Spektroskopische Methoden
Absorptionsspektroskopie. Bei einigen Enzymassays ist es möglich, den Reaktanten oder das Produkt direkt anhand seiner Absorptionseigenschaften zu messen Fersht (1999). Bei der von der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) katalysierten Reaktion absorbiert ein Produkt (NADH) Licht bei 340 nm, so dass die Reaktion durch Verfolgung des Anstiegs der Absorption bei dieser Wellenlänge überwacht werden kann.
Glucose-6-Phosphat + NAD+ → 6-Phosphogluconat + NADH + H+
In anderen Fällen wird ein Reaktant oder Produkt indirekt gemessen. Bei der Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) wird zum Beispiel Acetylthiocholin als Substrat verwendet, das bei Kontakt mit dem Enzym Thiocholin freisetzt. Das Thiocholin reagiert mit Ellmans Reagenz zu einem gefärbten Produkt, so dass die Reaktion durch den Anstieg der Absorption überwacht werden kann.
Acetylthiocholin + H2O → Acetat + H+ + Thiocholin
Thiocholin + Ellmans Reagenz → gefärbtes Derivat
Gekoppelte Assays werden manchmal zur Überwachung der Enzymaktivität verwendet. In diesem Fall wird die interessierende enzymatische Reaktion mit einer zweiten Reaktion gepaart, die zur bequemen Messung gekoppelt wird. Ein Beispiel hierfür ist der Assay für Hexokinase (EC 2.7.1.1). In diesem Fall wird ein Überschuss an Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und NAD+ in die Testmischung gegeben und die Absorption bei 340 nm überwacht.
Reaktion I: Glucose + ATP → Glucose-6-Phosphat + ADP
Reaktion II: Glukose 6-Phosphat + NAD+ → 6-Phosphogluconat + NADH + H+
In diesem Beispiel sollte Reaktion I ratenlimitierend sein und die Konzentration von Glukose 6-Phosphat sollte nach einer Verzögerungszeit einen Steady State erreichen. Cleland Cleland (1979) formulierte ein Verfahren, mit dem sichergestellt werden kann, dass der gekoppelte Assay eine genaue Messung der Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms liefert. Wenn möglich, ist es vorzuziehen, eine Reaktion kontinuierlich zu überwachen. Bei den oben beschriebenen Assays kann das Spektralphotometer so programmiert werden, dass es eine kontinuierliche Anzeige in Abhängigkeit von der Zeit liefert. Bei Trenntechniken, die den Einsatz von Radioaktivität, Elektrophorese oder Chromatographie umfassen können, werden diskontinuierliche oder Endpunkt-Assays verwendet. Nachdem eine lineare Zeitspanne für einen Test festgelegt wurde, wird ein Parameter zu einem einzigen Zeitpunkt innerhalb der linearen Zeitspanne gemessen (vorzugsweise zu einem Zeitpunkt nahe der Mitte der linearen Phase). Die Geschwindigkeit wird dann aus der Differenz des Signals zu diesem Zeitpunkt und zum Beginn der Reaktion bestimmt. Bei Endpunkt-Assays ist Vorsicht geboten, und die Zeitverläufe sollten überprüft werden, um die Linearität zu bestätigen. Änderungen der Inkubationsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert oder Substratkonzentration, können die Linearität eines Assays verändern. Bei routinemäßigen Enzymtests enthält das Reaktionsgefäß alle Komponenten außer einer, und die Reaktion wird durch Zugabe der fehlenden Komponente (das Enzym oder eines der Substrate) eingeleitet. Die anderen Komponenten sollten in Bezug auf pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke im Gleichgewicht sein. Die Reaktion wird in der Regel durch die Zugabe eines kleinen Volumens einer konzentrierten Stammlösung der fehlenden Komponente eingeleitet. Ein kleines Volumen stellt sicher, dass diese Zugabe die bereits etablierten Gleichgewichtsbedingungen nicht stört. Wenn es nicht möglich ist, eine kleine Komponente hinzuzufügen, sollten die getrennten Komponenten die gleiche Temperatur, Ionenstärke und p H aufweisen. Obwohl eine vollständige Durchmischung der beiden Komponenten erfolgen muss, sollte starkes Schütteln vermieden werden, da dies das Enzymprotein denaturieren kann. Das Mischen kann durch Umdrehen eines Röhrchens mit einem angebrachten Stopfen oder einer Küvette mit Parafilm-Verschluss erfolgen. Verdünnte Proteine sind oft weniger stabil als konzentrierte, und die Versuche werden oft in Gegenwart eines inerten Proteins, wie z. B. Rinderserumalbumin (0,25 mg/ml), durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu stabilisieren. Es sollten Versuche durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Protein inert ist. Da Albumin z. B. an hydrophobe Substrate binden kann, ist es für diesen Zweck nicht immer geeignet. Für diskontinuierliche Assays kann der Timer eingestellt und die Proben nach dem Mischen in bestimmten Zeitabständen entnommen werden. Bei den meisten Spektralphotometern wird die Detektion manuell über ein Bedienfeld oder eine Computertastatur ausgelöst. Um eine Komponente in eine Küvette zu geben, benötigt man etwa 20 Sekunden, um die Küvette in ein Spektralphotometer einzusetzen und die Detektion durch Drücken einer Computertaste zu starten. Diese Zeit ist in der Regel nicht von großer Bedeutung, da der Test bei den meisten Reaktionen zwischen 10 und 30 Minuten läuft. Zu den Kontrollmessungen gehören ein nicht-enzymhaltiger Leerwert und ein nicht-substrathaltiger Leerwert. Mit diesen Kontrollen wird sichergestellt, dass keine Zufallsreaktionen auftreten. Die Kontrollrate (nicht enzymhaltiger Leerwert) wird von dem durch den Versuch erzeugten Datum abgezogen, um die tatsächliche Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion zu ermitteln. Bei vielen Assays ist es erforderlich, die Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt zu quenchen oder zu stoppen, um eine weitere Produktbildung zu verhindern. So können beispielsweise über einen bestimmten Zeitraum hinweg alle 5 Minuten Proben entnommen und das Produkt mittels HPLC gemessen werden.
