Alai

Kopf-Hals-Krebs ist die siebthäufigste Krebsart nach Inzidenz und Mortalität, mit 890.000 neuen Fällen und 450.000 Todesfällen weltweit im Jahr 2018 . Die Behandlung ist nach wie vor schwierig, da die Fünf-Jahres-Überlebensrate bei Patienten mit lokal fortgeschrittener Erkrankung mit den derzeitigen Therapien unter 50 % liegt. Medikamentenresistenz und Toxizität begrenzen die Wirksamkeit von Chemotherapeutika wie Cis- oder Carboplatin, 5-Fluorouracil und Taxanen. Die Einführung von zielgerichteten Wirkstoffen wie Cetuximab, Nivolumab oder Pembrolizumab verbesserte die Ergebnisse, konnte aber das Problem der primären oder erworbenen Therapieresistenz bei der Mehrzahl der Patienten nicht lösen. Nur sehr wenige Biomarker werden derzeit in der klinischen Praxis eingesetzt oder sind bereits für den Routineeinsatz validiert worden. Zuverlässige präklinische Modelle sind daher von entscheidender Bedeutung für ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die an der Behandlungsresistenz und dem Fortschreiten von HNSCC beteiligt sind, und für die Entwicklung wirksamerer therapeutischer Strategien.

Immortalisierte Zelllinien, die von HNSCC-Tumoren stammen, stellen ein wertvolles Instrument für die funktionelle Analyse der Behandlungsresistenz dar. Das Wirkstoffscreening in Monolayer-Zellkulturen ist nach wie vor der gängige Ansatz zur Identifizierung neuer therapeutischer Wirkstoffe. Dreidimensionale (3D) Kulturen, die die Architektur des Tumorgewebes und die zelluläre Umgebung besser wiedergeben, könnten jedoch für die Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit bei Patienten besser geeignet sein. In der Tat wurden in Studien mit 3D-Zellkulturen große Unterschiede in der Strahlen- und Arzneimittelempfindlichkeit festgestellt, ähnlich denen, die bei In-vivo-Tumoren gefunden wurden. Auch wenn 3D-Kulturen nützlich sind, um die Interaktionen zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu untersuchen, können sie die Komplexität von HNSCC nicht vollständig wiedergeben. Daher könnten für die Entwicklung neuer Therapien letztlich klinisch relevante Tiermodelle von HNSCC erforderlich sein, die die zellulären und molekularen Veränderungen, die mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs beim Menschen einhergehen, genau darstellen. In dieser Hinsicht haben karzinogen-induzierte HNSCC-Modelle, transgene Tiere und transplantierbare Xenograft-Modelle Eingang in die HNSCC-Forschung gefunden. In dieser Übersicht werden die am häufigsten verwendeten präklinischen HNSCC-Modelle beschrieben (schematisch dargestellt in Abb. 1) und ein Überblick über ihre Stärken und Grenzen gegeben. Wir erörtern auch neue Ansätze für eine personalisierte Behandlungsauswahl auf der Grundlage dieser Modelle.

Ex-vivo-Modelle

Immortalisierte HNSCC-Zelllinien

Vor vier Jahrzehnten wurden erste Protokolle für Ex-vivo-Kulturen von HNSCC-Zellen berichtet. Nachdem mit diesen Protokollen frühere Hindernisse wie das Überwachsen von Fibroblasten und die Abhängigkeit von Feederschichten beseitigt worden waren, konnten HNSCC-Zelllinien erfolgreich etabliert werden. Die Kulturtechniken wurden seither weiter verbessert, und es wurden verschiedene HNSCC-Zelllinien erzeugt, die über zahlreiche Passagen hinweg stabil wachsen. Eine detaillierte Beschreibung aller verfügbaren HNSCC-Zelllinien würde den Rahmen dieser Übersichtsarbeit sprengen. Wir möchten den Leser daher auf zwei frühere Übersichtsartikel verweisen. Da immortalisierte HNSCC-Zelllinien leicht zu erhalten und zu erweitern sind, wurden sie in großem Umfang zur Untersuchung genetischer Veränderungen und biologischer Reaktionen auf chemische und genetische Störungen, zur Ermittlung potenzieller molekularer Zielstrukturen und zur Entwicklung neuer niedermolekularer und biologischer Therapeutika eingesetzt. In jüngster Zeit wurde nachgewiesen, dass diese Zelllinien auch zur Untersuchung der intratumoralen Heterogenität und der unter Therapiedruck stattfindenden klonalen Evolution verwendet werden können. Daten aus solchen umfassenden molekularen und funktionellen Studien in diesen Modellen wurden in Bibliotheken wie der Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) zusammengestellt, die eine wertvolle Quelle für die Vielfalt menschlicher Krebserkrankungen darstellen.

