Alai

Coronaviren haben in den letzten zwei Jahrzehnten zwei große Pandemien verursacht, nämlich SARS und das Middle East respiratory syndrome (MERS)8,9. Es wurde allgemein angenommen, dass SARSr-CoV – das hauptsächlich in Fledermäusen vorkommt – in Zukunft einen Krankheitsausbruch verursachen könnte10,11. Hier berichten wir über eine Reihe von Fällen, die durch einen nicht identifizierten Lungenentzündungsausbruch in Wuhan, Provinz Hubei, Zentralchina, verursacht wurden. Dieser Krankheitsausbruch, der von einem lokalen Meeresfrüchtemarkt ausging, hat sich erheblich ausgeweitet und 2.761 Menschen in China infiziert, ist mit 80 Todesfällen verbunden und hat bis zum 26. Januar 202012 zur Infektion von 33 Menschen in 10 weiteren Ländern geführt. Typische klinische Symptome dieser Patienten sind Fieber, trockener Husten, Atembeschwerden (Dyspnoe), Kopfschmerzen und Lungenentzündung. Der Ausbruch der Krankheit kann zu einem fortschreitenden Atemversagen aufgrund von Alveolarschäden (wie auf Computertomographien des Brustkorbs zu erkennen ist) und sogar zum Tod führen. Anhand der klinischen Symptome und anderer Kriterien, zu denen ein Anstieg der Körpertemperatur, eine Abnahme der Zahl der Lymphozyten und der weißen Blutkörperchen (obwohl die Werte der weißen Blutkörperchen manchmal normal waren), neue Lungeninfiltrate in der Röntgenaufnahme des Brustkorbs und keine offensichtliche Besserung nach einer dreitägigen Antibiotikabehandlung gehörten, stellten die Kliniker fest, dass die Krankheit durch eine virusbedingte Lungenentzündung verursacht wurde. Es scheint, dass die meisten der ersten Fälle einen Kontakt mit dem ursprünglichen Meeresfrüchtemarkt hatten; die Krankheit ist jedoch inzwischen so weit fortgeschritten, dass sie durch Kontakt von Mensch zu Mensch übertragen wird.

Proben von sieben Patienten mit schwerer Lungenentzündung (sechs davon Verkäufer oder Lieferanten des Meeresfrüchtemarktes), die zu Beginn des Ausbruchs in die Intensivstation des Wuhan Jin Yin-Tan-Krankenhauses eingeliefert wurden, wurden zur Diagnose des verursachenden Erregers an das Labor des Wuhan Institute of Virology (WIV) geschickt (Extended Data Table 1). Als Labor, das sich mit CoV befasst, haben wir diese Proben zunächst mit pan-CoV-PCR-Primern13 getestet, da der Ausbruch im Winter und auf einem Markt stattfand – in derselben Umgebung wie die SARS-Infektionen. Wir fanden fünf Proben, die PCR-positiv für CoVs waren. Eine Probe (WIV04), die aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) entnommen wurde, wurde mittels Metagenomik-Analyse unter Verwendung von Sequenzierung der nächsten Generation analysiert, um mögliche ätiologische Erreger zu identifizieren. Von den insgesamt 10.038.758 Reads – von denen 1.582 Reads nach dem Herausfiltern von Reads aus dem menschlichen Genom zurückbehalten wurden – stimmten 1.378 (87,1 %) Sequenzen mit der Sequenz von SARSr-CoV überein (Abb. 1a). Durch De-novo-Assemblierung und gezielte PCR erhielten wir ein 29 891 Basenpaare umfassendes CoV-Genom, das eine Sequenzidentität von 79,6 % mit SARS-CoV BJ01 (GenBank-Hinterlegungsnummer AY278488.2) aufwies. Durch ein Re-Mapping der gesamten Reads auf dieses Genom wurde eine hohe Genomabdeckung erzielt (Extended Data Abb. 1). Diese Sequenz wurde bei GISAID (https://www.gisaid.org/) eingereicht (Hinterlegungsnummer EPI_ISL_402124). In Anlehnung an den von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) vergebenen Namen nennen wir es vorläufig neuartiges Coronavirus 2019 (2019-nCoV). Vier weitere Genomsequenzen in voller Länge von 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 und WIV07) (GISAID-Zugangsnummern EPI_ISL_402127-402130), die zu mehr als 99,9 % identisch waren, wurden anschließend von vier weiteren Patienten mittels Next-Generation-Sequenzierung und PCR gewonnen (erweiterte Datentabelle 2).

