden und repressiven Bedingungen erhöht. Darüber hinaus ist die Transkription von Cellulase, Xylanase und einer Reihe anderer Gene, die für Enzyme kodieren, die am Lignocellulose-Abbau beteiligt sind, strikt von dem Zn(II)2Cys6-Typ des Transkriptionsaktivators XYR1 abhängig. Dies steht im Gegensatz zu anderen Pilzen, einschließlich der Sordariomyceten Neurospora crassa und Fusarium fujikuroi, wo das XYR1-Ortholog ausschließlich die Xylanase-Genexpression moduliert. Es wurde festgestellt, dass eine Mutation, die zu einer verkürzten Form von XYR1 führt, den cellulase-negativen Phänotyp des Stammes QM9136 verursacht, der aus dem Mutageneseprogramm in Natick stammt. Dementsprechend weisen Cellulase-über- und -überproduzierende Mutanten erhöhte Spiegel der mRNA für die Transkriptionsaktivatoren xyr1 auf. Es wurde auch nachgewiesen, dass die Überexpression von XYR1 zu einer höheren Expression von Cellulasen führt und deren Katabolitenunterdrückung in Gegenwart von Glukose aufhebt. Außerdem führt eine Punktmutation in einer mutmaßlichen regulatorischen Region von XYR1 zu einem ähnlich deregulierten Expressionsmuster. Neben XYR1 und CRE1 regulieren die drei Transkriptionsfaktoren ACE1, ACE2 und ACE3 die Expression von Cellulase und Xylanase in T. reesei. Ähnlich wie CRE1 ist ACE1 ein C2H2-Zinkfinger-Repressor, und seine Deletion verbessert daher die Produktion von Cellulasen und Xylanasen. ACE2 und ACE3 sind ebenso wie XYR1 Transkriptionsaktivatoren vom Typ Zn(II)2Cys6. Fehlt ace2, ist die Transkription von Cellulasen und Xylanasen entsprechend reduziert, obwohl die Cellulase-Induktion durch Sophorose offenbar unbeeinflusst bleibt. Die Deletion von ace3 hebt die Cellulase-Transkription vollständig auf, reduziert aber lediglich die der Xylanasen. Während die Überexpression von ACE2 noch nicht versucht wurde, führt die Überexpression von ACE3 zu erhöhten Aktivitäten beider Enzymtypen, ebenso wie die Überexpression von sechs weiteren, bisher nicht charakterisierten Regulatoren. Dazu gehören zwei weitere Transkriptionsfaktoren vom Zn(II)2Cys6-Typ sowie zwei WD40-Proteine, ein Bromodomänen-Protein und eine mit gcn5 verwandte Acetyltransferase. Alle drei Zn(II)2Cys6-Transkriptionsaktivatoren (XYR1, ACE2 und ACE3) ähneln dem gut charakterisierten Gal4-Protein von S. cerevisiae. Es ist bekannt, dass Gal4 den Gcn5-haltigen SAGA-Komplex rekrutiert und dadurch die Transkription seiner Zielgene durch Histonacetylierung und Euchromatinbildung fördert. Tatsächlich ist das Gcn5-Ortholog von T. reesei für die Cellulase-Expression unverzichtbar und an der Acetylierung von Histonen im cbh1-Promotor beteiligt. In den letzten Jahren hat sich ein Bild herauskristallisiert, das zeigt, dass die Transkription von Cellulasen und verwandten CAZymen in Pilzen durch eine Kombination vieler Transkriptionsfaktoren gesteuert wird, die ein komplexes transkriptionsregulatorisches Netzwerk darstellen, das von gegenläufigen Aktivatoren und Repressoren beeinflusst wird. In Penicillium oxalicum zum Beispiel modulieren zwanzig Transkriptionsfaktoren die Aktivierung oder Unterdrückung von Cellulase-Genen. Unter diesen wurde ClrB als Schlüsselintegrator für alle anderen Regulatoren und ihre Zielgene identifiziert. Homologe dieser Regulatoren sind in T. reesei zu finden, aber angesichts der Vielfalt der Anpassungen bei der Regulierung der pflanzlichen Zellwand ist davon auszugehen, dass auch andere und unterschiedliche Regulatoren eine wichtige Rolle spielen werden. Ein weiterer wichtiger Akteur bei der Cellulase-Regulierung ist das T. reesei-Ortholog des rätselhaften Aspergillus LaeA, das an der Regulierung von Sekundärstoff-Genclustern in verschiedenen Pilzen beteiligt ist. Während die Deletion dieser putativen Protein-Methyltransferase zu einer starken Downregulation verschiedener Cellulase- und anderer CAZyme-Gene führt, kann ihre Überexpression deren Expression stark fördern. Ähnliche Effekte wurden für das mit LAE1 interagierende VEL1-Protein des VELVET-Komplexes gefunden.

