Alai

Abstract

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung. Wespengift (WV), das in der Jingpo-Nationalität in Yunnan, China, als traditionelle Volksmedizin gilt, lindert rheumatoide Arthritis. In der vorliegenden Studie sollte die Wirkung von Wespengift auf die Symptome der rheumatoiden Arthritis bei Versuchsratten untersucht werden. Wir haben ein Modell der durch Typ-II-Kollagen (CII) induzierten Arthritis (CIA) in SD-Ratten etabliert und die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen untersucht. Die antiarthritischen Wirkungen von WV wurden anhand der Pfotenschwellung bewertet, und der histopathologische Score und die histopathologischen Veränderungen der betroffenen Pfote wurden untersucht. Die entzündungshemmende Wirkung wurde anhand der Werte von IL-6, TNF-α, IL-1β und der Anzahl der Entzündungszellen im peripheren Blut untersucht. Die Veränderung des Verhältnisses der T-Zell-Untergruppen in der Milz der Ratten wurde mittels Durchflusszytometrie festgestellt, und gleichzeitig wurden der Viszera-Index und der Immunglobulinspiegel im Serum bewertet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass verschiedene Dosierungen von WV (0,125, 0,25 und 0,5 mg/kg) die Schwellung der Pfoten und den Arthritis-Score bei CIA-Ratten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle deutlich verringerten (). WV (0,25 und 0,5 mg/kg) verringerte die Läsionen des Synovialgewebes der Sprunggelenke und die histopathologischen Werte der Synoviozytenhyperplasie und der entzündlichen Zellinfiltration im Vergleich zur Vehikelgruppe (). Was die immunologische Regulierung betrifft, so senkte 0,5 mg/kg WV die Immunglobulinspiegel im Serum (), und wir fanden weiter heraus, dass WV (0,5 mg/kg) die Immunantwort der Th-Zellen unterdrückte, während es die Funktionen der Tc-Zellen und Treg-Zellen in den Milzzellen deutlich verbesserte (). Die immunsuppressive Wirkung von WV entsprach seiner hemmenden Wirkung auf die IL-1β-, TNF-α-, IL-8-, IL-6-, COX-2- und PGE2-Spiegel im Rattenserum. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass WV eine antiarthritische Aktivität aufweist, die mit ihrer hemmenden Wirkung auf die Immunregulation und der entzündungshemmenden Wirkung verbunden sein könnte.

1. Einleitung

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die zu systemischen Komplikationen, körperlichen Behinderungen und sogar zum frühen Tod führen kann. Die Hyperplasie der Synovialzellen, die chronische Entzündung der Synovialis und die Zerstörung von Knorpel und Knochen sind die Hauptmerkmale der RA. Darüber hinaus spielen die synergistischen Effekte von T-Zellen, B-Zellen und proinflammatorischen Zytokinen eine Schlüsselrolle im pathophysiologischen Prozess. Wenn CD4+ T-Zellen aktiviert werden, produzieren sie proinflammatorische Zytokine, die die Immunantwort verstärken, indem sie andere mononukleäre Zellen, synoviale Fibroblasten, Chondrozyten und Osteoklasten stimulieren. Die Freisetzung dieser proinflammatorischen Zytokine, insbesondere TNF-α, IL-6 und IL-1β, kann zur Synovitis beitragen.

Zurzeit konzentrieren sich die klinischen Medikamente zur Behandlung der RA in erster Linie auf die Reduzierung von Entzündungsmediatoren, wie nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs), krankheitsmodifizierende Antirheumatika (DMARDs) und biologische Wirkstoffe. So wurde beispielsweise das Folat-Analogon Methotrexat (MTX) als NSAID 1988 von der FDA für RA zugelassen. Aufgrund seiner immunsuppressiven Wirkung, seiner entzündungshemmenden Wirkung und seiner geringen Kosten ist es das am häufigsten eingesetzte Medikament zur Behandlung der RA. Allerdings ist MTX wegen seiner unerwünschten Nebenwirkungen auf das Nerven-, Magen-Darm- und Immunsystem kein ideales Therapeutikum, was auch für andere Medikamente gilt. Deshalb suchen immer mehr Menschen nach neuen Alternativen, um die Unwirksamkeit und Sicherheit dieser Medikamente auszugleichen. In der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) wird die RA als ein Arthralgie-Syndrom („Bi Zheng“ in der TCM) angesehen, das möglicherweise durch exogene Winde, Feuchtigkeit und Hitze- oder Kälteerreger verursacht wird. Die Anwendung der TCM bei der Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten hat eine Geschichte von mehreren Jahrhunderten, zunehmende Bedeutung in der RA-Behandlung auf seine bemerkenswerte Wirksamkeit, aber weniger Nebenwirkungen und Kosten zugeschrieben.