Das Virusgenom besteht aus sechs großen Open-Reading-Frames (ORFs), die für Coronaviren typisch sind, und einer Reihe weiterer akzessorischer Gene (Abb. 1b). Weitere Analysen zeigen, dass einige der 2019-nCoV-Gene eine Nukleotidsequenzidentität von weniger als 80 % mit SARS-CoV aufweisen. Die Aminosäuresequenzen der sieben konservierten Replikase-Domänen in ORF1ab, die für die Klassifizierung der CoV-Spezies verwendet wurden, waren jedoch zu 94,4 % identisch zwischen 2019-nCoV und SARS-CoV, was darauf hindeutet, dass die beiden Viren zur selben Spezies, SARSr-CoV, gehören.

Anschließend stellten wir fest, dass eine kurze Region der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) aus einem Fledermaus-Coronavirus (BatCoV RaTG13) – das zuvor in Rhinolophus affinis aus der Provinz Yunnan nachgewiesen wurde – eine hohe Sequenzidentität mit 2019-nCoV aufweist. Wir führten an dieser RNA-Probe (GISAID-Zugangsnummer EPI_ISL_402131) eine Sequenzierung in voller Länge durch. Die Simplot-Analyse zeigte, dass 2019-nCoV im gesamten Genom eine hohe Ähnlichkeit mit RaTG13 aufweist (Abb. 1c), mit einer Gesamtgenomsequenzidentität von 96,2 %. Anhand der aufeinander abgestimmten Genomsequenzen von 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV und den zuvor gemeldeten Fledermaus-SARSr-CoVs wurden im Genom von 2019-nCoV keine Hinweise auf Rekombinationsereignisse gefunden. Die phylogenetische Analyse des vollständigen Genoms und der Gensequenzen von RdRp und Spike (S) zeigte, dass – für alle Sequenzen – RaTG13 der engste Verwandte von 2019-nCoV ist und dass sie eine von anderen SARSr-CoVs getrennte Abstammung bilden (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 2). Das rezeptorbindende Spike-Protein, für das das S-Gen kodiert, unterschied sich stark von anderen CoVs (Erweiterte Daten, Abb. 2) und wies eine Nukleotidsequenzidentität von weniger als 75 % mit allen zuvor beschriebenen SARSr-CoVs auf, mit Ausnahme einer Nukleotididentität von 93,1 % mit RaTG13 (Erweiterte Daten, Tabelle 3). Die S-Gene von 2019-nCoV und RaTG13 sind länger als die anderer SARSr-CoVs. Die Hauptunterschiede in der Sequenz des S-Gens von 2019-nCoV sind die drei kurzen Insertionen in der N-terminalen Domäne sowie Veränderungen in vier von fünf Schlüsselresten im Rezeptorbindungsmotiv im Vergleich zur Sequenz von SARS-CoV (Erweiterte Daten Abb. 3). Ob die Insertionen in der N-terminalen Domäne des S-Proteins von 2019-nCoV wie bei MERS-CoV eine Sialinsäure-bindende Aktivität verleihen, muss weiter untersucht werden. Die enge phylogenetische Verwandtschaft mit RaTG13 deutet darauf hin, dass 2019-nCoV möglicherweise von Fledermäusen abstammt.

