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RTT-Fibroblasten zeigen eine defekte Autophagie-Aktivierung unter Hungerbedingungen

Um die Hypothese einer defekten Autophagie bei RTT-Patienten zu überprüfen, analysierten wir die Autophagieaktivierung unter Hungerbedingungen in primären Hautfibroblasten, die von RTT-Patienten (n = 4) und gesunden Probanden (n = 4) isoliert wurden17,19.

Wir bestimmten zunächst die Lebensfähigkeit von gesunden und RTT-Fibroblasten, die in Hungermedium kultiviert wurden, durch MTT- und Trypanblau-Ausschlusstests. Im Vergleich zur Lebensfähigkeit von RTT-Fibroblasten, die in Standardmedium kultiviert wurden, nahm die Lebensfähigkeit von RTT-Fibroblasten nach 4 Stunden Hunger ab (20 ± 3,3 % der absterbenden Zellen, p < 0,05); dieser Prozentsatz stieg nach 6-8 Stunden Hunger erheblich an (60 ± 5,1 % der absterbenden Zellen, p < 0,05) (Abb. 1a). Umgekehrt waren gesunde Fibroblasten nach 4 Stunden Hungern noch voll lebensfähig, wobei die Lebensfähigkeit nach 6-8 Stunden nur sehr geringfügig abnahm (10 ± 1,2 % der absterbenden Zellen, p < 0,01), verglichen mit der Lebensfähigkeit von Fibroblasten, die in Standardmedium gewachsen waren (Abb. 1a). Ein direkter Vergleich der Lebensfähigkeit der beiden Zelllinien zu den einzelnen Zeitpunkten ergab, dass die Lebensfähigkeit der RTT-Fibroblasten ab 4 Stunden stark beeinträchtigt war (siehe Einzelheiten in den Legenden zur Abbildung, p < 0,05). Darüber hinaus zeigte eine Western Blotting (WB)-Analyse, dass in RTT-Fibroblasten, die 4 Stunden lang ausgehungert worden waren, eine Bande, die dem p25-Fragment der Poly (ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP) entspricht, im Vergleich zur schwachen Detektion zum Zeitpunkt 0 stark erhöht war (96 ± 4 %, p < 0,001). Dieses Fragment wird durch den Caspase-abhängigen Abbau des Proteins während der frühen Phase der Apoptoseinduktion freigesetzt (Abb. 1b)35. Das p25-Fragment war in den gesunden Fibroblasten unter den gleichen Versuchsbedingungen fast nicht nachweisbar.

Diese Daten bestätigten, dass RTT-Fibroblasten kein Wachstum in einem hungernden Medium tolerieren und schnell apoptotisch werden. Daher haben wir den autophagischen Fluss weiter untersucht, indem wir die LC3B-II-Marker-Clearance in Anwesenheit und in Abwesenheit eines Lysosomen-Inhibitors wie Chloroquin (CQ) überwacht haben24,25,26,27,28,29,30.

Nachdem eine zytotoxische Wirkung von CQ ausgeschlossen wurde (ergänzende Abb. S1), wurden gesunde und RTT-Fibroblasten entweder in Ruhe- oder in Hungermedien für 2 h in An- oder Abwesenheit von 20 µM CQ kultiviert, um das LC3B-II/GAPDH-Verhältnis mittels WB zu quantifizieren (Abb. 2a). Das Muster des LC3B-II/GAPDH-Verhältnisses (oder einer anderen internen Kontrolle, die nicht durch Autophagie moduliert wird) unter Bedingungen der Autophagie-Aktivierung und in Gegenwart und Abwesenheit von CQ (oder eines anderen lysosomalen Inhibitors) wird als gültige Strategie zur Überwachung des Autophagie-Flusses betrachtet.

In gesunden Fibroblasten, die in Standardmedium kultiviert wurden, war LC3B-I deutlich immunologisch nachweisbar, während LC3B-II schwach war. Das LC3B-II/GAPDH-Verhältnis gesunder Fibroblasten, die in Standardmedium in Abwesenheit und in Anwesenheit von CQ kultiviert wurden, war vergleichbar (Abb. 2a, linkes Feld). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die basale Autophagie in den gesunden Fibroblasten fast nicht nachweisbar war (Abb. 2a, linkes Feld).