Obwohl HNSCC-Zelllinien, die in zweidimensionalen (2D) Monolayerkulturen gezüchtet werden, weiterhin wichtige Modelle bei der Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen für diese Krankheit sind, leiden sie im Allgemeinen darunter, dass sie die histologische Beschaffenheit, die dreidimensionale (3D) Architektur und die strukturellen und funktionellen Unterschiede des Tumors in vivo nicht widerspiegeln können. Diese Einschränkungen beeinflussen die Aussagekraft von In-vitro-Studien zur Bewertung der Wirksamkeit etablierter und neuartiger Behandlungsmethoden für HNSCC in Monolayerkulturen erheblich. In der Tat wurden bemerkenswerte Unterschiede in der Empfindlichkeit von 2D- gegenüber 3D-Kulturen von HNSCC-Zelllinien für die Bestrahlung und medikamentöse Behandlung, z. B. mit Cisplatin, Cetuximab und dem mTOR-Inhibitor AZD8055, festgestellt. Eine vergleichende molekulare Analyse von Zellen, die in 2D- und 3D-Kulturen wachsen, lieferte mögliche Erklärungen für die geringere Empfindlichkeit von Zellen in 3D-Kulturen, wie die Expression und Aktivierung von Genen, die mit der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht werden, und die erhöhte Expression von Genen, die mit dem epithelial-mesenchymalen Übergang und der Stammzellenbildung unter 3D-Bedingungen in Verbindung gebracht werden.

Genetische Instabilität und das Auftreten klonaler Selektion während der In-vitro-Kultur sind weitere potenzielle Einschränkungen von Krebszelllinien und können erklären, warum Ergebnisse, die mit Zelllinien gewonnen wurden, oft schwer zu reproduzieren sind. Eine umfassende Analyse von Stämmen der häufig verwendeten MCF7-Brustkrebs- und A549-Lungenkrebs-Zelllinien ergab eine umfangreiche genomische Variation zwischen den Stämmen, die mit einer Variation der biologisch bedeutsamen zellulären Eigenschaften einherging. Als die Stämme gegen 321 Krebsmedikamente getestet wurden, wurden beträchtliche Unterschiede in der Reaktion auf die Medikamente festgestellt, wobei mindestens 75 % der Verbindungen einige Stämme stark hemmen, während sie bei anderen völlig inaktiv sind. Diese Studie unterstreicht deutlich den dringenden Bedarf an verbesserten Ex-vivo-Modellen zur Unterstützung einer maximal reproduzierbaren Krebsforschung.

Fortgeschrittene Ex-vivo-Modelle von HNSCC

Köpf-Maier und Kollegen waren die ersten, die eine Methode etablierten, die es menschlichen Karzinomzellen aus verschiedenen histologischen Entitäten, einschließlich Plattenepithelkarzinomen (SCCs) des Rachens, ermöglichte, sich in vitro zu „organoiden Strukturen“ umzuorganisieren. Sie zeigten, dass diese organoiden Kulturen die kritischen Eigenschaften des In-vivo-Zustands beibehalten, wie die 3D-Architektur, das Wachstum heterogener Zelltypen aus einem einzelnen Karzinom und die morphologische Differenzierung unter relativ einfachen experimentellen Bedingungen. In einer späteren Studie zeigte dieselbe Gruppe, dass diese organoiden Kulturen für Arzneimitteltests verwendet werden können und dass die daraus gewonnenen Ansprechdaten mit dem Ansprechen der Patienten auf die Therapie übereinstimmen. Die Autoren waren die ersten, die organoide Kulturen als personalisierte In-vitro-Plattform für Arzneimitteltests vorschlugen, die die Vorhersage der individuellen Chemosensitivität von Karzinomen innerhalb weniger Tage ermöglichte.