Wir entwickelten rasch eine qPCR-basierte Nachweismethode auf der Grundlage der Sequenz der rezeptorbindenden Domäne des S-Gens, die die variabelste Region des Genoms war (Abb. 1c). Unsere Daten zeigen, dass die Primer 2019-nCoV von allen anderen humanen Coronaviren unterscheiden konnten, einschließlich des Fledermaus-SARSr-CoV WIV1, das zu 95 % mit SARS-CoV identisch ist (erweiterte Daten: Abb. 4a, b). Von den von den sieben Patienten entnommenen Proben waren sechs BALF- und fünf Mundschleimhautabstriche bei der ersten Probenahme positiv für 2019-nCoV, wie mittels qPCR und konventioneller PCR festgestellt wurde. Bei der zweiten Probenahme konnten wir jedoch in den Mund- und Analabstrichen sowie in den Blutproben dieser Patienten keine viruspositiven Proben mehr nachweisen (Abb. 2a). Wir empfehlen jedoch, für den Routine-Nachweis von 2019-nCoV andere qPCR-Targets zu verwenden, einschließlich der RdRp- oder Hüllgene (E). Auf der Grundlage dieser Befunde schlagen wir vor, dass die Krankheit über die Luft übertragen werden könnte, obwohl wir andere mögliche Übertragungswege nicht ausschließen können, da weitere Untersuchungen, einschließlich einer größeren Anzahl von Patienten, erforderlich sind.

Für den serologischen Nachweis von 2019-nCoV verwendeten wir ein zuvor entwickeltes Nukleokapsid (N)-Protein aus Fledermaus-SARSr-CoV Rp3 als Antigen für IgG- und IgM-Enzymimmunoassays (ELISAs), da dieses Protein eine 92%ige Aminosäureidentität mit dem N-Protein von 2019-nCoV aufweist (Extended Data Fig. 5) und zeigte keine Kreuzreaktivität mit anderen humanen Coronaviren außer SARSr-CoV7. Von den sieben Patienten mit Virusinfektionen konnten wir nur fünf Serumproben gewinnen. Wir überwachten die viralen Antikörperspiegel bei einem Patienten (ICU-06) 7, 8, 9 und 18 Tage nach Ausbruch der Krankheit (Erweiterte Daten Tabelle 2). Es wurde ein klarer Trend bei den IgG- und IgM-Titern beobachtet, die im Laufe der Zeit anstiegen, mit Ausnahme des IgM-Titers, der bei der letzten Probe abnahm (Abb. 2b). In einer zweiten Analyse untersuchten wir Proben von 5 der 7 viruspositiven Patienten etwa 20 Tage nach Ausbruch der Krankheit auf das Vorhandensein viraler Antikörper (Erweiterte Datentabellen 1, 2). Alle Patientenproben – aber nicht die Proben von gesunden Personen – waren stark positiv für virales IgG (Abb. 2b). Es gab auch drei IgM-positive Proben, was auf eine akute Infektion hindeutet.

Anschließend isolierten wir das Virus (genannt 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) erfolgreich sowohl aus Vero E6- als auch aus Huh7-Zellen unter Verwendung der BALF-Probe des Patienten ICU-06. Nach dreitägiger Inkubation wurden in den Zellen deutliche zytopathogene Effekte beobachtet (Erweiterte Daten: Abb. 6a, b). Die Identität des Stammes WIV04 wurde in Vero E6-Zellen durch Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung des kreuzreaktiven viralen N-Antikörpers verifiziert (Erweiterte Daten: Abb. 6c, d) und durch Metagenom-Sequenzierung, bei der die meisten Reads 2019-nCoV zugeordnet werden konnten, und qPCR-Analysen zeigten, dass die Viruslast von Tag 1 bis Tag 3 anstieg (Erweiterte Daten: Abb. 6e, f). Die Viruspartikel in den Ultradünnschnitten der infizierten Zellen zeigten eine typische Coronavirus-Morphologie, wie durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht wurde (Erweiterte Daten: Abb. 6g). Um die Neutralisierungsaktivität der viralen IgG-positiven Proben weiter zu bestätigen, führten wir mit den fünf IgG-positiven Patientenseren Serumneutralisationstests in Vero-E6-Zellen durch. Wir zeigen, dass alle Proben in der Lage waren, 100 TCID50 (50 % gewebekulturinfizierende Dosis) von 2019-nCoV bei einer Verdünnung von 1:40-1:80 zu neutralisieren. Wir zeigen auch, dass dieses Virus durch Anti-SARS-CoV-Pferdeserum (Geschenk von L.-F. Wang) bei Verdünnungen von 1:40 kreuzneutralisiert werden kann; das Potenzial für eine Kreuzreaktivität mit SARS-CoV-Antikörpern muss jedoch mit Anti-SARS-CoV-Serum vom Menschen bestätigt werden (erweiterte Datentabelle 4).

