Virusstämme
HCoV-229E (VR-740) und HCoV-OC43 (VR-1558) wurden in menschlichen diploiden Lungenfibroblasten MRC-5 (CCL-171) und WI-38 (CCL-75) vermehrt, vermehrt (alle von ATCC, Manassas, VA). Beide menschlichen Zelllinien wurden in MEM gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) ergänzt wurde. Das Virusinfektionsmedium bestand aus MEM oder RPMI-1640 plus 2 % hitzeinaktiviertem FBS für HCoV-229E bzw. HCoV-OC43. Die Vermehrung der Virusstämme erfolgte durch Inokulation von Kolben mit 24 Stunden alten Wirtszellen, die zu 80-90 % konfluent waren. Nach einstündiger Inkubation wurde die Zellschicht gewaschen und in frischem Infektionsmedium drei oder vier Tage lang bei 35 °C (HCoV-229E) bzw. 33 °C (HCoV-OC43) inkubiert. Der Überstand, der das Arbeitsvirus enthält, wurde dann durch Zentrifugation (300 g für 15 Minuten) gewonnen. Der Virustiter wurde anhand der 50 %igen Gewebekultur-Infektionsdosis TCID50 durch Bewertung der zytopathischen Effekte (CPE) bestimmt, die mit einem Hellfeldmikroskop (10×) als Vakuolisierung des Zytoplasmas, Zellrundung und Ablösung bewertet wurden.
Benchtop-Aerosol-Bestrahlungskammer
Eine dynamische Aerosol-/Virus-Bestrahlungskammer mit einem Durchgang wurde zur Erzeugung, Exposition und Sammlung von Aerosolproben verwendet, wie zuvor beschrieben23. Virale Aerosole wurden durch Zugabe einer Viruslösung in einen Hochleistungs-Aerosolvernebler für die Atemtherapie (Westmed, Tucson, AZ) erzeugt, der mit einer Luftpumpe mit einer Durchflussrate von 11 l/min betrieben wurde. Das Virus floss in die Kammer und wurde mit trockener und befeuchteter Luft gemischt, um eine Luftfeuchtigkeit von etwa 50-70 % aufrechtzuerhalten. Die relative Luftfeuchtigkeit, die Temperatur und die Größenverteilung der Aerosolpartikel wurden während des gesamten Betriebs überwacht. Das Aerosol wurde mit Fern-UVC-Licht bestrahlt und schließlich mit einem BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA) gesammelt.
Die Fern-UVC-Lampe wurde etwa 22 cm von der UV-Bestrahlungskammer entfernt positioniert und auf das 26 cm × 25,6 cm × 254 μm große UV-durchlässige Kunststofffenster (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY) gerichtet. In Übereinstimmung mit unseren früheren Experimenten mit dieser Kammer23 betrug die Durchflussrate durch das System 12,5 l/min. Das Volumen des UV-Bestrahlungsbereichs betrug 4,2 l, so dass jedes Aerosol beim Durchqueren des Fensters etwa 20 Sekunden lang bestrahlt wurde. Die gesamte Bestrahlungskammer befand sich in einer Kabine der Biosicherheitsstufe 2, und alle Luftein- und -ausgänge waren mit HEPA-Filtern (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) ausgestattet, um zu verhindern, dass unerwünschte Kontaminationen in das System eindringen oder es verlassen.
Leistung der Bestrahlungskammer
Die kundenspezifische Bestrahlungskammer simulierte die Übertragung von aerosolierten Viren, die durch menschliches Husten und Atmen entstehen. Die Kammer arbeitete bei einer durchschnittlichen relativen Luftfeuchtigkeit von 66 % und einer durchschnittlichen Temperatur von 24 °C in allen Durchläufen. Die durchschnittliche Partikelgrößenverteilung betrug 83 % zwischen 0,3 μm und 0,5 μm, 12 % zwischen 0,5 μm und 0,7 μm und 5 % >0,7 μm (Tabelle 3). Aerosolisierte Viren wurden effizient durch das System übertragen, wie aus der Kontrolle (Nullexposition) hervorgeht, die eine deutliche Virusintegration zeigte (Abb. 2 und 3, oben links).
Fern-UVC-Lampe und Dosimetrie
Die in dieser Studie verwendete Fern-UVC-Quelle war ein 12 W 222-nm-KrCl-Excimer-Lampenmodul der Firma USHIO America (Artikel #9101711, Cypress, CA). Die Lampe ist mit einem firmeneigenen optischen Filterfenster ausgestattet, das die Lampenemissionen außerhalb des 222-nm-KrCl-Emissionspeaks reduziert. Die Lampe wurde 22 cm vom Fenster der Belichtungskammer entfernt positioniert und auf die Mitte des Fensters gerichtet. Optische Leistungsmessungen wurden mit einem UV-verstärkten Silizium-Photodetektor 818-UV/DB mit geringer Leistung und einem optischen Leistungsmesser 843-R (Newport, Irvine, CA) durchgeführt. Die Dosimetrie wurde vor Beginn eines Experiments durchgeführt, um die Fluenz in der Kammer an der Position des Aerosols zu messen.