Wenn diese Zellen im Hungermedium und in Abwesenheit von CQ für 2 h kultiviert wurden, stieg das LC3B-II/GAPDH-Verhältnis (60 ± 4.8%, p < 0,05) im Vergleich zu gesunden Fibroblasten, die im Standardmedium in Abwesenheit oder Anwesenheit von CQ (das, wie bereits erwähnt, identisch war) kultiviert wurden (Abb. 2a, linke und rechte Tafel). Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass LC3-I tatsächlich lipidiert wurde, um LC3B-II zu bilden, das ein früher Marker für die Aktivierung der Autophagie ist24,25,26,27,28,29,30. Um das Vorhandensein dieser Autophagie-Aktivierung zu testen, kultivierten wir die Zellen 2 Stunden lang in einem Hungermedium in Gegenwart von CQ, und sie zeigten einen weiteren Anstieg des LC3B-II/GAPDH-Verhältnisses (94 ± 5,5 %, p < 0,001) im Vergleich zu gesunden Fibroblasten, die in Standardmedium kultiviert wurden (Abb. 2a, linkes und rechtes Feld).

Außerdem war der Unterschied zwischen dem LC3B-II/GAPDH-Verhältnis gesunder Fibroblasten, die in Abwesenheit und in Anwesenheit von CQ in Hungermedium gezüchtet wurden, statistisch signifikant (p < 0,05, Abb. 2a, linkes Feld). 2a, linkes Feld)

Das Gesamtergebnis deutet also gemäß der Standardinterpretation des LC3B-II-Musters durch WB-Analyse darauf hin, dass gesunde Fibroblasten in Abwesenheit von Nährstoffen die Bildung von Autophagosomen anregen, die sich in Gegenwart von CQ anreichern. Dieses Verhalten ist mit einem normalen Autophagie-Fluss vereinbar24,25,26,27,28,29,30. Interessanterweise wurde bei RTT-Fibroblasten, die in Standardmedium gezüchtet wurden, LC3B-I eindeutig immunologisch nachgewiesen, während LC3B-II sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von CQ sehr schwach war (Abb. 2a, linkes Feld). Unter Hungerbedingungen und in Abwesenheit von CQ deutete das Auftreten einer schwachen Bande, die LC3B-II entspricht, in RTT-Fibroblasten erst nach langer Exposition des Filters darauf hin, dass zumindest eine minimale Lipidierung von LC3B-I stattgefunden hat (Abb. 2a, linkes Feld). Daher war das LC3B-II/GAPDH-Verhältnis zwischen RTT-Fibroblasten, die in Hungermedium in Abwesenheit von CQ wuchsen, erhöht (93 ± 5,5 %, p < 0,001) im Vergleich zu dem von RTT-Fibroblasten, die in Standardmedium in Abwesenheit von CQ wuchsen (Abb. 2a, rechte Tafel).

Die Verabreichung von CQ an RTT-Fibroblasten, die in Hungermedium gezüchtet wurden, führte jedoch nicht zu einer weiteren Erhöhung des LC3B-II/GAPDH-Verhältnisses, das im Vergleich zu Zellen, die in Standardmedium in Abwesenheit von CQ gezüchtet wurden, zwar erhöht war (95 ± 3,5 %, p < 0,001), aber nicht signifikant erhöht war in Bezug auf das LC3B-II/GAPDH-Verhältnis von RTT-Fibroblasten, die in Hungermedium in Abwesenheit von CQ gezüchtet wurden (Abb. 2a, linkes Feld). Dieser Befund deutet darauf hin, dass in RTT-Zellen keine Anhäufung von Autophagosomen auftritt, und die WB-Analyse spricht für eine gewisse Blockierung des Autophagieflusses24,25,26,27,28,29,30,31.