Die meisten der oben genannten Studien liefern grundlegende Erkenntnisse über die Regulierung der Cellulasebildung. Da die meisten dieser Studien entweder am ursprünglichen T. reesei-Isolat QM6a oder am mäßig überproduzierenden Stamm QM9414 durchgeführt wurden, bleibt unklar, ob und inwieweit diese Effekte auch in überproduzierenden Stämmen umgesetzt werden können. In diesen Stämmen könnten Prozesse wie Translation, Sekretion und Umsatz der sekretierten Enzyme und nicht die Transkription eine weitere Steigerung der Cellulaseproduktion begrenzen. Es wird interessant sein zu sehen, ob mehrere der berichteten Möglichkeiten zur Verbesserung der Cellulase-Genexpression kombiniert werden können und wie solche Stämme im Vergleich zu den durch zufällige Mutagenese gewonnenen Hyperproduzenten abschneiden würden.

Die einfache Erhöhung der Transkription des betreffenden Gens führt nicht immer zu einer verbesserten Produktbildung, insbesondere im Fall von Nicht-Pilzproteinen. Eine erfolgreiche Strategie zur Umgehung der geringen Produktbildung ist der Fusionsgen-Ansatz, der neben Promotor und Terminatorregion eines hochexprimierten Gens auch das kodierte Protein als Expressionsverstärker verwendet. Bei T. reesei ist dies die Cellobiohydrolase, die für cel7A kodiert, welches das am stärksten exprimierte Protein unter Cellulase-induzierenden Bedingungen ist. Man geht davon aus, dass diese Genfusionen im Allgemeinen die mRNA-Stabilität, den Import in das ER und die Passage durch den Sekretionsweg erhöhen. Zu diesem Zweck wird häufig die modulare Struktur von CEL7A ausgenutzt, die aus einem katalytischen Modul, einem Linker und einer CBM besteht, wobei die C-terminale CBM durch das betreffende Gen ersetzt wird. Inzwischen gibt es Variationen dieses Genfusionsansatzes, die das Protein zur korrekten Faltung, Disulfidbrückenbildung und Glykosylierung in das ER bringen, anschließend aber eine intrazelluläre Proteinakkumulation anstreben, um den Abbau des gewünschten Produkts durch extrazelluläre Proteasen zu vermeiden. Eine solche Strategie verwendet Hydrophobine mit einem angehängten ER-Retentionssignal als Träger. Diese Fusionsproteine assemblieren sich selbst zu mizellenähnlichen Strukturen und können mit einem auf Tensiden basierenden wässrigen Zweiphasensystem gereinigt werden. Eine weitere Strategie zur Ausrichtung von Proteinen auf das ER verwendet das γ-Zein-Peptid (ZERA), das aus dem Mais-Speicherprotein gewonnen wird. Diese selbstorganisierenden Fusionsproteine bilden Proteinkörper, die von einer ER-Membran umgeben sind, die sie vor Proteolyse schützt. Die Entwicklung von Pilzen als effiziente Produktionswirte für Säugetierproteine erfordert auch die Inaktivierung der häufig vorkommenden Proteasen in der Fermentationsbrühe. In einer systematischen Studie wurden verschiedene sekretierte Proteasen identifiziert, die mit dem Abbau von Biopharmazeutika in Verbindung stehen, darunter Antikörper, Interferon α 2b und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, und mehrere davon inaktiviert. Dies führte nicht nur zu einer drastischen Verringerung der Proteaseaktivität, sondern auch zu einer starken Erhöhung der Stabilität aller drei rekombinanten Proteine, wobei der Antikörper den deutlichsten Effekt zeigte. Obwohl bereits früher versucht wurde, das N-Glykosylierungsmuster für die Herstellung hochwertiger therapeutischer Proteine zu verändern, scheint die Schaffung eines authentischen menschlichen Glykosylierungsmusters in einem Pilzexpressionswirt derzeit nicht machbar zu sein. Es ist daher fraglich, ob solche Biopharmazeutika in Zukunft in Pilzzellfabriken hergestellt werden können, vor allem angesichts der raschen Entwicklung von CHO-Zellen.