Venom-Therapie, als eine ergänzende und alternative Medizin Ansatz, hat für mehrere Jahrhunderte verwendet werden, um Schmerzen, Entzündungen und Arthritis in der Volksmedizin zu behandeln. Bereits in der Zeit der Streitenden Staaten heißt es im Inneren Kanon des Gelben Kaisers („Huangdi Neijing“ auf Chinesisch): „Bienenstich ist trotz des toxischen Risikos therapeutisch.“ Der modernen medizinischen Forschung zufolge hat Bienengift (BV) antiarthritische, entzündungshemmende und schmerzlindernde Wirkungen, die auf die Aktivierung des zentralen Hemmkörpers und die Modulation des Immunsystems durch mehrere Mechanismen zurückzuführen sind. Mehrere klinische Studien haben auch gezeigt, dass BV arthritisbedingte Symptome verbessern könnte.

Wespengift enthält eine Vielzahl biologisch aktiver Bestandteile, darunter biogene Amine, hochmolekulare Substanzen (wie Enzyme, Allergene und bioaktive Peptide) und Polyamintoxine. Das Wespengift hat verschiedene pharmakologische Wirkungen bei der Behandlung von Schmerzen, Entzündungen und neurodegenerativen Erkrankungen gezeigt. Vespa magnifica (Smith) ist eine Art der sozialen Wespe, die in Yunnan, China, vorkommt. In den letzten Jahren wurden aus ihrem Gift zahlreiche Verbindungen mit gerinnungshemmenden, thrombozytenaggregationshemmenden, entzündungshemmenden und immunsuppressiven Eigenschaften gewonnen. Aufgrund seiner bemerkenswerten Wirkung bei rheumatoider Arthritis ist es in Jingpo, einer chinesischen nationalen Minderheit, zur Gewohnheit geworden, weit verbreitet zu sein. Dennoch gibt es, soweit wir wissen, nur wenige Berichte über die antirheumatischen Wirkungen von Wespengift.

In der vorliegenden Arbeit wurde das Modell der kollageninduzierten Arthritis (CIA) verwendet, um die Pathogenese der RA genau nachzubilden. Veränderungen des Pfotenvolumens wurden klassischerweise zur Bewertung der entzündungshemmenden Wirkung bei RA verwendet. Darüber hinaus haben wir die Wirkung von WV (Wespengift von Vespa magnifica) in demselben Modell untersucht. Schließlich wurde die Wirksamkeit von WV auf die Entzündungshemmung und Immunmodulation durch H&E-Färbung des Gelenkgewebes, Durchflusszytometrie von T-Zell-Untergruppen in der Milz sowie ELISA von Serum-IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 und Rheumafaktoren (IgG, IgA und IgM) beobachtet.

2. Materialien und Methoden

2.1. Versuchstiere

Männliche SD-Ratten (60 Ratten, 180-220 g) wurden von Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. bezogen. Die Tiere wurden in Standard-Polypropylenkäfigen untergebracht, die mit roher Schale ausgekleidet waren (nach 48 Stunden erneuert). Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus bei etwa 22 ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-70 % gehalten und hatten freien Zugang zu Wasser und Standardfutter. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip 8 Kontrollen und 52 Modellen zugeteilt, und dann wurde für jedes Experiment ein Mindestzeitraum von 7 Tagen für die Anpassung vorgesehen. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institutes of Health) durchgeführt und von der Ethikkommission der Universität Dali genehmigt.