Seitdem wurden die Techniken für die In-vitro-Züchtung von Geweben in 3D als organotypische Strukturen verfeinert. Es wurden Protokolle für die Etablierung von Organoiden aus adulten und embryonalen Stammzellen entwickelt, die in der Lage sind, sich selbst zu 3D-Strukturen zu organisieren, die das Ursprungsgewebe widerspiegeln (für einen Überblick siehe Clevers, 2016). Die ersten aus adulten Stammzellen gewonnenen Organoidkulturen wurden aus Darmstammzellen von Mäusen hergestellt, die unter Bedingungen platziert wurden, die die Nische der Darmstammzellen nachahmen. Es hat sich gezeigt, dass eine bedingte Reprogrammierung, die durch die Zugabe von R-Spondin-1, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Noggin zum Kulturmedium und die Einbettung der Zellen in einen Extrakt aus Basalmembranen mit extrazellulärer Matrix ausgelöst wurde, adulte Stammzellen dazu anregt, sich selbst zu erneuern, zu vermehren und differenzierte Nachkommen zu bilden, die dem Darmepithel ähneln. Diese Technik, die ursprünglich für die Untersuchung von infiziertem, entzündlichem und neoplastischem Gewebe aus dem menschlichen Magen-Darm-Trakt entwickelt wurde, ist nicht nur für die Etablierung von organoiden Kulturen aus einer Vielzahl von normalem menschlichem Gewebe, sondern auch aus Tumorgewebe von Patienten verwendet worden. Diese Studien haben die Palette der verfügbaren Krebsmodelle erheblich erweitert und verbessert.

In jüngster Zeit wurden die frühen Erkenntnisse von Köpf-Maier und Kollegen, dass organoide HNSCC-Kulturen eine geeignete Plattform für die In-vitro-Prüfung von Medikamenten darstellen, durch mehrere unabhängige Studien bestätigt. Obwohl erhebliche Unterschiede in den Erfolgsraten bei der Etablierung primärer, langfristig wachsender Organoidkulturen von HNSCC-Patienten berichtet wurden (30 % gegenüber 65 %), beschrieben alle bisherigen Studien übereinstimmend, dass Organoide viele Eigenschaften des ursprünglichen Tumors beibehalten, einschließlich intratumoraler Heterogenität, Mutationsprofil und Proteinexpressionsmuster. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Organoide ihr tumorigenes Potenzial nach der Xenotransplantation beibehalten. Es wurde festgestellt, dass das Ansprechen auf eine medikamentöse Behandlung in vivo ähnlich ist wie die IC50, die aus Organoiden mit Hilfe von Tests zur Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten in vitro berechnet wurde. Wichtig ist, dass nicht nur behandlungsbedingte Wirkungen in Tumoren, sondern auch unerwünschte Therapienebenwirkungen in normalem Gewebe in Organoidmodellen untersucht werden können. So wurden beispielsweise von Patienten stammende Speicheldrüsenorganoide verwendet, um die molekularen Grundlagen der Hyposalivation, einer häufigen schweren Nebenwirkung der Bestrahlung, zu untersuchen.

In einer weiteren Studie wurden primäre 2D-Zellkulturen aus den Tumoren von HNSCC-Patienten als zusätzliches wertvolles Ex-vivo-HNSCC-Modell identifiziert. Hier wurden durch ein individualisiertes, groß angelegtes Screening von Krebstherapeutika reproduzierbar Medikamente identifiziert, die eine Antitumoraktivität in angepassten, von Patienten stammenden Xenotransplantaten (PDX) aufweisen, wodurch zusätzliche Beweise dafür erbracht wurden, dass primäre HNSCC-Kulturen zur Unterstützung der therapeutischen Entscheidungsfindung in einer klinischen Routineumgebung verwendet werden könnten.

Organoid-Kulturen von normalem, dysplastischem und malignem Zungengewebe des Menschen wurden ebenfalls zur Reproduktion der wichtigsten Schritte der Zungentumorigenese verwendet. Histomorphometrische, immunhistochemische und elektronenmikroskopische Analysen in 3D-Kokulturen von primären Keratinozyten und Fibroblasten aus der Zunge in einer Kollagenmatrix zeigten, dass das geschichtete Wachstum, die Zellproliferation und die Differenzierung zwischen den Ko-Kulturen und den jeweiligen nativen Geweben vergleichbar waren, während sie sich in Kulturen ohne Fibroblasten stark unterschieden. Diese Ergebnisse unterstützen frühere Studien, die eine wichtige Rolle der krebsassoziierten Fibroblasten in der Pathogenese von HNSCC zeigen. Diese Daten und die zahlreichen Hinweise aus der Literatur auf tumorfördernde Wirkungen der Tumormikroumgebung (TME) sprechen für den künftigen Einsatz fortschrittlicherer präklinischer Modelle, die alle wichtigen TME-Komponenten umfassen. Heutzutage gibt es neue Protokolle für die Herstellung von Organoiden, die neben Stromazellen auch Immunzellen des Patienten enthalten. Obwohl die Organoidkulturen Einschränkungen aufweisen, wie z. B. einen erheblichen Zeit- und Ressourcenaufwand und die Einbeziehung nicht definierter extrinsischer Faktoren, die das Ergebnis der Experimente beeinflussen können (Tabelle 1), könnten diese Kulturen geeignete Modelle für die Entwicklung und Optimierung künftiger Behandlungsstrategien einschließlich immunonkologischer Medikamente darstellen.

