Alai

Im Rahmen dieses Blogeintrags (weitere Informationen zu den verschiedenen Arten von Fixiermitteln folgen…) konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Verwendung von Paraformaldehyd/Formaldehyd, das allgemein als PFA bezeichnet wird und das am häufigsten verwendete Fixiermittel in der Durchflusszytometrie ist. PFA bezieht sich speziell auf die feste, polymere Form von Formaldehyd (und löst sich in wässriger Lösung in monomeres Formaldehyd auf), so dass das, was üblicherweise als „PFA-Fixierung“ bezeichnet wird, in Wirklichkeit die monomere Formaldehydlösung verwendet. In diesem Fall sind PFA und Formaldehyd gleichbedeutend und austauschbar.
Zur Fixierung von Proben für die Durchflusszytometrie wird in der Regel eine Lösung mit 1-4 % PFA verwendet. Bei der Desinfektion von infektiösen Proben können bereits Konzentrationen von 0,37 % die Proben von HIV-infizierten Patienten wirksam desinfizieren1. Eine Inkubation von bis zu 45-60 Minuten mit 1 % PFA und 15-20 Minuten mit 4 % PFA (z. B. Puffer von BioLegend) reicht aus, um die Zellen vollständig zu fixieren, und die Zellen können entweder für die nachfolgende Verarbeitung (Permeabilisierung für intrazelluläre Ziele) verwendet oder in diesem Stadium für künftige Analysen aufbewahrt werden.
Bei einem routinemäßigen Färbeverfahren für die Durchflusszytometrie, bei dem Oberflächenmarker gefärbt werden, gibt es mehrere Schritte, bei denen Sie entscheiden können, ob Sie Ihre Proben fixieren – nach der Oberflächenmarkerfärbung oder vor der Fixierung.
In einigen Fällen ist die Entscheidung, wann Sie fixieren können,… festgelegt. Wenn Sie zum Beispiel Phospho-Targets analysieren, kann die Bindung bestimmter Oberflächenantigene durch Antikörper die intrazellulären Signalwege kurz nach dem Kontakt verändern, was zu einem Artefakt in Ihren Phosphorylierungsergebnissen führt. In diesem Fall sollten Sie die Zellen vor der Zugabe der Oberflächenantikörper fixieren (daher ist unser empfohlenes Protokoll für unseren True-Phos™ Perm Buffer zur Analyse intrazellulärer Phosphorylierungsziele so konzipiert, dass der Fixierungsschritt vor anderen Verfahren erfolgt). Jedes dieser Verfahren hat seine eigenen Vor- und Nachteile, aber hier sind ein paar Dinge, auf die man in jedem Fall achten sollte.