Um unsere Hypothese eines möglichen defekten Autophagieflusses weiter zu untermauern, haben wir den Abbau von zwei anerkannten Autophagie-Reportersubstraten in gesunden und RTT-Fibroblasten überprüft, die 2 und 4 Stunden lang in Abwesenheit von CQ ausgehungert wurden, nämlich: (i) das p62/SQSMT1-Protein, das den Abbau von polyubiquitinierten Proteinaggregaten unterstützt und selbst durch lysosomale Hydrolasen36 abgebaut wird; (ii) das 20 S-Proteasom, das unter Hungerbedingungen schnell abgebaut wird37,38. In Bezug auf das Basalniveau der beiden Proteine (d.h. Zeitpunkt 0) wurde in gesunden Fibroblasten eine Abnahme des Verhältnisses p62/Tubulin (44 ± 10 % nach 4 h, p < 0,001) und des Verhältnisses PSMA-3/GAPDH (d.h. die α7-Untereinheit des 20 S-Proteasoms) (45 ± 3,1 % nach 2 h, 11 ± 5,2 % nach 4 h, in beiden Fällen p < 0,001) beobachtet (Abb. 2b, oberes Feld).

Im Falle der RTT-Fibroblasten war die Abnahme des p62/Tubulin-Verhältnisses im Laufe der Zeit selbst nach 4 Stunden nicht statistisch signifikant (89 ± 9 %), während die Abnahme des PSMA3/GAPDH-Verhältnisses nach 2 Stunden (81 ± 4,4 %, p < 0,05) und nach 4 Stunden (78 ± 5,1 %, p < 0,05) signifikant unterschiedlich war, wenn man sie mit dem Basalwert des Proteins (d. h. Zeitpunkt 0) verglich (Abb. 2b, untere Tafel). Allerdings waren die Unterschiede zwischen den gesunden und den RTT-Gruppen im Falle des p62/Tubulin-Verhältnisses nur nach 4 Stunden statistisch signifikant (p < 0,05), während das PSMA3/GAPDH-Verhältnis sowohl nach 2 Stunden (p < 0,05) als auch nach 4 Stunden (p < 0,05) signifikant zwischen den Versuchsgruppen unterschiedlich war.05) und 4 h (p < 0,001) signifikant unterschiedlich war (Abb. 2b, unteres Feld).

Interessanterweise waren die β-Tubulin- und GAPDH-Muster, die als interne Kontrollen für die p62-Färbung bzw. die PSMA3-Färbung verwendet wurden, in gesunden Fibroblasten während der 4-stündigen Hungersnot unverändert. Die Intensität der β-Tubulin-Bande sowie der GAPDH-Bande nahm jedoch in RTT-Fibroblasten, die 4 Stunden lang ausgehungert wurden, deutlich ab, verglichen mit dem, was zum Zeitpunkt 0 oder 2 Stunden lang für diese Zellen beobachtet wurde (Abb. 2b, oberes Feld). Dieser Rückgang war wahrscheinlich auf die geringere Anzahl lebender RTT-Fibroblasten zurückzuführen, die zu diesem Zeitpunkt geerntet wurden (in Übereinstimmung mit der in Abb. 1a berichteten schlechten Lebensfähigkeit von RTT-Fibroblasten nach 4 Stunden Hungern), und nicht auf eine Herabregulierung von β-Tubulin über die Zeit. Insgesamt wurde festgestellt, dass RTT-Fibroblasten diese Autophagie-Reportersubstrate nicht effizient abbauten, was die Hypothese einer defekten Autophagie stützt.

Um die Merkmale dieser Blockade näher zu beleuchten, führten wir eine Immunfluoreszenzanalyse mit dem LC3B-Antikörper durch. Wir analysierten gesunde und RTT-Fibroblasten, die in Standardmedium in Abwesenheit von CQ (Ruhezustand) und im Hungermedium für 2 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 µM CQ gewachsen waren (Abb. 2c). In Übereinstimmung mit der langsamen Stoffwechselrate der primären Zellen stellten wir fest, dass ruhende gesunde und RTT-Fibroblasten eine schwache und diffuse LC3B+-Färbung mit einem geringen Prozentsatz von Zellen zeigten, die mehr als 10 Punkte (d. h. Autophagosomen) aufwiesen (8 ± 5 % bzw. 1 ± 0,5 %), was darauf hindeutet, dass die basale Autophagie in Übereinstimmung mit den in Abb. 2a berichteten Daten durch Immunfluoreszenz kaum nachweisbar war. 2a.

