8.3 Chemische Tests
Der Nachweis von PHG-Bestandteilen auf TLC-Platten ist mit allgemeinen Reagenzien für Phenole, Eisenchlorid, Vanillin und Salzsäure (ergibt eine Reihe von Rosafarben mit Resorcin- oder Phloroglucinol-Derivaten), oder mit spezifischeren Tests mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (weist Aldehyde nach) möglich. Das Reagenz von Folin-Ciocalteu eignet sich auch für den Nachweis von Phenolen mit Catechol- oder Hyrochinon-Kernen (blaue Flecken erscheinen sofort nach dem Besprühen der TLC-Platte) oder für andere Phenole, die blaue bis graue Flecken zeigen, wenn die Platte mit Ammoniakdampf bestäubt wird. Das Gibbs-Reagenz (2 % 2,6-Dichlorchinonchlorimid in Chloroform), gefolgt von der Begasung der Platte mit 2M NH4OH, ergibt eine Vielzahl von Farben (z. B. ist es möglich, Vanillinsäure – rosa Farbe – und Isovanillinsäure – blau – zu unterscheiden). Zimtsäurederivate zeigen bei der Untersuchung unter UV-Licht (366 nm) eine charakteristische hellblaue Fluoreszenz. Cis- und trans-Isomere von Zimtsäuren werden auf TLC-Platten dargestellt, wenn der Extrakt in wässrigen Lösungsmitteln in zwei Richtungen chromatographiert wird (2D-TLC). Spektrophotometrische Methoden zur Bestimmung des Phenolgehaltes werden häufig verwendet, z.B. die Methode mit dem Arnow’schen Reagenz oder das bereits erwähnte Folin-Ciocalteu’sche Reagenz.
Einige qualitative Tests weisen Cumarine in Pflanzenextrakten nach, z.B., Lactonringtest (Cumarine, die durch verdünnte Lauge hydrolysiert werden, bilden eine gelbe Lösung von O-Cumarsäuresalzen, die sich nach Ansäuerung oder Sättigung mit CO2 umkehren lässt); oder Azo-Kupplungstest (rote Farbe entsteht durch die Reaktion mit Diazotierungssulfanilsäure in alkalischer Lösung). Cumarine lassen sich unter UV-Licht (365 nm) leicht nachweisen, da sie eine charakteristische Farbfluoreszenz aufweisen (mit Ausnahme des einfachen unsubstituierten Cumarins, das keine Fluoreszenz aufweist). Sie werden durch ihre blaue, violette, braune, grüne oder gelbe Farbe erkannt. Eine 10%ige Lösung von KOH in Methanol oder eine 20%ige Lösung von Antimonchlorid in Chloroform kann die Farbe intensivieren. Hydroxycumarine weisen in alkalischer Lösung keine bathochromen Spektralverschiebungen auf. Bei der HPLC-Analyse mit Diodenarraydetektion ermöglichen verschiedene UV-Spektren der Cumarine eine schnelle Identifizierung der Verbindungen.
Chromone reagieren in alkalischen Lösungen zu O-Hydroxy-β-diketonen ohne Regeneration des γ-Pyronrings und auch zu farbigen Verbindungen mit konzentrierter Säure und konzentrierter Lauge. Chromone sind auch im UV-Licht sichtbar (blaue, gelbe, grünlich-gelbe, braune Fluoreszenz bei 365 nm).