Die oben erwähnten Hydrophobine sind eine weitere Gruppe von Proteinen, die aufgrund ihrer oberflächenaktiven Eigenschaften große Aufmerksamkeit erhalten haben. Diese kleinen, extrazellulären Proteine lagern sich aufgrund ihrer amphiphilen Eigenschaften an hydrophoben/hydrophilen Grenzflächen zu Proteinschichten zusammen und machen hydrophobe Oberflächen benetzbar oder hydrophile Oberflächen hydrophob. Sie haben ein großes Potenzial für Anwendungen in der Lebensmittel- und Medizintechnik, um hydrophobe Materialien zu dispergieren, Schäume zu stabilisieren oder verschiedene Moleküle gezielt auf Oberflächen zu bringen. Cerato-Platanine sind eine weitere Gruppe von kleinen, sekretierten Proteinen mit vier konservierten Cysteinen. Sie binden an Chitin und N-Acetylglucosamin-Oligosaccharide und besitzen selbstorganisierende Eigenschaften an hydrophoben/hydrophilen Grenzflächen. Im Gegensatz zu Hydrophobinen verstärken Cerato-Platanine eher die Polaritäts-/Apolaritätseigenschaften von Oberflächen. Den CBMs, die in verschiedenen CAZymen vorhanden sind, wird auch eine zielgerichtete Funktion zugeschrieben. Sie können die hydrolytische Aktivität der katalytischen Domäne, an die sie gebunden sind, verbessern und zu einem günstigeren pH- und Temperaturoptimum führen. Ihre kohlenhydratbindenden Eigenschaften können darüber hinaus für die Affinitätsreinigung von Fusionsproteinen, z. B. mit Hilfe von Cellulosesäulen, genutzt werden. Das breite Spektrum anderer Anwendungen rekombinanter CBMs wurde kürzlich an anderer Stelle besprochen.

Trichoderma reesei für die konsolidierte Bioprozessierung und Ganzzellkatalyse

Unter konsolidierter Bioprozessierung (CBP) versteht man klassischerweise die Integration der zellulolytischen Enzymproduktion, der enzymatischen Hydrolyse und der Fermentationsschritte eines Prozesses zur Herstellung von Zelluloseethanol in einem einzigen Arbeitsgang. Daher wäre ein einziger Organismus mit guten zellulolytischen Eigenschaften und einem effizienten Ethanol-Fermentationsweg wünschenswert. Dennoch wurde auch der Verwendung von Mikrobenkonsortien einige Aufmerksamkeit geschenkt. Leider gibt es derzeit keinen einzigen Organismus, der beide Anforderungen erfüllt (Abb. 2). Daher wurden Versuche unternommen, Ethanologene in zellulolytische Organismen umzuwandeln oder zellulolytische Organismen in ethanologene Organismen umzuwandeln. Im Zusammenhang mit dem ersten Szenario diente T. reesei häufig als CAZyme-Genspender, insbesondere für cel5a und cel7b, die für zwei seiner Endoglucanasen kodieren, und für seine beiden Cellobiohydrolasen cel6a und cel7a (Tabelle 1). In allen veröffentlichten Studien schränkte die relativ geringe Sekretionskapazität von S. cerevisiae die Substratumsetzung durch die sekretierten oder membranverankerten heterologen CAZyme ein. Hohe Ethanolausbeuten mit realistischen zellulosehaltigen Substraten