Im Vergleich zu Zellen, die in Standardmedium gewachsen waren, war der Prozentsatz gesunder Fibroblasten, die in Hungermedium (in Abwesenheit von CQ) gewachsen waren und mindestens 10 LC3B+ Autophagosomen aufwiesen, deutlich erhöht (82 ± 10%, p < 0,005), während RTT-Fibroblasten, die in Hungermedium gewachsen waren, einen leichten Anstieg zeigten (17 ± 8%, p < 0,001). Tatsächlich war der Prozentsatz gesunder Fibroblasten, die in Hungermedium wuchsen und mindestens 10 Autophagosomen aufwiesen, signifikant höher als der von RTT-Fibroblasten, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen wuchsen (p < 0,005). Die Autophagosomen waren hauptsächlich in der perinukleären Region lokalisiert. In Anwesenheit von CQ wurde außerdem die erwartete diffuse und intensive LC3B+-Färbung beobachtet, auch wenn in diesem Fall die diffuse Färbung eine genaue Quantifizierung der Anzahl der Punkte nicht zuließ.

Die Verabreichung von CQ war in RTT-Fibroblasten unwirksam, was eindeutig auf eine stark beeinträchtigte Autophagosomen-Biogenese hinweist (Abb. 2c).

Angesichts der Relevanz der vermuteten Beeinträchtigung der Autophagosomen-Biogenese wurde ein zusätzlicher Ansatz gewählt, um diese Beobachtung zu bestätigen. Sowohl gesunde als auch RTT-Fibroblasten, die 2 Stunden lang in Abwesenheit von CQ ausgehungert wurden, wurden mit einem spezifischen Farbstoff (Cyto-ID) für die autophagosomale Membran angefärbt und mittels Immunfluoreszenz analysiert. Auch in diesem Fall wurden in gesunden Fibroblasten tatsächlich mehrere Autophagosomen nachgewiesen, während in RTT-Fibroblasten nur eine begrenzte Anzahl kleiner und isolierter Vesikel beobachtet wurde (ergänzende Abb. S2). Der Unterschied im Prozentsatz der Zellen mit mindestens 5 Cyto-ID-positiven Punkten zwischen gesunden und RTT-Fibroblasten war deutlich signifikant (80 ± 4 % bzw. 8 ± 6 %, p < 0,001). Daher lieferte die Gesamtanalyse Beweise dafür, dass in primären RTT-Fibroblasten eine defekte Autophagosomen-Biogenese auftritt.

Reife Erythrozyten von RTT-Patienten, die die R255X MeCP2-Mutation tragen, behalten Mitochondrien

Als nächstes wollten wir feststellen, ob bei RTT-Patienten ex vivo zusätzliche Anzeichen für eine gestörte Autophagie beobachtet werden können. Da die Beseitigung von Mitochondrien ein klassischer Autophagie-Mechanismus ist, der in zirkulierenden Retikulozyten in der letzten Phase der Reifung zu Erythrozyten32,33,34 stattfindet, haben wir unsere Untersuchung auch auf ex vivo menschliche Erythrozyten ausgedehnt, um zu prüfen, ob Mitochondrien in diesen Zellen zurückgehalten werden.

Daher wurden Erythrozyten von RTT-Patienten (n = 15) und von gesunden Spendern (n = 11) mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert. Die TEM-Untersuchung zeigte das Vorhandensein von Strukturen, die Mitochondrien (SRM) ähneln, in bikonkav geformten Erythrozyten, die von der Mehrheit der RTT-Patienten (11 von 15) isoliert wurden. Unter diesen 11 RTT-Patienten wiesen drei von ihnen die schwersten Symptome und auch eine hohe Häufigkeit von Erythrozyten auf (20 ± 4 %) (Abb. 3a-h). Wie erwartet, waren SRM in gesunden Erythrozyten nicht nachweisbar (Abb. 3I). Die Unterschiede zwischen gesunden und RTT-Patienten waren statistisch signifikant (p < 0,0004; Abb. 3, unteres Feld).

Der Schweregrad der Symptome basierte jedoch auf der klinischen Beurteilung, und dementsprechend trugen die drei Patienten mit den schwersten Symptomen alle die R255X-Mutation des MeCP2-Gens, die mit einer schweren Prognose verbunden ist39.