Das Vorhandensein des aktiven Phenylrings (Chromophor) in Flavonoiden macht sie unter UV-Licht leicht nachweisbar. Ihre UV-Spektren sind besonders aufschlussreich, da sie strukturelle Informationen liefern, mit denen sich die Art des Phenols und das Oxidationsmuster unterscheiden lassen. Verschiedene chemische Reaktionen durch Besprühen von TLC-Chromatogrammen sind möglich, z. B. die Visualisierung in Gegenwart von Ammoniakdampf (Chalkone und Aurone färben sich orange bzw. rot) oder das Besprühen mit Naturstoff Reagenz A (1 %ige Lösung des Esters von 2-Aminoethanol und Diphenylborsäure) und Übersprühen mit 5 % methanolischer Lösung von Polyethylenglykol 4000 (PEG 4000), was die Empfindlichkeit dieser Reaktion erhöht. Nach der Derivatisierung konnten die Verbindungen im UV-Licht beobachtet werden (Fluoreszenz von hellgelb bis grün). Weitere Tests umfassen das Besprühen mit Eisenchlorid, diazotierter Sulfanilsäure (beides Reaktionen für Phenole) und die spezifische Reaktion von Cyanidin mit Magnesiumpulver in Gegenwart von Salzsäure (zeigt das Vorhandensein von Flavanonen und Dihydroflavanolen an). Zur quantitativen kolorimetrischen Bestimmung von Flavonoiden wird die Reaktion mit Aluminiumchlorid (AlCl3) verwendet (Absorption bei 425 nm gemessen). In Alkalilösungen gelöste Flavonoide zeigen eine intensive gelbe Farbe, die nach Zugabe von Säure abnimmt. UV-Spektren von Flavonoidverbindungen zeigen zwei Hauptbanden (Absorptionsmaxima): Bande I bei höherer Wellenlänge (zurückzuführen auf den Cinnamoylteil der Flavonoidstruktur) und Bande II bei niedrigerer Wellenlänge (bedingt durch den Benzoylteil). Die Bande I liegt normalerweise bei 304-350 nm für Flavone (H an C-3 im C-Ring), bei 352-385 nm für Flavonole (OH-Gruppe an C-3) und bei 328-357 nm für 3-substituierte Flavonole (O-Substitution an C-3). Die Bande II liegt für die meisten Strukturen bei ca. 250-280 nm. Eine zusätzliche Phenolgruppe (-OH) im Ring A verursacht die bathochrome Verschiebung (Verschiebung zu längeren Wellenlängen) in der Bande II, und eine zusätzliche -OH-Gruppe im Ring B erzeugt einen ähnlichen Effekt in der Bande I.
Die meisten Anthrachinone oder ihre Glykoside bilden gelbe oder orange-rote Kristalle und können eine vom pH-Wert abhängige Fluoreszenz zeigen. Die wichtigste Farbreaktion ist der Bornträger-Test, der durch Auflösen des Chinons in alkalischem wässrigem Medium durchgeführt wird. Die Farbreaktion reicht von orange-rot bis purpur-violett (je nach Struktur und Substituenten des Chinons). Anthrachinone ergeben bei dieser Reaktion eine rote Farbe. Für 1,8-Dihydrochinone wird auch die Reaktion mit Magnesiumacetat verwendet. Anthrachinone können auf TLC-Platten nach Besprühen mit 10%iger methanolischer KOH-Lösung nachgewiesen werden. Die ursprünglich gelbe oder gelb-braune Farbe ändert sich in rot, violett, grün oder violett. Pulverisierter Rhabarber kann unter UV-Licht untersucht werden, um das Vorhandensein von Raponthicin (stilbenoides Glykosid, das giftig ist) nachzuweisen. Bei ursprünglichem Rhabarber (Rheum palmatum) erscheint eine rötlich-braune Fluoreszenz, aber es sind keine leuchtenden bläulich-violetten Flecken zu sehen (wie bei rhapontischem Rhabarber-Rheum rhaponticum).
Wie bereits erwähnt, sind Saponine oberflächenaktive Verbindungen (verändern die Oberflächenspannung) und haben emulgierende Eigenschaften. Für eine schnelle qualitative Überprüfung, ob eine Pflanze SPGs enthält, wird üblicherweise ein Schaumtest durch Schütteln des Pflanzenmaterials mit Wasser durchgeführt. Saponine haben membranpermeabilisierende Eigenschaften. Niedrige Konzentrationen von Saponinen sind in der Lage, Erythrozytenmembranen zu zerstören (wodurch das in den Membranen der roten Blutkörperchen vorhandene Cholesterin ausgefällt werden kann), was zu einer Hämolyse von Blut in vitro führt. Diese Fähigkeit hat dazu geführt, dass die Hämolyse (hämolytischer Index – IH) als Methode zur Bestimmung der biologischen Aktivität weit verbreitet ist. Der IH ist definiert als die Menge einer 2%igen isotonischen Rinderblutsuspension (in ml), die bei der Behandlung mit 1 g des geprüften Pflanzenmaterials (oder des geprüften Extrakts) hämolysiert wird. Als Referenz wurde Gypsophila paniculata Saponin Mischung (IH=30.000) oder Saponin Album (Merck) (IH=15.000) verwendet. Wie von Hostettmann und Marston beschrieben, variiert die hämolytische Aktivität von Saponosiden erheblich mit der Struktur des Glykosidteils. Monodesmosidische Saponine (außer Acylglycoside und Glycyrrhizin) sind stark hämolytisch. Keine Farbreaktion ist besonders spezifisch für SPGs. Es gibt jedoch die Liebermann-Reaktion (mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart von Schwefelsäure), bei der sich die Farben je nach Art des Aglykons unterscheiden (Triterpen-rosa bis rot – oder Steroid-blau-grün).
