Genomorganisation und Expression
Genomische RNAs von Luteoviriden enthalten fünf bis sieben konservierte ORFs (Abb. 3). Die ORFs 1, 2, 3 und 5 werden von allen Mitgliedern der Luteoviridae gemeinsam genutzt. Luteoviren fehlt ORF0. Enamoviren fehlt ORF4. Die Genome von Luteo- und Poleroviren enthalten einen kleinen ORF (ORF3a) stromaufwärts von ORF3. Die Genome der Luteoviren enthalten einen kleinen ORF (ORF6) stromabwärts von ORF5. Das PLRV-Genom enthält die ORFs 6 und 7 innerhalb von ORF5 und ORF8 innerhalb von ORF1. Bei den Enamo- und Poleroviren überlappt ORF0 den ORF1 um mehr als 600 nt, der wiederum ORF2 um mehr als 600 nt überlappt. Bei den Luteoviren überschneidet sich ORF1 mit ORF2 um weniger als 50 nt. In den meisten Genomsequenzen der Luteo- und Poleroviren ist ORF4 vollständig in ORF3 enthalten. Ein einzelnes Bernsteinterminationscodon (UAG) trennt ORF5 von ORF3.
Abb. 3. Karten der Virusgenome von Gattungen der Familie Luteoviridae. Einzelne ORFs sind mit offenen Kästen dargestellt. Die ORFs sind vertikal gestaffelt, um die verschiedenen Leserahmen zu zeigen, die von jedem ORF belegt werden. Die gelben Kästchen zeigen die Proteinprodukte an, wobei die vorhergesagten Größen jeweils rechts daneben aufgeführt sind. Die vom ORF1 der Enamo- und Poleroviren kodierten Polyproteine enthalten die Protease und das genomverknüpfte Protein (VPg). Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der durch ORF2 kodierten Proteine ähneln den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen. ORF3, der für das Haupt-Hüllprotein kodiert, ist durch ein gelbes Terminationscodon von ORF5 getrennt. ORF4, wenn vorhanden, ist meist in ORF3 enthalten und kodiert ein Protein, das für die Bewegung des Virus von Zelle zu Zelle erforderlich ist. Luteo- und Poleroviren enthalten einen ORF3a, bei dem die Translation an einem Nicht-AUG-Codon eingeleitet wird. Die nichtkodierenden 3′-Regionen der Luteoviren enthalten Translationsverstärkerelemente (BTE). In PLRV ist ORF7 in-frame mit dem C-Terminus von ORF5, und die Translation von ORF8 wird durch eine interne Initiations-Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) vermittelt. Luteo- und Poleroviren produzieren drei subgenomische RNAs (sgRNAs), während Enamoviren nur eine einzige sgRNA produzieren.
Luteoviren haben relativ kurze 5′- und intergene nicht-kodierende Sequenzen. Dem ersten ORF sind bei der CABYV-RNA 21 nt und bei der Soybean dwarf virus (SbDV)-RNA 142 nt vorangestellt. Die ORFs 2 und 3 sind durch 112-200 nt nicht-kodierende RNA getrennt. Die Länge der Sequenz stromabwärts von ORF 5 variiert beträchtlich und reicht von 167 nt bei CYDV-RPV bis zu 650 nt bei SbDV.
