Alai

Bestimmung des Temperaturbereichs

Gemeinsame Laborbedingungen für Macrostomum lignano-Kulturen sind: Temperatur von 20 °C, Luftfeuchtigkeit 60 % und Licht/Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h. Diese Bedingungen wurden vor allem deshalb gewählt, weil sie optimal für das Wachstum der Kieselalge Nitzschia curvilineata sind, die die Hauptnahrungsquelle für die Würmer darstellt. Um zu ermitteln, welche Temperaturbedingungen für das Experiment geeignet sind, haben wir zunächst den Temperaturbereich bestimmt, in dem die Würmer überleben. Während sich das Einfrieren der Würmer als tödlich erwies, konnten sie überleben, wenn sie mindestens zwei Wochen lang bei 4 °C gehalten wurden. Da die Kieselalge unter diesen Bedingungen jedoch nicht wächst, beschlossen wir, 4 °C für weitere Versuche auszuschließen. Andere Temperaturen unter 20 °C wurden ebenfalls aus dem Experiment ausgeschlossen, da das Hauptziel der Studie darin bestand, Bedingungen zu finden, die Wachstum und Entwicklung beschleunigen. Auf der anderen Seite des Temperaturspektrums lösten sich die Würmer auf, wenn sie zwei Stunden lang bei 42 °C gehalten wurden, und starben nach einer Woche Kultur bei 37 °C. Daher haben wir beschlossen, 20 °C, 25 °C, 30 °C und 35 °C als Versuchsbedingungen zu verwenden, um die langfristigen Temperatureffekte auf M. lignano zu untersuchen (Abb. 1).

Hitzeschockreaktion

Um zu untersuchen, welche Temperaturen eine Stressreaktion in den Würmern auslösen, haben wir die Aktivität des Hitzeschock-20-Promotors (Mlig-hsp20) überwacht. Zunächst führten wir eine quantitative RT-PCR durch, um das Expressionsniveau von Mlig-hsp20 bei 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C und 35 °C zu messen. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Expressionsmenge von Hsp20 zwischen 20 °C und 25 °C (Abb. 2a). Allerdings wurde bei 30 °C ein geringer (2-facher), aber signifikanter (P = 0,027, t-Test) Anstieg der Expression im Vergleich zu 20 °C beobachtet (Abb. 2a). Ein mehr als zehnfacher Anstieg der Expression wurde bei 33 °C beobachtet, der sich bei der höchsten getesteten Temperatur von 35 °C auf mehr als das 100-fache erhöhte (Abb. 2a). Im zweiten Test erzeugten wir eine transgene Linie, die das mScarlet-I-Protein unter der Kontrolle des Mlig-hsp20-Promotors exprimiert (Abb. 2b), und maßen die Fluoreszenz 24 Stunden nach einer 2-stündigen Inkubation bei verschiedenen Temperaturen von 20 °C bis 37 °C (Abb. 2c, d). Eine mehr als zwei- bzw. zehnfache Erhöhung der Fluoreszenz wurde bei 34 °C bzw. 37 °C beobachtet (Abb. 2c).

Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung

Nach Morris et al. dauert es etwa 120 h (fünf Tage), bis sich die Eier von Macrostomum vollständig entwickelt haben, wenn die Eier bei 20 °C gehalten werden. Um zu untersuchen, wie sich die Temperatur auf die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung und des Schlupfes auswirkt, haben wir frisch gelegte Embryonen entnommen und ihre Entwicklung bis zum Schlupf bei verschiedenen Temperaturen beobachtet. Um mögliche Unterschiede aufgrund des genetischen Hintergrunds zu untersuchen, verwendeten wir zwei M. lignano-Linien, die derzeit in den meisten Studien über M. lignano verwendet werden, die Linien DV1 und NL10. Diese Linien stammen unabhängig voneinander von Wildtyp-Populationen desselben geografischen Standorts ab und unterscheiden sich durch eine Ganzchromosomen-Duplikation, verhalten sich aber ansonsten unter Laborbedingungen sehr ähnlich. Zunächst untersuchten wir die Auswirkungen von niedrigen Temperaturen. Bei 4 °C wird die Entwicklung der Eier gestoppt, und sie können mindestens einen Monat lang gelagert werden, bevor sie ihre Entwicklung bei höheren Temperaturen wieder aufnehmen. Anschließend haben wir untersucht, wie schnell sich die Eier bei Temperaturen zwischen 20 °C und 35 °C entwickeln. Wie aus Abb. 3 hervorgeht, begannen die Eier bei Standardbedingungen (20 °C) nach sechs Tagen zu schlüpfen. Eine Erhöhung der Temperatur führte zu einer proportional schnelleren Embryonalentwicklung und einem früheren Schlupf, der bei 35 °C doppelt so schnell war wie bei 20 °C und nur drei Tage dauerte. Bemerkenswert ist, dass etwa 10 % der Eier nach acht Tagen der Bebrütung bei 20 °C nicht geschlüpft sind, während es bei höheren Temperaturen weniger als 5 % sind, was darauf hindeutet, dass selbst die höchste geprüfte Temperatur von 35 °C keine nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben der Embryonen hat.