Tiermodelle

Karzinogen-induzierte Tiermodelle für Mundhöhlenkrebs

Die meisten menschlichen SCCs werden bekanntermaßen durch chronische Exposition gegenüber Karzinogenen ausgelöst. Ursprünglich scheiterten experimentelle Ansätze, orale bösartige Tumore chemisch zu induzieren, immer daran, dass die Mundschleimhaut resistenter gegen die Wirkung von Chemikalien war als die Haut. Schließlich konnte mit Hilfe von 9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracen (DMBA) erfolgreich HNSCC in der Hamsterbackentasche als Tiermodell induziert werden. Ähnlich wie bei Patienten verlief die Karzinogenese der Schleimhaut in vier aufeinander folgenden Stadien: Hyperplasie, atypische Hyperplasie, Carcinoma in situ und Plattenepithelkarzinom. Es war jedoch schwierig, zwischen Epithelveränderungen, die durch direkten Kontakt mit dem Karzinogen verursacht wurden, und einer echten prämalignen Transformation zu unterscheiden, da die Veränderungen bei den DMBA-induzierten Wangentumoren vorübergehend und reversibel waren. Darüber hinaus wiesen die DMBA-induzierten Tumore viele der histologischen Merkmale von differenziertem HNSCC nicht auf und ähnelten auch nicht den frühen menschlichen Läsionen. Noch wichtiger ist, dass der Tumor in der Wangentasche des Hamsters auftrat, die ein immunschwaches Gebiet darstellt, das beim Menschen nicht vorkommt, so dass dieses Modell das menschliche HNSCC nicht sehr gut nachahmte. Obwohl DMBA in der Folgezeit häufig in Hamster- und Rattenmodellen für Mundhöhlenkrebs eingesetzt wurde, erwies es sich als schwierig, mit DMBA in Mäusen Mundhöhlenkarzinome zu induzieren. 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO), ein wasserlösliches Chinolon-Derivat, wurde dann als potenter Auslöser von Mundtumoren eingeführt. Die Verabreichung von 4-NQO mit dem Trinkwasser oder seine topische Anwendung führte nach Langzeitbehandlung sowohl in Ratten- als auch in Mausmodellen zu zahlreichen dysplastischen, präneoplastischen und neoplastischen Läsionen, die der neoplastischen Transformation der menschlichen Mundhöhle sehr ähnlich waren. Nach mehreren Modifikationen wurde das Modell von Tang et al. standardisiert, die zeigten, dass die Verabreichung von 4-NQO im Trinkwasser von C57BL/6-Mäusen über 16 Wochen die Mundhöhlenkarzinogenese mit hoher Inzidenz fördert.

Durch die Rekapitulation der Abfolge von Ereignissen und der Art von Läsionen, die bei der menschlichen Karzinogenese zu beobachten sind, bieten die oben beschriebenen Karzinogen-induzierten Tiermodelle ein ausgezeichnetes In-vivo-System für die Untersuchung von Schlüsselereignissen der oralen Karzinogenese. Diese Modelle wurden auch in großem Umfang für die Entwicklung von Strategien zur Krebsvorbeugung verwendet, während weniger Studien diese Tiermodelle zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln zur Behandlung etablierter Tumoren genutzt haben. Eine wesentliche Einschränkung bei der Verwendung als Plattform für das Arzneimittelscreening ist die lange Zeit, die für die Bewertung der Auswirkungen einer Testverbindung benötigt wird (Tabelle 1). Die meisten Karzinogen-induzierten Tiermodelle für HNSCC benötigen bis zu 40 Wochen, um ein vollwertiges Karzinom zu entwickeln, und sogar noch länger, wenn die Metastasierung der Endpunkt der Studie ist. In diesem Zusammenhang bietet ein aktueller Bericht von Wang und Kollegen eine potenzielle Abkürzung durch die Verwendung von 4NQO-abgeleiteten Zelllinien-induzierten Zungentumor-Xenografts als alternatives, zweckmäßigeres syngenes Mausmodell.

Der Hauptvorteil des 4NQO-induzierten Tiermodells ist seine Eignung zur Untersuchung der Auswirkungen von karzinogenen und genetischen Faktoren bei der Tumorentstehung, insbesondere in einer immunkompetenten Umgebung. Es bietet somit eine geeignete Plattform, um die Entwicklung von Immuntherapien bei HNSCC zu beschleunigen. Das Modell wurde auch erfolgreich zur Untersuchung der Rolle mutmaßlicher Krebsstammzellen bei Therapieresistenz, Wiederauftreten und Metastasierung eingesetzt. Sein Potenzial für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien, die nicht nur auf die proliferative Tumormasse, sondern auch auf die relativ ruhige Subpopulation der Krebsstammzellen abzielen, ist erwiesen.