Infolgedessen und in Anbetracht der Tatsache, dass wir keine Möglichkeit hatten, eine größere Anzahl von Patienten mit anderen Mutationen zu erfassen, die eine geringe oder gar keine Häufigkeit von mitochondrienhaltigen Erythrozyten aufweisen, konzentrierten wir unsere Aufmerksamkeit auf die Analyse dieser drei Patienten. Die TEM-Analyse dokumentierte in den drei oben genannten Fällen das Vorhandensein von Strukturen, die intakten oder teilweise verdauten Mitochondrien ähnelten (entweder elektronendicht oder durchscheinend), die normal oder hantelförmig (länglich) und im Allgemeinen klein mit schwachen Cristae waren (Abb. 3a-h). Größe und Gesamtform dieser Strukturen stimmen mit denen von Mitochondrien überein, die in reifen Erythrozyten in nicht-RTT-Mausmodellen mit defekter Makroautophagie (z. B. Ulk1-/–Mäuse) oder Mitophagie (z. B. Nix-/–Mäuse) enthalten sind, wie von anderen Autoren berichtet wurde32,33. Interessanterweise wurden die von uns beobachteten morphologischen Veränderungen der Mitochondrien, wie z. B. die reduzierte Größe, die verlängerte (d. h. hantelförmige) Struktur und insbesondere das Vorhandensein schwacher Kristae, bereits im Muskel und im Kleinhirn von RTT-Patienten beschrieben20,21. Um die mitochondriale Identität des SRM zu bestätigen, färbten wir Erythrozyten von gesunden Spendern und diesen RTT-Patienten mit schweren Symptomen mit einem Anti-COX-IV (Cytochrom-c-Oxidase)-Antikörper. Eine statistisch signifikante Anzahl von Erythrozyten der drei RTT-Patienten zeigte im Vergleich zu Erythrozyten gesunder Probanden (35 ± 5 % bzw. 0,2 ± 0,01 %, p < 0,005) ein COX-IV+ gepunktetes Muster, das auf eine Mitochondrienretention hindeutet (Abb. 4). Der durchschnittliche Gehalt an Mitochondrien pro Zelle wurde mit 1,2 ± 0,2 Organellen pro Erythrozyten bei RTT-Patienten und 0,002 ± 0,0002 bei gesunden Probanden berechnet (p < 0,005) (Abb. 4). Die Unterschiede im prozentualen Anteil der Erythrozyten mit Mitochondrien zwischen TEM- und IF-Untersuchungen lassen sich darauf zurückführen, dass die Möglichkeit, die Organellen mittels TEM nachzuweisen, strikt vom Dünnschnitt der Zelle abhängt, der ihr Vorhandensein behindern kann, während der IF-Ansatz nicht auf diese Weise eingeschränkt ist.

Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen, führten wir eine zytofluorimetrische Analyse der Erythrozyten sowohl der gesunden Probanden als auch der drei RTT-Patienten durch, wobei wir einen Anti-CD71 (Transferrin-Rezeptor) und Anti-COX-IV-Antikörper verwendeten. Die Häufigkeit der CD71-Positivität, ein Marker für unreife Erythrozyten, war bei Gesunden und RTT-Patienten nicht signifikant unterschiedlich (1,34 ± 0,13 % gegenüber 1,03 ± 0,3 %; ergänzende Abb. S3). Es ist hervorzuheben, dass die in die Studie einbezogenen RTT-Patienten normale hämatologische Parameter aufwiesen, und obwohl der Retikulozytenindex zumindest bei einigen Probanden niedriger war als bei gesunden Probanden, waren die Unterschiede zwischen den beiden Patientengruppen insgesamt nicht statistisch signifikant (Tabelle 1). Umgekehrt wurde in gesunden Erythrozyten eine sehr schwache COX-IV+-Population beobachtet, während in RTT-Erythrozyten eine höhere Häufigkeit von COX-IV+-Zellen festgestellt wurde (0,056 ± 0,004 % gegenüber 1,15 ± 0,19 %, p < 0,01). Diese Ergebnisse wurden durch die Färbung mit Mitotracker Green (MT) weiter bestätigt (ergänzende Abb. S3), die eine Zunahme von MT+ Erythrozyten bei einem RTT-Patienten (mit der R255X MeCP2-Mutation) gegenüber einem gesunden Patienten (0,37% vs. 0,16%) dokumentierte, ähnlich wie sie mit dem zuvor beschriebenen COX-IV-Antikörper beobachtet wurde.