Reproduktion

Die Reproduktionsrate ist ein sehr wichtiger Faktor für einen Modellorganismus, da Tiere mit kürzerer Generationszeit eine schnellere Generierung von Daten in genetischen Experimenten ermöglichen. Außerdem haben die generierten Daten in den meisten Fällen eine höhere statistische Aussagekraft, wenn die Tiere eine große Anzahl von Nachkommen produzieren.

Um die Auswirkungen der Temperatur auf die Reproduktionsrate von M. lignano zu bewerten, haben wir die Anzahl der Nachkommen verglichen, die im Laufe von fünf Wochen von Würmern erzeugt wurden, die bei unterschiedlichen Temperaturbedingungen gehalten wurden. Der Versuch wurde mit Schlüpflingen begonnen, um die postembryonale Entwicklung in die Untersuchung einzubeziehen, und es wurden sowohl die DV1- als auch die NL10-Linie verwendet. Bei 20 °C brauchten die Schlüpflinge beider Linien drei Wochen, um zu wachsen und erste Nachkommen zu produzieren, während bei 25 °C bei der NL10-Linie, nicht aber bei DV1, Schlüpflinge in zwei Wochen beobachtet wurden. Bei 30 °C und 35 °C produzierten beide Linien bereits nach zwei Wochen Nachkommen (Abb. 4). Ab der dritten Woche stieg die Zahl der pro Woche produzierten Schlüpflinge von unter 200 bei 20 °C auf mehr als 300 bei Temperaturen über 20 °C; die höchste Schlüpflingszahl wurde bei 30 °C erreicht. Dies galt für beide genetischen Hintergründe, und wir beobachteten keine signifikanten Unterschiede zwischen den DV1- und NL10-Linien (Abb. 4).

Obwohl Temperaturen von 30 °C und höher zu mehr Schlüpflingen führten, löst dies auch eine Hitzeschockreaktion aus (Abb. 2). Um die langfristigen Auswirkungen der erhöhten Temperatur und den möglichen Stress, den sie auf die Würmer ausüben kann, zu untersuchen, hielten wir die Würmer bei den gewählten Temperaturen und beobachteten sie nach drei und sechs Monaten Kulturzeit auf morphologische Aberrationen. Würmer, die bei 25 °C gehalten wurden, zeigten zu beiden Kontrollzeitpunkten keine morphologischen Veränderungen im Vergleich zu den Würmern, die bei 20 °C gehalten wurden (Abb. 5). Sowohl bei 30 °C als auch bei 35 °C wurden jedoch verschiedene Abweichungen in der allgemeinen Morphologie beobachtet. Nach drei Monaten waren sowohl bei der DV1- als auch bei der NL10-Linie eine erhöhte Anzahl von Zysten, beschädigtes Gewebe und vergrößerte Hoden zu beobachten (Abb. 5). Keiner der bei 35 °C gehaltenen Würmer überlebte bis zum Sechsmonatszeitpunkt, und alle Würmer, die bei 30 °C überlebten, wiesen morphologische Aberrationen auf (Abb. 5). Daher ist eine längere Exposition bei Temperaturen über 30 °C für M. lignano schädlich.

Regenerationszeit

Da die Hauptattraktion von M. lignano als Modellorganismus seine Regenerationsfähigkeit ist, haben wir als nächstes untersucht, wie die Temperatur die Regeneration beeinflusst. Es ist allgemein bekannt, dass eine höhere Temperatur zu einem Anstieg der gesamten Stoffwechselaktivität führt. Um den Einfluss der Temperatur auf die Zeit zu bewerten, die ein Wurm benötigt, um seinen Körper nach einer Amputation oberhalb der Hodenregion vollständig zu regenerieren, verfolgten wir die Regeneration der Hoden und das Auftreten von Spermien in der Samenblase mit Hilfe einer zuvor etablierten transgenen Linie NL22, die GFP unter der Kontrolle des hoden- und spermaspezifischen ELAV-Promotors exprimiert. Die Verwendung eines solchen transgenen Markers bietet eine bessere Präzision, Konsistenz und Effizienz bei der Bestimmung des Ausmaßes der Regeneration. Tatsächlich beobachteten wir keine signifikanten Unterschiede bei der Bewertung der Zeit des Auftretens des GFP-Signals nach der Amputation bei allen getesteten Temperaturen (Tabelle 1).