Genetisch manipulierte Mausmodelle

Während die Schädigung der DNA durch Chemikalien zufällig erfolgt, folgt der Tumorevolutionstheorie zufolge auf den zufälligen Erwerb von Mutationen im gesamten Genom die Auswahl von Klonen, die genetische Veränderungen aufweisen, die das Überleben und die Vermehrung der Zellen erleichtern. In Studien zur Erstellung von Molekularprofilen wurden mehrere mutmaßliche Treibergene identifiziert, die zur Krebsentwicklung bei HNSCC beitragen. Diese molekularen Studien lieferten jedoch keine direkten Beweise für die Kausalität oder detaillierte Einblicke in die biologischen Mechanismen, durch die diese Gene die Tumorentwicklung vorantreiben. Obwohl karzinogen induzierte Tiermodelle die heterogene Landschaft genomischer Veränderungen in menschlichen Primärtumoren gut nachbilden können, treibt nur ein Bruchteil dieser Mutationen die Tumorgenese an, indem sie Onkogene oder Tumorsuppressorgene beeinträchtigen, während viele Mutationen Passagiere sind und keinen eindeutigen Beitrag zur Tumorentwicklung leisten. Diese Studien geben auch keinen Aufschluss darüber, ob die treibenden Faktoren für die Aufrechterhaltung des Tumors unerlässlich sind, und sind daher für die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien möglicherweise nur von begrenztem Nutzen. Im Gegensatz dazu bieten präklinische Modellsysteme wie gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) einen experimentell nachvollziehbaren Ansatz, bei dem die biologischen Auswirkungen spezifischer Mutationen in einem kontrollierten genetischen Hintergrund im Detail untersucht werden können. In den folgenden Kapiteln werden die wichtigsten Ergebnisse früherer Studien auf der Grundlage von GEMMs bei HNSCC beschrieben.

Bislang wurden nur wenige GEMMs beschrieben, die mit der spontanen Entstehung von HNSCC ohne chronische Karzinogenexposition in Zusammenhang stehen (Tabelle 2). Ein gentechnisch hergestelltes Mausmodell für Mundkrebs wurde erstmals von Schreiber und Kollegen vorgestellt. Nach der Kreuzung von transgenen Mäusen mit dem v-Ha-ras-Gen mit transgenen Mäusen, die E6/E7 des humanen Papillomavirus (HPV)-16 in sich trugen, wurde die Entwicklung von Tumoren an Mund, Ohr und Auge ab einem Alter von etwa 3 Monaten beobachtet. Im Alter von 6 Monaten hatten 100 % der bi-transgenen Tiere orale Tumore entwickelt, während die Prävalenz in den beiden monotransgenen Gruppen 0 % betrug. Die Voraussetzung eines zweiten genetischen Treffers für die Tumorentstehung wurde auch für ein transgenes Modell von K-rasG12D berichtet, bei dem eine Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Keratin-14 (K14)-Promotors für das Targeting des endogenen K-ras-Lokus verwendet wurde. Im Einzeltransgen-Modell wurden nach einem Monat Tamoxifen-Behandlung nur große Papillome in der Mundhöhle und Hyperplasien in der Zunge beobachtet. Wurden jedoch Mäuse mit floxierten p53-Knockout-Mäusen gekreuzt, entwickelten 100 % der Mischmäuse bereits 2 Wochen nach der Tamoxifen-Induktion Zungenkarzinome. Neben der Expression der viralen Onkogene E6/E7 und dem Verlust von TP53 wurden die homozygote Deletion des Transkriptionsfaktors krüppel-like-factor 4 (KLF4) und die heterozygote Deletion von SMAD4 als zweite genetische Treffer identifiziert, die im Zusammenspiel mit einer onkogenen Treibermutation die orale Tumorbildung mit hoher Prävalenz fördern (Tabelle 2).