erforderten daher eine Ergänzung mit kommerziellen T. reesei-Enzymcocktails. Während die Bemühungen um eine Verbesserung der Sekretions- und Oberflächendisplay-Kapazität von gentechnisch veränderten S. cerevisiae-Stämmen noch andauern, haben die derzeit verfügbaren Cellulase-präsentierenden Stämme bereits das Potenzial, die für die Verzuckerung von Biomasse erforderlichen Enzymbeladungen erheblich zu reduzieren. Im Zusammenhang mit dem zweiten Szenario stellt T. reesei selbst einen vielversprechenden Zielorganismus dar. Doch obwohl dieser Pilz von Natur aus die Fähigkeit besitzt, alle mit der Biomasse verbundenen Zucker zu verstoffwechseln und in Ethanol umzuwandeln, sind die Erträge gering und es entsteht Essigsäure als unerwünschtes Nebenprodukt. Andererseits sind großtechnische Fermentationsverfahren für T. reesei aufgrund seiner breiten Anwendung in der kommerziellen Enzymproduktion gut etabliert, und auch die molekularen Werkzeuge für seine gentechnische Veränderung sind sehr gut entwickelt. Eine der verbleibenden großen Herausforderungen beim Einsatz von T. reesei als CBP-Organismus besteht darin, dass mehrere seiner Cellulasen und glykolytischen Gene durch Hypoxie unterdrückt werden, was für die Ethanolproduktion notwendig ist. Darüber hinaus stellt die transkriptionelle Unterdrückung von Cellulasen in Gegenwart von Ethanol eine weitere Herausforderung dar, die es zu bewältigen gilt. Der Cellulase-hyperproduzierende Stamm RUT-C30 weist jedoch eine höhere Ethanoltoleranz auf als der Stamm QM9414 aus der Natick-Linie und stellt daher einen perfekten Plattformstamm für die Entwicklung von T. reesei als CBP-Organismus dar, zumal er auch die Kohlenstoffkataboliten unterdrückt. Darüber hinaus zeigt RUT-C30 in Anwesenheit eines lignozellulosehaltigen Zellstoffs in den frühen Stadien der Fermentation eine pelletartige Morphologie, die durch Zugabe des Tensids Triton X-100 wachstumsunabhängig erreicht werden kann und dann auch zu einer höheren Enzymproduktion führt. Dies ist wichtig, da schlechte Mischbarkeit und niedrige maximale Zelldichten als Folge des filamentösen Wachstums bisher die Verwendung von T. reesei als CBP-Organismus behindert haben. Allgemeiner ausgedrückt könnte der Begriff „konsolidierte Bioverarbeitung“ auch für andere integrierte Prozesse verwendet werden, bei denen das Substrat nicht unbedingt lignozellulosehaltige Biomasse, sondern ein anderes Biopolymer wie Chitin oder Stärke ist und das Produkt nicht Ethanol, sondern ein beliebiges anderes Metabolit ist. Zu diesem Zweck wurde in jüngster Zeit eine Reihe von Studien durchgeführt, die darauf abzielten, verschiedene Metaboliten durch technische Veränderung von T. reesei zu überproduzieren (Tabelle 2). Die erzielten Ausbeuten waren jedoch in den meisten Fällen weit von der Kommerzialisierung entfernt, so dass eine weitere Optimierung erforderlich ist.