2.2. Tiermodell der CIA und Behandlungsprotokoll

Ratten wurden mit Alkohol desinfiziert und subkutan an der rechten Fußsohle, am Rücken und am Schwanz mit 1 mg/ml CCII (Hühner-Typ-II-Kollagen) Emulgator für die erste Immunisierung injiziert, der aus CCII (C9301, Sigma) besteht, das 1 : 1 mit unvollständigem Freund’s Adjuvans (F5506, Sigma) emulgiert ist. Der Induktionstag wurde als Tag 0 festgelegt. Die Booster-Dosis wurde am 8. Tag zusammen mit 1 ml CCII-Emulgator erneut an Bauch, Rücken und Schwanz injiziert. Der injizierte Fuß wurde als der entzündete Fuß definiert, während der andere Fuß ohne Injektion als sekundärer Fuß bezeichnet wurde. Die Behandlung der Ratten mit kollageninduzierter Arthritis (CIA) begann am Tag 14 und endete am Tag 28. Nach dem Ausbruch der CIA wurden die Modellratten nach dem Zufallsprinzip entsprechend den klinischen Ergebnissen in fünf Gruppen eingeteilt. Gruppe I: Modellgruppe, die eine subkutane Injektion (1 ml/kg) von normaler Kochsalzlösung als Vehikel erhielt. Gruppen II-IV: CIA-Ratten erhielten eine subkutane Injektion von 0,125, 0,25 und 0,5 mg/kg WV (Wespengift aus Vespa magnifica (Smith) in Yunnan, China, gefriergetrocknetes Pulver aus dem Exsudat von Wespenschwanzdrüsen, verdünnt mit normaler Kochsalzlösung) als Behandlungsgruppen. Gruppe V: Die positive Kontrollgruppe erhielt auf die gleiche Weise 9 mg/kg TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, Nr. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.). Gleichzeitig wurde den normalen Ratten in der Kontrollgruppe die gleiche Menge normaler Kochsalzlösung allein verabreicht. Die oben genannten Ratten erhielten 14 Tage lang eine tägliche Gabe.

2.3. Grundlegende Bewertung der experimentellen Arthritis

Der Schweregrad der CIA wurde in regelmäßigen Abständen anhand der Pfotenschwellung und der Arthritis-Scores bewertet. Die Ratten wurden an den Tagen 0 bis 28 der Studie gewogen, und die Dicke und der Umfang der Knöchel des entzündeten Fußes (rechter Fuß) und des sekundären Fußes (linker Fuß) wurden an den Tagen 0, 14 und 28 getrennt mit einem Messschieber und einem Band gemessen. Der Arthritis-Score wurde auf der Grundlage unabhängiger Beobachtungen von drei Gelehrten ermittelt. Jede Pfote wurde auf einer Skala von 0 bis 4 bewertet, was bedeutet, dass die maximale Gesamtpunktzahl für beide Hinterpfotengelenke 8 betrug. Die Bewertungskriterien waren wie folgt: 0 = kein Ödem oder visuelle Veränderungen; 1 = leichtes Ödem und begrenztes Erythem; 2 = leichtes Ödem und Erythem; 3 = deutliches Ödem und signifikantes Erythem; und 4 = schweres Ödem und extensives Erythem. Am 28. Tag wurden die Tiere getötet, das Serum und die sekundären Knöchelgelenke wurden gesammelt und für weitere Analysen aufbereitet.

2.4. Histopathologie der Sprunggelenke

Die linken hinteren Gliedmaßen wurden, ohne benachbarte Gewebe zu entfernen, sofort 2-3 Mal mit PBS gewaschen, 48 Stunden lang mit 10%igem Formalin fixiert und 24 Stunden lang mit 5%iger Salpetersäure entkalkt, bis die Knochenrinde mit einer Nadelspitze leicht durchstoßen werden konnte. Die Proben wurden in Paraffinschnitte eingebettet und für die Routinefärbung mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) in Scheiben (5 μm) geschnitten. Pathologische Veränderungen an den Gelenken wurden mit einem Lichtmikroskop (Olympus, Japan) erfasst und fotografiert. Die Bilder wurden mit 200facher Vergrößerung aufgenommen. Veränderungen der Synoviozytenhyperplasie und der Entzündungszellinfiltration wurden ebenfalls festgestellt. Die histopathologischen Veränderungen wurden anhand der folgenden Kriterien bewertet: 0 = keine erkennbaren Veränderungen; 1 = leicht; 2 = mäßig; 3 = schwer;

2,5. Analyse des Viscera-Index

Ratten wurden geopfert und die komplette Leber, die Milz und der Thymus wurden mit dem umgebenden Fettgewebe und der Faszie vorsichtig herausgeschnitten. Die Feuchtmasse von Leber, Milz und Thymus wurde mit einer elektronischen Waage gemessen, und der Viszera-Index (einschließlich Leber-, Milz- und Thymusindex) wurde nach folgender Formel berechnet. Viszera-Index = Organmasse (mg)/Körpermasse (g) × 100%.