Trotz der Rekapitulation der HNSCC-Progression bleibt die Eignung der oben beschriebenen HNSCC-Modelle als Plattform für die Erforschung neuer molekularer zielgerichteter Behandlungsansätze etwas fraglich, wenn man bedenkt, dass die genetischen Veränderungen, die die Tumorentstehung in diesen Tieren antreiben, bei HNSCC-Patienten nicht oder nur selten vorkommen. Insgesamt wurden Mutationen in HRAS und KRAS nur bei 6 bzw. 0,2 % der HNSCC-Patienten und eine homozygote Deletion von KLF4 und SMAD4 bei 0 bzw. 4 % der Fälle festgestellt. Außerdem wurden in der HNSCC-Kohorte des The Cancer Genome Atlas (TCGA) keine Fälle identifiziert, die einen der zusammengesetzten tumoranfälligen Genotypen der oben beschriebenen GEMMs aufwiesen. Ein GEMM von spontanem HNSCC, das den molekularen Merkmalen der menschlichen Erkrankung näher kommt, könnte das von Bornstein und Kollegen beschriebene Single-Gen-Knockout-Modell von SMAD4 in Kopf-Hals-Epithelien (HN-Smad4del/del) sein. Obwohl eine homozygote Deletion selten ist, wird ein heterozygoter Verlust von SMAD4 in 30-35 % der primären HNSCCs festgestellt, der mit einer Herabregulierung der Smad4-Expression einhergeht. In jüngster Zeit wurde über eine signifikante intratumorale Heterogenität des SMAD4-Verlusts in primären HNSCC-Tumoren berichtet. Interessanterweise übertraf in Ex-vivo-Kulturen aus PDX die Zellsubpopulation mit heterozygotem SMAD4-Verlust durch Deletion oder reduzierte Expression die Zellen mit Wildtyp-SMAD4-Genotyp aus dem Elterntumor, was auf einen Überlebensvorteil von Smad4-defizienten Zellen schließen lässt. Zur weiteren Unterstützung der Eignung dieser Single-Knockout-GEMM wiesen HNSCC aus HN-Smad4del/del-Mäusen eine erhöhte genomische Instabilität auf, die mit einer herunterregulierten Expression und Funktion von Genen korrelierte, die für Proteine im Fanconi-Anämie/BRCA-DNA-Reparaturweg kodieren, der auch mit der Anfälligkeit für HNSCC beim Menschen verbunden ist. Darüber hinaus wiesen sowohl normales Kopf- und Halsgewebe als auch HNSCC von HN-Smad4del/del-Mäusen schwere Entzündungen auf, die auch mit der Pathogenese beim Menschen in Verbindung gebracht wurden, wo orale Bakterien und Entzündungsmediatoren, die mit Parodontalerkrankungen in Verbindung gebracht werden, Kofaktoren bei der Entstehung und Förderung von oralem SCC sein können.

Seit dem ursprünglichen Bericht im Jahr 2009 wurde das HN-Smad4del/del-Modell zur detaillierten Analyse der molekularen Prozesse verwendet, die an der HNSCC-Tumorgenese beteiligt sind. Unseres Wissens nach wurde es jedoch noch nicht für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien genutzt. Diese Zurückhaltung könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Tumorentwicklung in diesem Modell im Median erst nach 40 Wochen einsetzt, eine Einschränkung, die mit der von Karzinogenen induzierten Tiermodellen für Mundkrebs vergleichbar ist (Tabelle 2). Die Integration einer Karzinogenbehandlung zur Beschleunigung der Tumorbildung in GEMMs mit nur einem Gen könnte daher ein geeigneter Weg sein, um diese Einschränkung zu überwinden, wie bereits erfolgreich in Studien mit GEMMs gezeigt wurde, die eine Deletion in einem Tumorsuppressorgen (GRHL3 , PTEN ) aufweisen oder onkogene microRNAs überexprimieren (Tabelle 1).

Patient-derived xenograft models

Die Entwicklung und Verbesserung schwer immundefizienter Mäusestämme hat die Verfügbarkeit von PDX-Modellen für die Krebsforschung deutlich erhöht. Mehrere Forschergruppen haben über die erfolgreiche Etablierung von PDX-Modellen für HNSCC berichtet. In unserer eigenen Serie wurde eine Gesamttransplantationsrate von 48 % beobachtet, wobei die Transplantationsraten zwischen verschiedenen Patientenuntergruppen stark zu variieren schienen. Die Faktoren, die die Transplantationsrate einschränken, sind noch nicht eindeutig geklärt. Der Ort der Implantation und die Mausstämme scheinen die Transplantationsrate zu beeinflussen. Darüber hinaus sind pathologische Risikofaktoren wie Tumorhistologie und HPV-Status wichtige Determinanten für die PDX-Bildung. Im Allgemeinen ist es wahrscheinlicher, dass undifferenzierte HPV-negative Tumore, die ein aggressives Wachstum aufweisen, transplantiert werden. Dementsprechend wurden die Rate und die Kinetik der PDX-Transplantation mit einer ungünstigen Prognose der Patienten in Verbindung gebracht. Im Gegensatz zu HPV-negativen Tumoren gelingt es bei HPV-assoziierten HNSCC-Tumoren häufig nicht, zu transplantieren. Da diese Tumoren an immunassoziierten Stellen wie den Mandeln oder dem Zungengrund wachsen, birgt ihre Transplantation in immundefiziente Mäuse, die keine immunologische Kontrolle über virusinfizierte Zellen haben, das Risiko eines Co-Transfers von Epstein-Barr-Virus (EBV) positiven B-Zellen. Infolgedessen kommt es häufig zu einer unkontrollierten Vermehrung der B-Zellen und ihrer Umwandlung in EBV-positive Lymphome. Da die Proliferationsrate dieser künstlichen Lymphome viel höher ist als die Tumorzellproliferation in transplantierten Gewebefragmenten von SCC, werden die ursprünglichen Tumortransplantate häufig überwuchert. Daher ist eine histopathologische Validierung von PDX durch einen zertifizierten Pathologen unerlässlich, um die Plattenepithelkarzinom-Histologie des Modells zu bestätigen.