Jede chromatographische Analyse kann 30 Minuten dauern. Methoden zur Beendigung der Reaktion beinhalten in der Regel die Denaturierung des Enzyms durch Zugabe von Säure oder das Eintauchen in ein kochendes Wasserbad. Die Aktivität einiger Metalloenzyme kann mit EDTA oder einem anderen Metallionenchelator gequencht werden. Die meisten Enzymtests beruhen auf spektroskopischen Techniken, wobei die beiden am häufigsten verwendeten die Absorption und die Fluoreszenz sind Fersht (1999). Die Wellenlänge, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit verfolgt wird, sollte diejenige sein, die den größten Unterschied in der Absorption zwischen dem Substrat und dem Produkt ergibt. Absorptionsmessungen werden mit einem Standardspektralphotometer durchgeführt, wobei die Proben in speziellen Küvetten untergebracht sind. Im Handel sind Einweg-Kunststoffküvetten erhältlich, die 1 oder 3 ml Proben fassen. Ihre Verwendung ist auf den sichtbaren Wellenlängenbereich (350-800 nm) beschränkt. Für Messungen bei Wellenlängen unter 350 nm müssen Quarzküvetten verwendet werden (Glas und Kunststoff absorbieren Licht im UV-Bereich). Die Schichtdicke der Küvetten wird vom Hersteller angegeben. Gängige Schichtdicken sind 1,00 cm, 0,40 cm und 0,20 cm. Immer mehr Assays werden mit 96-Well-Mikrotiterplatten mit Kunststoff- oder Quarzböden durchgeführt. Die Konzentration einer Substanz, die Licht bei bestimmten Wellenlängen absorbiert, kann mit Hilfe des Beerschen Gesetzes bestimmt werden:
A = εcl,
wobei A die Absorption der Probe bei einer bestimmten Wellenlänge, c die Konzentration der Probe, l die Schichtdicke und ε der Extinktionskoeffizient oder das molare Absorptionsvermögen ist. ε hat die Einheit M-1 cm-1 oder mM-1 cm-1. Wenn der Wert von ε für eine bestimmte Substanz bekannt ist, kann die Konzentration dieser Substanz in einer Lösung durch Messung ihrer Absorption in dieser Lösung berechnet werden. Mit Hilfe des Beer’schen Gesetzes lässt sich die Änderungsrate der Konzentration im Verlauf einer Reaktion berechnen. Ein möglicher Fehler bei der Verwendung von Absorptionsmessungen ergibt sich aus einer Abweichung vom Beerschen Gesetz, da dieses nur für einen endlichen Bereich von Absorptionswerten gilt. Da es bei Absorptionswerten über 1 nicht anwendbar ist, sollten die Versuche so angelegt sein, dass die experimentellen Werte unter diesem Wert bleiben. Einige dieser Probleme können umgangen werden, indem Küvetten mit kürzeren Schichtdicken verwendet werden. Eine Probe mit einer Extinktion von 1,00 in einer Küvette mit 1,00 cm Schichtdicke hat eine Extinktion von 0,20 in einer Küvette mit 0,20 cm Schichtdicke. Im Allgemeinen stellt die Arbeit mit einer Absorption von etwa 0,5 einen Kompromiss zwischen der Minimierung des optischen Rauschens eines Spektralphotometers und der Erzielung eines angemessenen Messsignals dar. Die Trübung in einer Lösung kann das Licht streuen und eine scheinbare Absorption erzeugen. Durch Filtration oder Zentrifugation können diese Partikel entfernt werden. Zwar lassen sich einige Abweichungen von der Linearität durch Änderungen der Weglänge vermeiden (d. h., wenn die Absorption so hoch ist, dass das Spektralphotometer keine genaue Messung vornehmen kann), doch sind die Abweichungen häufig auf intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den absorbierenden Spezies zurückzuführen. Dimerisierung (oder Bildung von Eximeren höherer Ordnung) tritt bei höheren Konzentrationen der absorbierenden Spezies auf. In diesen Fällen wird das Beersche Gesetz befolgt, wenn die Konzentration des Produkts verringert wird. Dies kann entweder durch Verlangsamung der Reaktion (durch Verringerung der Enzymkonzentration) oder durch Messungen über einen kürzeren Zeitraum (bevor Abweichungen vom Beerschen Gesetz auftreten) erreicht werden.