Wie erwartet, nahm die Geschwindigkeit der Regeneration mit der Temperatur zu (Tabelle 1). Nimmt man die Regenerationszeit bei 20 °C als Standardrate, so ergeben sich für die Regeneration von Hoden die berechneten Temperaturkoeffizienten Q10 = 4 bei 25 °C und Q10 = 3 für 30 °C und 35 °C. Dies zeigt, dass die größte Wirkung bei einer Erhöhung der Temperatur auf 25 °C erzielt wird und die schnellste Regeneration bei 30 °C stattfindet, ohne dass sich die erhöhte Temperatur auf die Regenerationszeit auswirkt. Daher sollten bei Regenerationsversuchen mit M. lignano Temperaturen von 25 °C und 30 °C in Betracht gezogen werden, da sich dadurch die Versuchsdauer um das Zwei- bis Dreifache verkürzt (Tabelle 1).

RNA-Interferenz

Die Unterdrückung der Genexpression durch RNA-Interferenz (RNAi) ist derzeit der wichtigste Ansatz für Studien zum Funktionsverlust bei M. lignano. Bei diesem Ansatz werden die Tiere mit doppelsträngiger RNA gegen das Zielgen getränkt, und oft sind längere Behandlungen über mehrere Wochen erforderlich, um einen Phänotyp zu beobachten. Wir haben getestet, wie die Temperatur die Geschwindigkeit der Phänotypentwicklung nach einer RNAi-Behandlung beeinflusst. Zu diesem Zweck haben wir Mlig-ddx39 ausgeschaltet, ein Gen, das für seine Funktion bei der Zellvermehrung in M. lignano bekannt ist und einen robusten letalen Knockdown-Phänotyp aufweist. Ähnlich wie beim Reproduktionstest verwendeten wir für diesen Versuch die Linien DV1 und NL10 (Tabelle 2). Bei 20 °C dauerte es etwa 20 Tage, bis alle Tiere nach dem Knockdown von Mlig-ddx39 starben. Wurden die Würmer bei höheren Temperaturen gehalten, trat der Tod schneller ein: nach 11 bzw. 8 Tagen für Würmer, die bei 25 °C bzw. 30 °C gehalten wurden. Es gab keinen sichtbaren Unterschied zwischen den beiden für das Experiment verwendeten Stämmen (Tabelle 2). Als Nächstes untersuchten wir, ob die beobachtete Beschleunigung der Manifestation des ddx39-RNAi-Phänotyps bei höheren Temperaturen auf eine höhere Effizienz des Gen-Knockdowns durch RNAi oder auf andere Faktoren zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck haben wir mittels qRT-PCR die Häufigkeit der Mlig-ddx39-Transkripte zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn des RNAi-Experiments bei unterschiedlichen Temperaturen gemessen (Abb. 6). Tiere, die mit dsRNA gegen gfp behandelt wurden, dienten als Referenzkontrollen. Bei allen getesteten Temperaturen wurden im Verlauf des Experiments keine signifikanten Schwankungen in den Expressionsniveaus von Mlig-ddx39 zwischen den Kontrollproben beobachtet (Abb. 6). Gleichzeitig wurde bei den mit Mlig-ddx39-dsRNA behandelten Tieren bereits nach einem Tag der Behandlung bei 20 °C oder 25 °C ein Rückgang der ddx39-Transkripte um ca. 80 % und bei 30 °C sogar um ca. 90 % beobachtet. An den darauffolgenden Tagen stabilisierten sich die Knockdown-Werte jedoch bei allen Temperaturen bei etwa 95 %. Daraus schließen wir, dass die Kinetik der RNAi selbst nicht wesentlich von der Temperatur beeinflusst wird. Stattdessen kann die beobachtete Verkürzung der Zeit für die Manifestation des Mlig-ddx39-RNAi-Phänotyps bei höheren Temperaturen durch die erhöhte Rate des Zellumsatzes erklärt werden.

Um zu prüfen, ob die Beschleunigung der Entwicklung von RNAi-Phänotypen bei erhöhten Temperaturen auf andere Gene verallgemeinert werden kann, untersuchten wir das Gen Mlig-sperm1, dessen Knockdown zu einer abnormen Spermienmorphologie und vergrößerten Hoden führt. Dies ist ein langsamer RNAi-Phänotyp, der sich bei 20 °C erst nach 2-3 Wochen entwickelt. Um das Ausmaß des Phänotyps bei verschiedenen Temperaturen zu quantifizieren, zählten wir am Tag 4 der RNAi-Behandlung den Anteil der Tiere, deren Hoden so weit vergrößert waren, dass sie sich berührten. (Abb. 7). Ähnlich wie bei den Ergebnissen mit Mlig-ddx39-RNAi führten höhere Temperaturen zu einer schnelleren Entwicklung des Phänotyps, und während nach vier Tagen dsRNA-Behandlung bei 20 °C keine ausreichend vergrößerten Hoden beobachtet wurden, hatten 25 und 85 % der Tiere bei 25 °C bzw. 30 °C vergrößerte Hoden entwickelt (Tabelle 2). Ähnlich wie bei der Regeneration können also auch bei M. lignano RNAi-Phänotypen mit der Temperatur beschleunigt werden, und höhere Temperaturen können zur Verkürzung der Versuchsdauer verwendet werden.