2.6. ELISAs der biochemischen Indizes im Serum

Das Serum der Versuchsratten wurde entnommen, und die Konzentrationen von TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 und PGE2 wurden mit ELISA-Kits (Nanjing JianCheng, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. ELISA-Kits zum Nachweis der Expressionsniveaus von IgA (ERC015), IgG (ERC016) und IgM (ERC017) wurden von NeoBioscience Co., Ltd. in Shenzhen, China, erworben.

2.7. Durchflusszytometrie der Arthritis-Milz

Die Anzahl der T-Zell-Untergruppen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie ermittelt. Die Lymphozyten wurden aus Rattenmilzzellen gewonnen, die durch ein Nylonsieb mit 200 Maschen homogenisiert wurden. Die Zellen wurden in PBS-Puffer mit 10 % fötalem Rinderserum filtriert. Die Zellkonzentration wurde auf etwa 2 × 106/ml eingestellt, und es wurden 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer (Solarbio, China) hinzugefügt, um die Erythrozyten für weniger als 5 Minuten aufzulösen. Dann wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert, zweimal mit FBS-PBS-Puffer gewaschen, der 10 % fötales Rinderserum enthielt, und anschließend 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert. Jeweils 100 μL Zellsuspension wurden in Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Lymphozyten wurden anschließend mit Anti-CD3-FITC (Nr. 557354; BD, USA), Anti-CD4-APC (Nr. 565432; BD, USA), Anti-CD8-PerCP (Nr. 558824; BD, USA) und Anti-CD25-PE (Nr. 554866; BD, USA) gefärbt. Die monoklonalen Antikörper wurden in jedes Röhrchen gegeben, neu gemischt und 30 Minuten lang auf Eis gelegt. Der FBS-PBS-Puffer (1 ml) wurde in jedes Probenröhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der vorige Schritt wurde zweimal wiederholt, so dass die Zellen ohne Bindung an monoklonale Antikörper vollständig eluiert wurden. Die Versuchszellen wurden mit 500 μl FBS-PBS-Puffer gemischt. Die Verhältnisse von CD25+/CD4+ und CD4+/CD8+ T-Zellen wurden mit einem FACS Canto Durchflusszytometer (BD, USA) bestimmt.

2.8. Statistische Analysen

Die Daten wurden mit SPSS10.0 statistisch ausgewertet. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (S.D.M) angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wurde mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey-Test analysiert. Insbesondere der Arthritis-Score und der histopathologische Score wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest analysiert. Werte von wurden als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. WV linderte die Symptome der Arthritis bei CIA-Ratten

Die arthritischen Symptome wurden bei den Ratten erfolgreich durch die Injektion von Typ-II-Kollagen gemäß den Anweisungen induziert, was sich in signifikanten makroskopischen Anzeichen einer starken Rötung und Schwellung der sekundären Pfote und des Sprunggelenks der CIA-Ratten in Abbildung 1(a) zeigte, wenn sie mit der gesunden Kontrollgruppe verglichen wurden. Die Dicke und der Umfang des Sprunggelenks waren bei den Fahrzeugen am Tag 14 (Abbildung 1(b)) im Vergleich zu den Kontrollen offensichtlich erhöht; sie waren jedoch nach TwHF und allen WV-behandelten Gruppen am Tag 28 im Vergleich zu denen der Modellgruppe (alle ) auffallend verringert (Abbildung 1(b)). Als wir die Dicke und den Umfang der Knöchelgelenke sowohl im entzündeten Fuß als auch im sekundären Fuß maßen, wurde anhand der Daten ein deutlicher Rückgang der Schwellung festgestellt (Abbildung 1(b)). Die Ergebnisse des Schwellungsgrades deuteten darauf hin, dass WV das Pfotenödem kontrollieren und die sekundäre Entzündung an der Pfote und dem Sprunggelenk entsprechend dem TwHF-Effekt lindern konnte.