Um die Identität von SRM weiter zu validieren, wurde eine gleiche Anzahl von Erythrozyten lysiert und mittels WB unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Filter wurden mit Antikörpern gegen Sirtuin-3 angefärbt, eine Deacetylase, die spezifisch in der mitochondrialen Matrix exprimiert wird40. Sirtuin3 wurde bei diesem Ansatz als mitochondrialer Marker gewählt, da sich sein Molekulargewicht im Gegensatz zu COX-IV und anderen mitochondrialen Markern nicht mit dem von Hämoglobinketten oder Hämoglobinoligomeren im elektrophoretischen Muster überschneidet. Bei den drei untersuchten RTT-Patienten wurde bei jedem Patienten ein statistisch signifikanter Anstieg des Verhältnisses von Sirtuin-3 zu GAPDH im Vergleich zu demselben Verhältnis in Lysaten von gesunden Erythrozyten beobachtet (p < 0. 001) (ergänzende Abb. S4).

Diese drei Patienten, die alle die MeCP2-Mutation (d. h. R255X) tragen, zeigten den schlimmsten Phänotyp mit einem sehr hohen Prozentsatz von Erythrozyten, die mindestens ein Mitochondrium aufwiesen. Aufgrund der sehr begrenzten Anzahl von Patienten, die uns zur Verfügung standen, war es jedoch schwierig, eine statistisch signifikante Schlussfolgerung hinsichtlich eines möglichen Zusammenhangs zwischen der Schwere der Erkrankung und dem Ausmaß der Mitochondrienretention in den reifen Erythrozyten zu ziehen. Ein weiterer Punkt, der erwähnenswert erscheint, ist, dass die Retention von Mitochondrien in reifen Erythrozyten in den zuvor zitierten Ulk1-/- und Nix-/–Mausmodellen zu Anämie oder anderen Blutpathologien führte, die wahrscheinlich durch die verstärkte Clearance dieser abnormalen Erythrozyten durch Milzmakrophagen bestimmt wurden32,33. Bei den RTT-Patienten, die an dieser Studie teilnahmen, wurde nur ein sehr begrenzter und statistisch nicht signifikanter Rückgang der hämatologischen Werte festgestellt, und sie schienen weder anämisch zu sein noch an anderen Blutkrankheiten zu leiden. Die Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen und denen der Mausmodelle könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass der Knockdown von Makroautophagie- oder Mitophagie-Genen (d. h. Ulk1-/- bzw. Nix-/- Mäuse) einen sehr hohen Prozentsatz an mitochondrienhaltigen Erythrozyten und den Verbleib mehrerer Organellen in den Erythrozyten zur Folge hat, was einen wesentlich schwerwiegenderen Defekt darstellt als der bei RTT-Patienten dokumentierte32,33. Obwohl wir bei Patienten, die die R255X-Mutation tragen, eine signifikant hohe Anzahl von mitochondrienhaltigen Erythrozyten beobachteten (Abb. 4), war die Anzahl der Organellen in jeder Zelle in RTT-Erythrozyten sehr gering (Abb. 4). Dies reicht möglicherweise nicht aus, um größere morphologische und funktionelle Veränderungen in den Erythrozyten hervorzurufen. Obwohl die mitochondriale Retention in den Erythrozyten zumindest ein Faktor sein könnte, der das in den RTT-Erythrozyten beobachtete schwere Redox-Ungleichgewicht in Verbindung mit einer signifikanten Veränderung des Energiezustands und des Stoffwechsels (d. h., ATP/ADP und NADH/NAD-Verhältnis), berichten neuere Studien, dass die Kinetik der Sauerstoffbindung an Hämoglobin und der Sauerstoffdiffusion fast mit der von gesunden Patienten übereinstimmt16,17,23,41.