Die Frage, wie gut PDX dem primären Patiententumor ähneln, wurde von vielen Gruppen untersucht. Wie für andere Tumorentitäten gezeigt wurde, zeigen etablierte HNSCC-Modelle in Mäusen histopathologische Merkmale wie der ursprüngliche Patiententumor. Umfassende genetische Analysen von Primärtumoren und abgeleiteten PDX-Modellen mittels Next Generation Sequencing ergaben ähnliche Muster und Allelhäufigkeiten von molekularen Aberrationen. Die Korrelation zwischen den Mutationsprofilen von Originaltumoren und abgeleiteten Modellen war bei PDX (R = 0,94) deutlich höher als bei Zelllinien (R = 0,51). Auch die Methylomanalyse zeigte eine hohe Übereinstimmung zwischen PDX und Patiententumoren. Tatsächlich wurden im Durchschnitt nur 2,7 % der untersuchten CpG-Stellen durch die Transplantation von Tumoren in Mäuse stark methyliert. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsstudien die generelle Verwandtschaft der elterlichen Tumoren mit ihren PDX, was durch ihre gemeinsame Gruppierung in einer unüberwachten hierarchischen Clusteranalyse bestätigt wurde. Im Gegensatz zu den zunehmenden Belegen für die Übereinstimmung von Genom- und Transkriptom-Profilen zwischen PDX und primären HNSCCs gibt es nur wenige Daten zur Proteinexpression. Eine erste vorläufige Analyse von PDX-Gewebe unter Verwendung eines Reverse-Phase-Protein-Arrays (RPPA) ergab Proteinprofile, die mit den TCGA-HNSCC-Proteinexpressionsdaten vergleichbar sind, was auf eine Ähnlichkeit zwischen dem ursprünglichen Gewebe und dem abgeleiteten Modell auch auf dieser Ebene hindeutet.

Ein wesentliches Merkmal von PDX ist die Erhaltung eines stromalen Kompartiments. Auch wenn das humane Stroma innerhalb der ersten Passagen durch das Stroma der Maus ersetzt wird, bleibt ein integriertes Stroma erhalten, was die Evaluierung von Wirkstoffen, die auf dieses Kompartiment abzielen, oder den Crosstalk zwischen Stromakompartiment und Tumorzellen ermöglicht. Darüber hinaus bilden in Mäusen gezüchtete Tumoren ihr eigenes Tumorgefäßsystem aus, was die Möglichkeit bietet, das angiogene Netzwerk und die Interferenz mit auf die Angiogenese abzielenden Substanzen zu untersuchen. Nach der Etablierung des Modells können die in Mäusen gezüchteten Tumoren entnommen, tiefgefroren und bei Bedarf aufgetaut und in Mäuse zurücktransplantiert werden. Insgesamt kann PDX als geeignete Methode für die Expansion von Tumorgewebe und als vielversprechendes präklinisches Modellsystem für mechanistische Studien und die Entwicklung therapeutischer Strategien betrachtet werden.