Luteoviren verwenden eine breite Palette von Strategien, um ihre kompakten Genome zu exprimieren. Die ORFs 0, 1, 2 und 8 werden direkt von genomischen RNAs exprimiert. Nachgeschaltete ORFs werden von subgenomischen RNAs (sgRNAs) exprimiert, die von internen Initiationsstellen durch viruskodierte RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRps) von negativsträngigen RNAs transkribiert werden und 3′ co-terminal mit der genomischen RNA sind. Da das Initiationscodon für ORF0 von Polero- und Enamoviren stromaufwärts von ORF1 liegt, wird die Translation von ORF1 durch „Leaky Scanning“ eingeleitet, bei dem Ribosomen das AUG von ORF0 umgehen und die genomische RNA weiter absuchen, bis sie das AUG von ORF1 erreichen. Die Proteinprodukte von ORF2 werden als Translationsfusion mit dem Produkt von ORF1 exprimiert. In einer geringen, aber signifikanten Häufigkeit während der Expression von ORF1 wird die Translation in ORF2 durch einen -1 Frameshift fortgesetzt, der ein großes Protein erzeugt, das Sequenzen enthält, die von beiden ORFs 1 und 2 in einem einzigen Polypeptid kodiert werden. Der Frameshift wird durch eine „schlüpfrige Hepta-Nukleotidsequenz“ (in der Form X XXY YYZ) und eine nachgeschaltete RNA-Sekundärstruktur, eine so genannte Pseudoknot, vermittelt, die die Ribosomen dazu veranlasst, eine Pause einzulegen und sich dann um ein nt zurück zu bewegen, bevor die Translation im neuen Leseraster fortgesetzt wird. ORF8, der nur in PLRV identifiziert wurde, befindet sich vollständig innerhalb von ORF1 in einem anderen Leseraster und kodiert ein 5 kDa großes replikationsassoziiertes Protein. Um ORF8 zu exprimieren, falten sich Sequenzen innerhalb des ORF zu einer Struktur, die als interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) bezeichnet wird und Ribosomen rekrutiert, um die Translation etwa 1600 nt stromabwärts des 5′-Terminus der PLRV-RNA zu initiieren.
Die ORFs 3a, 3, 4 und 5 werden durch einen Leaky-Scanning-Mechanismus vom 5′-Terminus der sgRNA1 exprimiert, der sich etwa 200 nt stromaufwärts von ORF3 am Ende von ORF2 befindet und bis zum 3′-Terminus des Genoms reicht. Die Translation von ORF3a wird an einem Nicht-AUG-Codon eingeleitet. ORF4 der meisten Luteo- und Poleroviren ist in ORF3 enthalten. Bei allen Luteoviren wird ORF5 nur als Translationsfusion mit den Produkten von ORF3 durch Durchlesen des UAG-Stopcodons am Ende von ORF3 exprimiert, wodurch ein Protein mit dem Produkt von ORF3 an seinem N-Terminus und dem Produkt von ORF5 an seinem C-Terminus entsteht. Der Readthrough wird durch lokale und weitreichende RNA-RNA-Wechselwirkungen reguliert und erfordert bei Luteoviren und einigen Poleroviren das Vorhandensein von CCXXXX-Wiederholungen (wobei X eine beliebige Base ist) stromabwärts des ORF3-Stoppcodons. Luteo- und Poleroviren produzieren eine zweite, kleinere sgRNA, die die ORFs 6 und 7 exprimieren kann. Dritte sgRNAs, die nicht für Proteine zu kodieren scheinen, werden in Luteoviren in sehr hohen Mengen produziert, in PLRV jedoch nur in geringen Mengen.
Während Enamo- und Polerovirus-RNAs 5′ VPgs enthalten, die mit Translationsinitiationsfaktoren interagieren, enthalten Luteovirus-RNAs nur ein 5′-Phosphat. Unveränderte 5′-Termini werden für die Translationsinitiation schlecht erkannt. Um dieses Problem zu umgehen, enthält das BYDV-PAV-Genom eine kurze Sequenz (BYDV-Translationselement; BTE), die sich in der nicht-kodierenden 3′-Region stromabwärts von ORF5 befindet und mit Sequenzen in der Nähe der 5′-Termini der genomischen RNA und der sgRNA1 interagiert, um die Cap-unabhängige Translationsinitiierung zu fördern.
Posttranskriptionelles Gen-Silencing (PTGS) ist eine angeborene und hoch adaptive antivirale Abwehr, die in allen Eukaryoten vorkommt und durch doppelsträngige RNAs (dsRNAs) aktiviert wird, die während der Virusreplikation produziert werden. Die Erforschung der Funktionen der von Luteoviren kodierten Proteine hat gezeigt, dass die von ORF0 kodierten 28-34 kDa-Proteine starke Unterdrücker der lokalen und systemischen PTGS für Polero- und Enamoviren sind. Luteovirus-Genomen fehlt ORF0, aber das Produkt von ORF4 in Luteoviren unterdrückt systemisches PTGS.