Die offensichtliche Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen und denen aus Mausmodellen könnte auch eine Erklärung in der Tatsache finden, dass das RTT-Syndrom eine X-chromosomale Störung ist, die fast ausschließlich das weibliche Geschlecht betrifft, und die Inaktivierung einer der beiden Kopien des X-Chromosoms (XCI) ein zufälliges Phänomen ist, das während der Embryogenese auftritt, wie allgemein dokumentiert ist42,43. Im Falle des RTT-Syndroms würde die zufällige XCI in somatischen Zellen also voraussichtlich zu einem Mosaizismus führen, bei dem die Hälfte der Zellen das Wildtyp-Allel exprimiert, während die andere Hälfte das mutierte Allel des MeCP2-Gens exprimiert. Interessanterweise steht die Möglichkeit, dass zumindest einige MeCP2-Mutationen mit einer nicht zufälligen XCI im neuronalen Gewebe verbunden sein könnten, im Einklang mit der phänotypischen Variabilität von RTT-Patienten (und auch für die bekannten Fälle von RTT), ein Merkmal, das ausführlich dokumentiert wurde42,43. Wenn die Hälfte der hämatologischen Vorläuferzellen im Knochenmark das X-Chromosom mit der MeCP2-Mutation behalten, würde theoretisch nur die Hälfte der zirkulierenden reifen Erythrozyten das pathologische Allel tragen, was die Anzahl der zirkulierenden mitochondrienhaltigen Erythrozyten einschränkt. Dennoch wurde in zirkulierenden Leukozyten von sporadischen RTT-Patienten eine erhöhte Prävalenz von nicht zufälligem XCI zugunsten des Wildtyp-Allels beobachtet42,43. In diesem Zusammenhang wäre es sehr schwierig zu klären, ob die Patienten, die eine geringe Anzahl von mitochondrienhaltigen Erythrozyten aufweisen oder nicht, auch eine weniger signifikante Beeinträchtigung der Mitophagie oder der nicht-zufälligen XCI aufweisen, was zu einer positiven Selektion von hämatologischen Vorläufern mit dem Wildtyp-MeCP2-Allel führen würde.

In Anbetracht der Komplexität der RTT-Pathologie ziehen wir es daher vor zu behaupten, dass die RTT-Patienten zusammen mit den vom Pearson-Syndrom betroffenen Patienten die ersten Fälle von Mitochondrien-Retention in menschlichen reifen Erythrozyten darstellen könnten44.

Nachweis einer defekten Autophagie im Kleinhirn von Mecp2-null-Mäusen

Da es sich bei RTT um eine neurologische Entwicklungsstörung handelt, haben wir zur weiteren Untermauerung unserer Ergebnisse, die auf eine systemische defekte Autophagie hindeuten, immunhistochemische Analysen für p62 und Ubiquitin des Kleinhirns (d. h. ein Organ, in dem Mitochondrien vorhanden sind) durchgeführt.d. h. einem Organ, in dem Mitochondrienveränderungen und andere wichtige histologische Anomalien beobachtet wurden)21,45 von 9 Wochen alten Wildtyp-Mäusen und 5 Wochen alten (asymptomatischen) und 9 Wochen alten (symptomatischen) Mecp2 -/y-Mäusen. Für jede Versuchsbedingung wurde das von drei Tieren isolierte Organ analysiert. Im Vergleich zu wt zeigte das RTT-Kleinhirn eine Zunahme der Intensität der p62- (Abb. 5a) und Ub-Färbung (Abb. 5b) in allen Schichten (d. h. Granula, Purkinje- und kortikale Schichten), die linear mit dem Alter der Tiere verlief. Außerdem ähnelten die überfärbten Strukturen intrazellulären Aggregaten. Nach der semiquantitativen Auswertung der Intensität der Färbung von p62/SQSTM1 und Ub waren die Unterschiede zwischen dem Kleinhirn von 5-wöchigen Tieren gegenüber gesunden Tieren und von 9-wöchigen Tieren gegenüber 5-wöchigen Tieren statistisch signifikant (p < 0.05).

Der histologische Unterschied zwischen asymptomatischen und symptomatischen Tieren deutet darauf hin, dass die Autophagie-Veränderung bei der Geburt nicht oder nur schwach vorhanden sein könnte, während sie sich in den ersten Lebenswochen (und möglicherweise, wenn die MeCP2-Aktivität einen Höhepunkt erreicht) allmählich verstärkt und die Symptome hervorruft.