Der Abstand zwischen der Lampe und der Bestrahlungskammer ermöglichte es einer einzigen Lampe, den gesamten Bereich des Expositionsfensters gleichmäßig zu bestrahlen. Messungen mit dem Silizium-Photodetektor ergaben eine Bestrahlungsintensität von etwa 90 μW/cm2 über den gesamten Belichtungsbereich. Die Kammer ist mit einer reflektierenden Aluminiumoberfläche gegenüber dem Belichtungsfenster ausgestattet. Wie bei unseren früheren Arbeiten mit dieser Kammer23 betrug das Reflexionsvermögen dieser Oberfläche etwa 15 %. Daher haben wir die Intensität über den gesamten Belichtungsbereich konservativ auf 100 μW/cm2 geschätzt. Bei einem Abstand der Lampe von 22 cm zum Fenster und angesichts der 20 Sekunden, die ein Aerosolteilchen benötigt, um das Belichtungsfenster zu durchqueren, berechneten wir die Gesamtdosis für ein Teilchen auf 2 mJ/cm2. Wir verwendeten zusätzliche Folien mit UV-durchlässigen Kunststofffenstern, um die Intensität im gesamten Expositionsbereich gleichmäßig zu reduzieren und verschiedene Expositionsbedingungen zu schaffen. Während wir bei unseren früheren Arbeiten mit diesen Folien eine Transmission von annähernd 65 %23 gemessen haben, lag die 222-nm-Transmission der einzelnen Folien bei diesen Tests bei etwa 50 %. Dieser Rückgang der Transmission ist wahrscheinlich auf die Photodegradation des Kunststoffs im Laufe der Zeit zurückzuführen4. Die Hinzufügung von einer oder zwei Folien des Kunststoffs, die das Belichtungsfenster abdecken, verringert die Belichtungsdosis auf 1 bzw. 0,5 mJ/cm2.
Experimentelles Protokoll
Wie zuvor beschrieben23, bestand die Viruslösung im Zerstäuber aus 1 ml Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY), das 107-108 TCID50 des Coronavirus enthielt, 20 ml deionisiertem Wasser und 0,05 ml Hank’s Balanced Salt Solution mit Calcium und Magnesium (HBSS++). Die Bestrahlungskammer wurde vor jeder Probenahme 5 Minuten lang mit aerosolierten Viruspartikeln betrieben, die durch die Kammer und den Bypass-Kanal strömten, um den gewünschten RH-Wert zu erreichen. Die Probenahme wurde eingeleitet, indem der Luftstrom vom Bypass-Kanal zum BioSampler mit Hilfe der Dreiwegeventile geändert wurde. Der BioSampler wurde zunächst mit 20 ml HBSS++ gefüllt, um das Aerosol aufzufangen. Während jeder Probenahme, die 30 Minuten dauerte, wurde das Innere der Bestrahlungskammer mit 222-nm-Fern-UVC-Licht bestrahlt, das durch das Kunststofffenster eintrat. Die Variation der Fern-UVC-Dosis, die auf die Aerosolpartikel einwirkt, wurde durch das Einsetzen zusätzlicher UV-transparenter Kunststofffolien wie oben beschrieben erreicht, wodurch die drei Testdosen von 0,5, 1,0 und 2,0 mJ/cm2 erreicht wurden. Die Null-Dosis-Kontrollstudien wurden bei ausgeschalteter Excimer-Lampe durchgeführt. Nach Beendigung des Probenahmezeitraums wurde die Lösung aus dem BioSampler für die Virusinfektiositätstests verwendet.
Virusinfektiositätstests
TCID50
Zur Bestimmung der Virusinfektiosität28 verwendeten wir den 50% Gewebekultur-Infektiositätsdosis-Assay. Kurz gesagt wurden am Tag vor dem Experiment 105 Wirtszellen in jede Vertiefung von 96-Well-Platten plattiert. Die Zellen wurden zweimal in HBSS++ gewaschen, und serielle 1:10-Verdünnungen des exponierten Virus aus dem BioSampler im Infektionsmedium wurden zwei Stunden lang auf die Zellen aufgetragen. Anschließend wurden die Zellen zweimal in HBSS++ gewaschen, mit frischem Infektionsmedium bedeckt und drei oder vier Tage bei 34 °C bebrütet. Zytopathische Effekte (CPE) wurden mit einem Hellfeldmikroskop (10×) als Vakuolisierung des Zytoplasmas, Zellrundung und Ablösung bewertet. Die TCID50 wurde nach der Methode von Reed und Muench28,38 berechnet. Zur Bestätigung der CPE-Werte wurden die Proben fünf Minuten lang in 100 % Methanol fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Die Ergebnisse werden als Schätzung der plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml unter Verwendung der Umrechnung PFU/ml = 0,7 TCID50 unter Anwendung der Poisson-Verteilung29 angegeben.