Werkzeuge für Zelldesign und -technik

Während zwei umfassende Übersichten über den molekularen Werkzeugkasten von T. reesei und anderen Trichoderma-Arten erst kürzlich erschienen sind, wollen wir diese mit den jüngsten Fortschritten auf diesem Gebiet aktualisieren. Gezieltes Stamm-Engineering zur Verbesserung der Cellulase-Produktion oder für metabolisches Engineering erfordert effiziente Methoden, um gezielte genetische Veränderungen in den Organismus einzuführen. Die allgemein geringe Effizienz des Gen-Targeting war lange Zeit eine große Herausforderung, um durch homologe Integration einer Deletions- oder Expressionskassette eine angemessene Anzahl von Transformanten zu erhalten. Dieses Problem wurde hauptsächlich durch die Inaktivierung von Komponenten des nicht-homologen Endverbindungsweges (NHEJ) der DNA-Reparatur wie tku70 oder tmus53 gelöst. Tku70-deletierte Stämme zeigen ein verbessertes Gen-Targeting, obwohl die Effizienz der homologen Integration in diesen Stämmen je nach Zielort immer noch variieren kann und daher auf 30 % fallen kann. Auf der Grundlage dieser Verbesserung wurde eine Reihe neuer Ansätze entwickelt, um Expressionskassetten an einer definierten genomischen Region einzufügen und dadurch pleiotrope Effekte zu vermeiden, die durch ihre zufällige Integration verursacht werden. Unter Verwendung eines tku70-Hintergrunds entwickelten Jorgensen et al. eine Expressionsplattform, die den leicht zu screenenden ade2-Locus als bevorzugte Integrationsstelle nutzt. Nach Integration der Expressionskassette in diesen Locus wird ade2 zerstört, und die resultierenden Transformanten entwickeln eine ausgeprägte rote Pigmentierung. In einer anderen Studie wurden die Loci pyr4 und asl1 ausgewählt, um einen Stamm mit Uridin- und L-Arginin-Auxotrophie zu entwickeln, der eine gezielte Integration an diesen Stellen ermöglicht. Ouaedraogo et al. verfolgten eine andere Strategie und exprimierten die I-SceI Meganuklease aus S. cerevisiae in T. reesei. I-SceI erzeugt künstliche Doppelstrangbrüche an einer I-SceI-Erkennungsstelle, die zuvor an einem vordefinierten Locus eingeführt wurde, und verbesserte sowohl die Transformations- als auch die homologe Integrationseffizienz. In einer Folgestudie wurden I-SceI-vermittelte Doppelstrangbrüche mit einer tku70-Deletion kombiniert. Hier begünstigt die Unfähigkeit, Doppelstrangbrüche durch NHEJ zu reparieren, die Integration der Kassette, was zu homologen Rekombinationsraten von bis zu 100 % führt. Mit dem CRISPR- (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-System wurde eine Revolution für die Gentechnik oder das Genome Editing eingeleitet. Dieses System, das sowohl den Bedarf an einer solchen Technologie als auch die zunehmende Bedeutung als Enzymproduzent unterstreicht, wurde erstmals für filamentöse Pilze in T. reesei getestet. Es führt spezifische DNA-Doppelstrangbrüche ein, um das Targeting von Genen zu stimulieren, und hängt nur von einer Cas9 (CRISPR-assoziierten) Nuklease ab, die eine einzige chimäre Leit-RNA für das Targeting verwendet. Die genaue Ausrichtung dieser RNA-gesteuerten Cas9 auf eine bestimmte DNA-Sequenz wird durch die Protospacer-Sequenz der Leit-RNA über einfache Basenpaarung erreicht. Durch die Verwendung von 200 bp vor- und nachgeschalteten flankierenden Regionen für das Gendeletionskonstrukt konnten HR-Häufigkeiten von mehr als 90 % erreicht werden. Doppeldeletionen und Dreifachdeletionen traten mit einer Häufigkeit von 45 bzw. 4 % nach einer einzigen Transformationsrunde auf. Während in dieser Studie in vitro transkribierte guide RNAs mit der Deletionskassette in einen Cas9 exprimierenden T. reesei kotransformiert wurden, verwendeten Nødvig et al. zwei flankierende Ribozymsequenzen, um guide RNAs aus einem größeren Transkript freizusetzen, das auch das Cas9-Enzym in verschiedenen Aspergillen kodiert. Ein weiteres wesentliches Werkzeug, das sowohl für die rekombinante Proteinexpression als auch für die Stammzüchtung benötigt wird, sind Promotoren, die eine kontrollierte Genexpression ermöglichen. Obwohl eine Reihe induzierbarer und unterdrückbarer Promotoren mit den verschiedenen Cellulase-Promotorregionen zur Verfügung stehen, haben sie in der Regel Nachteile, da ihre Expression an den Metabolismus des Wirts gebunden ist und Aktivatoren aufgrund von Promotortitrationseffekten begrenzt sein können. Nützliche Alternativen sind eine Reihe von L-Methionin-repressiblen T. reesei-Genen mit unterschiedlicher Basalexpressionsstärke. Es wurde gezeigt, dass einer dieser Promotoren die Expression verschiedener Reportergene auf verschiedenen Kohlenstoffquellen, einschließlich Weizenstroh, unterdrücken kann. In einer ähnlichen Studie wurde der Promotor eines Kupferpermease-Gens von T. reesei verwendet, um die Expression des wichtigsten Cellulase- und Hemicellulase-Regulators xyr1 in Abwesenheit von Kupfer zu steuern. In Anbetracht der Tatsache, dass kupferhaltige Enzyme aus der AA-Familie 9 wichtige Bestandteile des T. reesei-Cellulase-Mixes sind, ist es jedoch zweifelhaft, ob dieses System in einem Cellulase-Produktionsszenario angewendet werden kann.