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Abbildung 1

Wirkung von WV auf die arthritischen Symptome jeder Gruppe. (a) Schwellungsgrad der Pfoten in allen Gruppen. (b) Dicke und Umfang der Sprunggelenke sowohl im entzündeten Fuß als auch im Sekundärfuß in allen Gruppen. (c) Vergleich des Arthritis-Scores in allen Gruppen.

Außerdem verringerte sich der Arthritis-Score durch die Behandlung mit WV in Abhängigkeit von der Höhe der Dosis in unterschiedlichem Maße, wie in Abbildung 1(c) dargestellt. Der Arthritis-Score der Vehikelgruppe lag am Tag 14 bei 6,5 ± 1,0 (im Vergleich zu Tag 0, ). Der Index war in der mit TwHF behandelten Gruppe an Tag 28 mit 2,8 ± 0,8 (im Vergleich zu Tag 14) signifikant gesunken. In ähnlicher Weise war der Rückgang der Indizes durch WV signifikant und dosisabhängig (3,2 ± 0,6 bei 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 bei 0,25 mg/kg und 5,6 ± 0,7 bei 0,125 mg/kg) (im Vergleich zu 14 Tagen). Dies deutet darauf hin, dass die Wirksamkeit von WV bei 0,5 mg/kg derjenigen der mit TwHF behandelten Gruppe entsprach.

3.2. WV linderte die pathologischen Veränderungen der Gelenke bei CIA-Ratten

H&E-Färbung (Abbildung 2(a)) zeigte, dass die Synovialmembran der Knöchelgelenke der Kontrollratten eine regelmäßige zelluläre Anordnung aufwies, ohne Synoviozytenhyperplasie, entzündliche Zellinfiltration und eine glatte Knorpeloberfläche. Im Vergleich dazu war die histologische Architektur der Gelenke der Ratten aus der Vehikelgruppe deutlich abnormal mit Immunzellinfiltration, Synoviozytenhyperplasie, erhöhter Anzahl von Gefäßen und Erosion von Knorpel und Knochen. Die Gelenke der TwHF- und WV-Gruppen waren im Vergleich zu denen der Vehikelgruppe deutlich abgeschwächt und näherten sich denen der Kontrollgruppe an. Histopathologische Scores (Abbildung 2(b)) zeigten (Fahrzeuggruppe) die abnormen Synovialschleimhautzellen und die Infiltration von Entzündungszellen in den arthritischen Gelenken; TwHF und WV-Behandlungen senkten den mittleren histopathologischen Score signifikant und stellten den Knorpel im Vergleich zur Fahrzeuggruppe wieder her ().

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Abbildung 2

Auswirkungen von WV auf das Fortschreiten der Arthritis und die Gelenkhistologie bei CIA-Ratten. (a) Histopathologie von Gelenkgewebeschnitten von CIA-Ratten, die mit verschiedenen Dosen von WV und TwHF behandelt wurden, und von normalen Ratten durch H&E-Färbung. Originalvergrößerung ×200. a, Knochenzerstörung; b, Immunzellinfiltration; c, hypertrophe Synovialis. (b) Histopathologische Ergebnisse der Hyperplasie der Synoviozyten und der Infiltration von Entzündungszellen in allen Gruppen. (b) Histopathologische Werte der Synoviozytenhyperplasie und der Entzündungszellinfiltration in allen Gruppen: , im Vergleich zur Kontrollgruppe; , im Vergleich zur Vehikelgruppe.

3.3. Auswirkungen von WV auf den Viscera-Index und die Immunserumglobulinspiegel bei CIA-Ratten

Im Vergleich zur Kontrollgruppe sank der Leberindex der Vehikelgruppe signifikant () und WV (0,25 und 0,5 mg/kg) erhöhte ihn deutlich (). Im Vergleich zur Kontrollgruppe stiegen der Milzindex und der Thymusindex der Vehikelgruppe deutlich an (); TwHF und WV hatten eine hemmende Wirkung auf sie, die sich besonders in der Wirkung der 0,5 mg/kg-Dosis von WV auf den Thymusindex widerspiegelte (Abbildung 3(a)).