Die ORF1-kodierten Proteine von Enamo- und Poleroviren enthalten das VPg und eine chymotrypsinähnliche Serinprotease, die für die proteolytische Verarbeitung der ORF1-kodierten Polyproteine verantwortlich ist. Die Protease spaltet das ORF1-Protein intern und setzt das VPg frei, das kovalent an die genomische RNA gebunden ist. Das durch ORF8 von PLRV exprimierte Protein ist für die Virusreplikation erforderlich. Luteoviride ORF2 kodieren mit 59-67 kDa für Proteine, die den bekannten RdRps sehr ähnlich sind und daher wahrscheinlich den katalytischen Teil der viralen Replikase darstellen.
Bei Luteo- und Poleroviren produziert ORF3a hochkonservierte 4,8-5,3 kDa-Proteine, die für die Langstreckenbewegung wesentlich sind. ORF3 kodiert das Haupt-CP der Luteoviren, das eine Größe von 21 bis 23 kDa aufweist. ORF5 hat eine Kodierungskapazität von 29-56 kDa. ORF5 wird jedoch nur dann als Translationsfusion mit dem Produkt von ORF3 exprimiert, wenn die Translation in etwa 10 % der Fälle nicht am Ende von ORF3 aufhört und bis zum Ende von ORF5 fortgesetzt wird. Der ORF5-Teil dieses Readthrough-Proteins wurde mit der Übertragung durch Blattläuse und der Stabilität des Virus in Verbindung gebracht. Experimente mit PLRV und BYDV-PAV haben gezeigt, dass die N-terminale Region des ORF5-Durchleseproteins die Fähigkeit der Viruspartikel bestimmt, an Proteine zu binden, die von endosymbiotischen Bakterien der Blattlausvektoren produziert werden. Die Interaktion der Viruspartikel mit diesen Proteinen scheint für die Persistenz der Viren in Blattläusen wesentlich zu sein. Nukleotidsequenzänderungen im ORF5 von PEMV-1 heben die Übertragbarkeit auf Blattläuse auf. Die N-terminalen Teile der ORF5-Proteine sind bei den Luteoviren hoch konserviert, während die C-Termini viel variabler sind.
Die Luteo- und Polerovirus-Genome besitzen einen ORF4, der in ORF3 enthalten ist und für Proteine von 17-21 kDa kodiert. Viren, die Mutationen in ORF4 enthalten, sind in der Lage, sich in isolierten Pflanzenprotoplasten zu replizieren, sind jedoch unzureichend oder verzögert in der systemischen Bewegung in ganzen Pflanzen. Das Produkt von ORF4 scheint also für die Bewegung des Virus in infizierten Pflanzen erforderlich zu sein. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gestützt, dass Enamoviren ORF4 fehlt. Während Luteo- und Poleroviren auf Phloem und assoziierte Gewebe beschränkt sind, ist das Enamovirus PEMV-1 in der Lage, sich in Anwesenheit von PEMV-2, das unter natürlichen Bedingungen immer mit PEMV-1 koexistiert, systemisch durch andere Pflanzengewebe zu bewegen.
Einige Luteo- und Polerovirus-Genome enthalten kleine ORFs innerhalb und/oder stromabwärts von ORF5. Bei Luteoviren wurden keine Proteinprodukte aus diesen ORFs in infizierten Zellen nachgewiesen. BYDV-PAV-Genome, die ORF6 nicht exprimieren, sind immer noch in der Lage, sich in Protoplasten zu replizieren. Die vorhergesagten Größen der Proteine, die von den ORFs 6 und 7 von PLRV exprimiert werden, betragen 7,1 bzw. 14 kDa. Auf der Grundlage von Mutationsstudien wurde vorgeschlagen, dass diese Genomregionen die Transkription spät in der Infektion regulieren können.