Immunfluoreszenz
Um zu beurteilen, ob steigende Dosen von 222-nm-Licht die Anzahl der infizierten Zellen reduzierten, führten wir ein Standardprotokoll zur Fluoreszenzimmunfärbung durch, um ein virales Antigen in den menschlichen Wirtszellen nachzuweisen23. Kurz gesagt: 2 × 105 Wirtszellen (MRC-5-Zellen für HCoV-229E und WI-38 für HCoV-OC43) wurden am Tag vor dem Experiment in jede Vertiefung von 48-Well-Platten gegeben. Nach einem 30-minütigen Durchlauf durch die Bestrahlungskammer wurden 150 μl der aus dem BioSampler entnommenen Virussuspension auf die Monolage der Wirtszellen aufgetragen. Die Zellen wurden eine Stunde lang mit dem Virus bebrütet, dann dreimal mit HBSS++ gewaschen und über Nacht in frischem Infektionsmedium bebrütet. Die infizierten Zellen wurden dann 5 Minuten lang in 100 % eiskaltem Methanol bei 4 °C fixiert und mit Anti-Human-Coronavirus-Spike-Glykoprotein (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 in HBSS++ mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln eine Stunde lang markiert. Die Zellen wurden dreimal in HBSS++ gewaschen und mit Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 in HBSS++ mit 1 % BSA bei Raumtemperatur 30 Minuten lang im Dunkeln unter leichtem Schütteln markiert. Nach dreimaligem Waschen in HBSS++ wurden die Zellen mit Vectashield, das DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) enthielt, angefärbt und mit dem 10×-Objektiv eines Olympus IX70 Fluoreszenzmikroskops beobachtet, das mit einer hochauflösenden, hocheffizienten Photometrics PVCAM-Digitalkamera und der Image-Pro Plus 6.0 Software (Media Cybernetics, Bethesda, MD) ausgestattet war. Für jede 222-nm-Dosis und Virusgattung wurden die repräsentativen Ergebnisse zweimal wiederholt. Für jede Probe wurden bis zu zehn Bildfelder mit zusammengeführten DAPI- und Alexa Fluor-488-Bildern aufgenommen.
Datenanalyse
Der überlebende Anteil (S) des Virus wurde berechnet, indem der Anteil PFU/ml bei jeder UV-Dosis (PFUUV) durch den Anteil bei der Null-Dosis (PFUcontrols) geteilt wurde: S = PFUUV/PFUcontrols. Die Überlebenswerte wurden für jeden Wiederholungsversuch berechnet und in natürliche Logarithmen (ln) transformiert, um die Fehlerverteilung der Normalverteilung anzunähern39. In der Software R 3.6.2 wurde eine robuste lineare Regression unter Verwendung der iterierten, neu gewichteten kleinsten Quadrate (IWLS)40,41 durchgeführt, wobei diese normalisierten ln-Werte als abhängige Variable und die UV-Dosis (D, mJ/cm2) als unabhängige Variable verwendet wurden. Mit diesem Ansatz wurde das Virusüberleben durch eine Kinetik erster Ordnung gemäß der Gleichung4 beschrieben:
wobei k die UV-Inaktivierungsratenkonstante oder der Empfindlichkeitsfaktor (cm2/mJ) ist. Die Regression wurde durchgeführt, wobei der Intercept-Term auf Null gesetzt wurde, was der Definition von 100 % relativem Überleben bei einer UV-Dosis von Null entspricht, und zwar getrennt für jeden untersuchten Virusstamm. Die Daten bei einer Dosis von Null, die per Definition ln = 0 darstellen, wurden nicht in die Regression einbezogen. Die Unsicherheiten (95 % Konfidenzintervalle, KI) für den k-Parameter für jeden Virusstamm wurden durch Bootstrapping für jede Regressionsmethode geschätzt, da Bootstrapping bei kleinen Datensätzen wie den hier verwendeten (n = 3 HCoV-229E und n = 4 für HCoV-OC43) zu realistischeren Unsicherheitsschätzungen führen kann als die analytische Standardannäherung auf der Grundlage asymptotischer Normalität. Die Güte der Anpassung wurde anhand des Bestimmtheitsmaßes (R2) bewertet. Die Analyse der Residuen auf Autokorrelation und Heteroskedastizität wurde mit dem Durbin-Watson-Test42 bzw. dem Breusch-Pagan-Test (implementiert im R-Paket lmtest)43 durchgeführt. Die Parameterschätzungen (k) für jeden Virusstamm wurden auf der Grundlage der 95 %-KI und direkt durch einen t-Test unter Verwendung der Stichprobengrößen, k-Werte und ihrer Standardfehler miteinander verglichen. Der Virusinaktivierungsquerschnitt D90, d. h. die UV-Dosis, die 90 % des exponierten Virus inaktiviert, wurde berechnet als D90 = – ln/k. Andere D-Werte wurden auf ähnliche Weise berechnet.