ACE2 ist als Zellrezeptor für SARS-CoV14 bekannt. Um festzustellen, ob 2019-nCoV ebenfalls ACE2 als zellulären Eintrittsrezeptor nutzt, haben wir Studien zur Virusinfektiosität mit HeLa-Zellen durchgeführt, die ACE2-Proteine von Menschen, Chinesischen Hufeisenfledermäusen, Zibetkatzen, Schweinen und Mäusen exprimierten oder nicht exprimierten. Wir konnten zeigen, dass 2019-nCoV in der Lage ist, alle ACE2-Proteine mit Ausnahme von Maus-ACE2 als Eintrittsrezeptor zu nutzen, um in ACE2-exprimierende Zellen einzudringen, nicht aber in Zellen, die kein ACE2 exprimieren, was darauf hindeutet, dass ACE2 wahrscheinlich der Zellrezeptor ist, über den 2019-nCoV in Zellen eindringt (Abb. 3). Wir zeigen auch, dass 2019-nCoV andere Coronavirus-Rezeptoren, wie Aminopeptidase N (APN) und Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), nicht nutzt (Erweiterte Daten, Abb. 7).

Die Studie liefert einen detaillierten Bericht über 2019-nCoV, den wahrscheinlich ätiologischen Erreger, der für die aktuelle Epidemie des akuten respiratorischen Syndroms in China und anderen Ländern verantwortlich ist. Bei allen getesteten Patienten wurde eine virusspezifische Nukleotid-positive und virale Protein-Serokonversion beobachtet, was einen Zusammenhang zwischen der Krankheit und dem Vorhandensein dieses Virus belegt. Es gibt jedoch noch viele dringende Fragen, die beantwortet werden müssen. Der Zusammenhang zwischen 2019-nCoV und der Krankheit wurde nicht durch Tierversuche verifiziert, um die Koch’schen Postulate zu erfüllen und einen ursächlichen Zusammenhang zwischen einem Mikroorganismus und einer Krankheit herzustellen. Die Übertragungsroutine dieses Virus zwischen den Wirten ist noch nicht bekannt. Es scheint, dass das Virus zunehmend von Mensch zu Mensch übertragbar ist. Wir sollten genau beobachten, ob sich das Virus weiter entwickelt und virulenter wird. Da es an spezifischen Behandlungsmöglichkeiten mangelt und 2019-nCoV mit SARS-CoV verwandt ist, könnten einige Medikamente und präklinische Impfstoffe gegen SARS-CoV wahrscheinlich zur Behandlung dieses Virus eingesetzt werden. In Anbetracht der weiten Verbreitung von SARSr-CoV in ihren natürlichen Reservoiren sollte sich die künftige Forschung auf die aktive Überwachung dieser Viren in größeren geografischen Regionen konzentrieren. Langfristig sollten antivirale Breitbandmedikamente und Impfstoffe für neu auftretende Infektionskrankheiten entwickelt werden, die in Zukunft durch diese Virusgruppe verursacht werden. Vor allem aber sollten strenge Vorschriften gegen die Domestizierung und den Verzehr von Wildtieren eingeführt werden.

Anmerkung im Korrekturabzug hinzugefügt: Seit der Annahme dieses Artikels hat das ICTV das Virus als SARS-CoV-215 bezeichnet; außerdem hat die WHO den offiziellen Namen der durch dieses Virus verursachten Krankheit veröffentlicht, nämlich COVID-1916.