Chemische Reaktionen zur Identifizierung von CRGs in Pflanzenmaterial können auf die Aglykone oder auf die Zucker zurückzuführen sein. Der Test von Liebermann und Salkoviski weist auf Steroidanteile hin und ist daher nicht spezifisch für CRGs. Der Kiliani- und der Xanthidrol-Test weisen beide auf Desoxyzucker (Digitoxose oder Cymarose) hin. Die Kedde- oder Baljet-Reaktion ist spezifischer, da sie an das Vorhandensein eines α,β-ungesättigten Lactonrings gebunden ist. Auch eine Fluoreszenzreaktion von CRGs ist möglich, z. B. eliminiert die Hydroxylgruppe von Digoxin an C-14 und C-16 mit H2SO4 Wasser unter Bildung von zwei zusätzlichen Doppelbindungen. Dadurch entsteht ein konjugiertes System (mit einer Doppelbindung im Lactonring), das Digoxin im UV-Licht fluoreszieren lässt. Die Jensen-Reaktion (nach Besprühen mit Trichloressigsäure in Ethanol) wird verwendet, um CRGs auf TLC-Chromatogrammen sichtbar zu machen.
Die direkte Messung des gesamten HCN durch saure Hydrolyse der in Lebensmitteln vorhandenen cyanogenen Glykoside sowie die Zersetzung der intermediären Cyanohydrine zu HCN hat den Vorteil, dass sie auf alle Arten von Proben anwendbar ist, obwohl wahrscheinlich nicht das gesamte potenzielle HCN der cyanogenen Glykoside in vivo verfügbar ist. Das Vorhandensein dieser Verbindungen in Pflanzen lässt sich auf Filterpapier sichtbar machen, das mit Reagenzien wie Pikrinsäure/Natriumcarbonat oder Benzidin/Kupferacetat imprägniert ist. Diese Reagenzien sind in der Lage, Farbreaktionen mit dem aus dem zerkleinerten Pflanzengewebe freigesetzten HCN hervorzurufen. Ein imprägniertes Papier wird in einem Röhrchen über das zerkleinerte Pflanzenmaterial gelegt und 2 Stunden lang bei 40 °C bebrütet. Ein Farbwechsel von gelb nach rotbraun zeigt die enzymatische Freisetzung von HCN an. Pikratpapier ist nicht ganz spezifisch für Cyanogen (flüchtige Isothiocyanate aus Brassica-Arten reagieren ebenfalls auf diese Reaktion). Daher wird auch ein anderer Test verwendet, bei dem eine Mischung (1:1) aus frisch hergestellten Lösungen von 1 % 4,4-Tetramethyldiamin-Diphenylamin in Chloroform (w/v) und 1 % Kupferethylacetoacetat in Chloroform (w/v) verwendet wird. Die Farbreaktion wechselt von einem schwachen Blaugrün zu einem hellen Grün. Eine andere mögliche Methode erfordert die Destillation des Pflanzengewebes in saurem Wasser und die Titration des freigesetzten HCN mit Silbernitrat. Chromatographische Methoden wie HPLC/MS oder GC/MS von Trimethylsilylderivaten sind für die Analyse einzelner cyanogener Glykoside oder Cyanohydrine geeignet und ermöglichen die chemische Charakterisierung sowie die Quantifizierung der Verbindungen.
Aufgrund der Vielfalt der Produkte, die in Pflanzen aus Glucosinolaten gebildet werden (abhängig von ihrer Aglykonstruktur), kann die Schätzung von Isothiocyanaten durch die spektrophotometrische Methode (bei der Farbprodukte 1,3-Benzodithiol-2-tione durch Isothiocyanatkondensation mit 1,2-Benzoldithiol gebildet werden) unzureichend sein, um den Glucosinolatgehalt in Pflanzen zu bestimmen.