Mit dem jüngsten Aufkommen der Immuntherapie im Behandlungsalgorithmus vieler Krebsarten, einschließlich HNSCC, ist das Fehlen einer funktionellen Immunumgebung in PDX zu einem großen Hindernis geworden, das es zu überwinden gilt. Es wurden verschiedene Strategien vorgeschlagen, um ein Immunsystem in immundefizienten Mäusen zu implementieren. In der bahnbrechenden Studie von Mosier und Kollegen wurde gezeigt, dass die Injektion humaner peripherer mononukleärer Zellen (PBMCs) in Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) zur stabilen langfristigen Rekonstitution eines funktionellen menschlichen Immunsystems führte. So konnten durch den Transfer von PBMCs des Patienten in PDX-tragende Mäuse immundefiziente PDX-Modelle erzeugt werden. Allerdings fehlt es bei diesem Ansatz an einer ordnungsgemäßen Entwicklung der Immunzellen und an einem T-Zell-Priming, was dazu führt, dass bestimmte Linien menschlicher Immunzellen in den Mäusen nicht vorhanden sind. Anspruchsvollere Immunrekonstitutionsprotokolle, die in der Folge entwickelt wurden, basieren auf dem Transfer von humanen CD34+-Stammzellen in NSG-Mäuse sowie auf der Implantation von humanem fötalem Thymus- und Lebergewebe unter die Nierenkapsel dieser Mäuse. Dieser Ansatz führte zu einer langfristigen Transplantation und systemischen Rekonstitution eines vollständigen menschlichen Immunsystems, einschließlich menschlicher Immunzellen mit mehreren Zelllinien, bestehend aus T-, B-, NK-, dendritischen Zellen und Makrophagen. Leider ist diese Methode aufgrund der Komplexität des Modells für eine große Zahl von PDX nicht praktikabel. Ein vielversprechenderes Verfahren wurde für das Melanom vorgeschlagen, bei dem tumorinfiltrierende T-Lymphozyten (TILs), die aus dem für die PDX-Generierung verwendeten Tumorgewebe isoliert wurden, in vitro durch humanes Interleukin 2 (IL2) expandiert wurden, bevor sie in tumortragende PDX-Mäuse injiziert wurden.

Das Potenzial von PDX-Modellen zur Steuerung der Patientenbehandlung

Der Wert von PDX zur Steuerung individueller Patientenbehandlungsentscheidungen ist noch zu klären. Im Allgemeinen wurden Patienten-PDX-Korrelationen bei verschiedenen Tumorentitäten, bei denen das Ansprechen auf die Behandlung zwischen Mäusen und Patienten verglichen wurde, anhand retrospektiver Daten zum klinischen Ergebnis durchgeführt. Unseres Wissens wurden bei HNSCC noch keine derartigen Vergleiche mit ausreichend großen Stichproben durchgeführt. Hindernisse für die Zweckmäßigkeit solcher Ansätze sind die Medikamentendosierung bei Mäusen, die in der Regel die maximal tolerierte Dosis widerspiegelt, die Dosisvariabilität innerhalb verschiedener Mäusestämme und insbesondere die Definition eines klinisch sinnvollen Endpunkts. Im klinischen Umfeld wird das Ansprechen des Tumors nach RECIST bestimmt. Bei Mäusen wurde eine sehr heterogene Reihe möglicher Endpunkte verwendet, um die Wirksamkeit von Behandlungen mit Einzelwirkstoffen zu bestimmen, einschließlich der Tumorregression, ausgedrückt als relative Wachstumshemmung, des Tumorvolumens im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, der Tumorwachstumshemmung und der Zeit bis zum Endpunkt. Weitere allgemeine Einschränkungen des Modells sind die hohen Kosten der PDX-Erstellung, die unterschiedlichen Transplantationsraten und die Zeitspanne zwischen der ersten Transplantation und den Ergebnissen des Behandlungsscreenings. Bisher konnten wir in unserer großen Sammlung von fast 80 HNSCC-PDX-Modellen keinen prädiktiven Wert für arzneimittelspezifische Tumorreaktionen im Xenograft-Modell ermitteln. Dennoch werben mehrere Unternehmen für PDX als Instrument zur Vorhersage des Therapieansprechens. Im Jahr 2016 startete Champions Oncology eine Machbarkeitsstudie (NCT02752932), um den prädiktiven Wert von PDX zu untersuchen. Leider wurden bisher keine Ergebnisse veröffentlicht.

Der Hauptnachteil von PDX ist die im Vergleich zu Organoiden längere Zeit, die für die Etablierung und Expansion des Modells benötigt wird, was ihre künftige Verwendung als individuelle Wirkstoffscreening-Plattform in der klinischen Routine weniger wahrscheinlich macht. Darüber hinaus sollte die Rekonstitution mit vom Patienten stammenden TME-Komponenten, die in den beiden mit den derzeitigen Protokollen erzeugten Modellen fehlen, in Organoiden viel einfacher zu erreichen sein als in Xenotransplantat-Mausmodellen. Dies wird die Einbeziehung von Krebstherapien, die das TME beeinflussen (z. B. Everolimus, Bevacizumab, Anti-PD-1/PD-1 L-Antikörper), in künftige Ex-vivo-Screening-Ansätze ermöglichen.