Neben diesen aufregenden molekularen Werkzeugen stehen nun auch einige ältere Tricks aus der klassischen Genetik zur Verfügung. Die Stammentwicklung von T. reesei wurde lange Zeit dadurch behindert, dass der Pilz als ungeschlechtlich galt, was eine Stammkreuzung verhinderte. Ein Meilenstein in dieser Hinsicht war die Entdeckung, dass QM6a einen MAT1-2-Paarungstyp-Locus besitzt und problemlos mit bestimmten MAT1-1-Wildtyp-Isolaten von T. reesei gekreuzt werden kann. Als jedoch der MAT1-2-Locus von QM6a durch sein MAT1-1-Gegenstück ersetzt wurde, bildeten sich bei der Konfrontation mit dem ursprünglichen MAT1-2 QM6a-Stamm keine Stromata. Folglich war es nicht möglich, die verschiedenen akademischen und industriellen T. reesei-Stämme, die von QM6a abgeleitet sind, für die Stammentwicklung zu nutzen. Mit Hilfe eines systembiologischen Ansatzes wurde das fehlende Gen, das für die weibliche Sterilität verantwortlich ist, als ham5 identifiziert. In N. crassa kodiert ham-5 für ein Protein, das während der Zellfusion als MAP-Kinase-Gerüst dient. Die Wiedereinführung eines funktionsfähigen ham5 stellt die Bildung von Stromata im Stamm QM6a wieder her und ermöglicht die Wiederherstellung der weiblichen Fruchtbarkeit in anderen Stämmen, die aus QM6a-Hintergründen stammen. Diese Erkenntnis ist besonders wichtig, da Kreuzungen mit den oben genannten H. jecorina-Isolaten zu segmental aneuploiden Nachkommen führen können. Mit diesem Werkzeug in der Hand ist die Grundlage für die Identifizierung relevanter Mutationen gelegt, die z. B. zu einer Überproduktion von Cellulase führen. Dies ist wichtig, da traditionelle Komplementationsansätze zur Identifizierung von Genen, die mutierte Phänotypen verursachen, bei Arten wie T. reesei weitgehend erfolglos waren. Und obwohl Hochdurchsatz-Sequenzierung und vergleichende Genomanalyse Mutationen in der QM6a-Stammlinie von Cellulase-Hyper- und Nullproduzenten leicht identifizieren können, hat dies nur in wenigen Fällen bereits zur Verknüpfung einer Mutation mit einem bestimmten Phänotyp geführt. In Fällen jedoch, in denen eine große Anzahl von Mutationen gefunden wurde oder die Mutationen Gene mit unbekannter Funktion betrafen, konnte die vergleichende Sequenzanalyse die Natur der gewünschten Zielgene nicht aufdecken. Mehrere Forscher haben daher erfolgreich die Massen-Sequenzanalyse in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation eingesetzt, um relevante Mutationen zu identifizieren. Bei diesem Ansatz wird die Mutante mit einem Referenzstamm gekreuzt, und die genomische DNA der Segreganten, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, wird gepoolt und sequenziert. Ein Genomvergleich dieses Pools sequenzierter DNA mit den Genomen der Elternstämme kann dann konservierte Mutationen aufdecken, die für den Phänotyp relevant sind. Mutationen, die nichts mit dem Phänotyp zu tun haben, werden unterrepräsentiert sein. Es ist zwar nicht zu erwarten, dass dieser Ansatz zur Identifizierung einer einzigen Mutation führt, da Mutationen in der Nähe der relevanten Mutation in der Regel ko-segregieren, doch wird die Zahl der Ziele für weitere Untersuchungen erheblich reduziert.