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Abbildung 3

Auswirkungen von WV auf den Eingeweideindex und den Immunserumglobulinspiegel bei CIA-Ratten. (a) Veränderungen im Milz-, Thymus- und Leberindex in allen Gruppen. (b) Die Expression von IgG, IgA und IgM im Serum aller Gruppen.

Die Expressionswerte von IgG, IgA und IgM waren bei CIA-Ratten () im Vergleich zur Kontrollgruppe dramatisch verbessert, während sie nach der TwHF-Verarbeitung () niedriger wurden. Und die IgG-Serumspiegel waren in der WV-Gruppe (0,5 mg/kg) im Vergleich zur Vehikelgruppe verringert (). Diese Hemmung galt auch für IgA und IgM in den WV-Gruppen (0,25 und 0,5 mg/kg) (Abbildung 3(b)).

3.4. Auswirkungen von WV auf T-Zell-Subsets in der Milz von CIA-Ratten

Die Anzahl der CD4+ T-Zellen nahm in den Vehikelgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant zu (), während die Anzahl in den TwHF- und WV-Gruppen (0,5 mg/kg) signifikant niedriger war als in der Vehikelgruppe (Abbildung 4(a)). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Anzahl der CD4+CD25+ T-Zellen in der Vehikelgruppe signifikant verringert (), während sie in den Gruppen TwHF und WV (0,5 mg/kg) signifikant erhöht waren (), aber in den anderen Gruppen nicht auffielen (Abbildung 4(a)). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Verringerung der Anzahl der CD8+ T-Zellen in der Vehikelgruppe bemerkenswert, aber nur WV (0,125 und 0,25 mg/kg) ließ die Zahlen ansteigen (, ) in Abbildung 4(b).

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Abbildung 4

Die Anzahl der T-Zell-Untergruppen in Milzzellen mittels Durchflusszytometrie. (a) Die Ergebnisse der FCM für die Anzahl der Th-Zellen und Tc-Zellen (links); die Ergebnisse der FCM für die Anzahl der Treg-Zellen (rechts). (b) Das Balkendiagramm zeigt die negative Wirkung von WV und TwHF auf Th-Zellen und die positive Wirkung auf Tc-Zellen und Treg-Zellen. im Vergleich zur Kontrollgruppe; , im Vergleich zur Vehikelgruppe.

3.5. WV regulierte Serumzytokine und Mediatoren in CIA-Ratten

ELISA-Kits (Abbildung 5) zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Serumspiegel von IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 und IL-8 in der Vehikelgruppe signifikant erhöht waren und durch TwHF (9 mg/kg) und WV (0,5 mg/kg) deutlich wiederhergestellt wurden (). In der Zwischenzeit wurden die Expressionen von IL-6 und PGE2 durch eine Dosierung von 0,125 und 0,25 mg/kg WV unterdrückt (). WV (0,125 und 0,25 mg/kg) verringerte in ähnlicher Weise die Expression von COX-2 und IL-8 im Vergleich zum Vehikel (, ). Dies deutet darauf hin, dass die CCII-induzierte Entzündung wahrscheinlich für die pathologischen Veränderungen bei den arthritischen Ratten verantwortlich ist, und dass WV die Entzündungsreaktion lindern kann.

Abbildung 5

Wirkungen von WV auf IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 und COX-2 im Serum von CIA-Ratten. Diskussion

Rheumatoide Arthritis ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die durch Schmerzen, Schwellungen und eine allmähliche Zerstörung der Gelenke gekennzeichnet ist, was zu einem Funktionsverlust führt. cObwohl Methotrexat (MTX)-Tabletten offen als ein Medikament zur Behandlung von rheumatoider Arthritis angesehen werden, sind sie in der Regel mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen (UAW) verbunden. Daher wollten wir untersuchen, ob Wespengift (WV) eine potenzielle Alternative zur Behandlung von RA darstellen könnte.

Die vorliegende Studie war unseres Wissens die erste, in der die therapeutische Rolle von WV (aus Vespa magnifica) bei kollageninduzierter Arthritis (CIA), die bei SD-Ratten induziert wurde, untersucht und mit der klinisch nachgewiesenen Wirkung von TwHF verglichen wurde. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), in der TCM auch als Lei Gong Teng bekannt, wird in China seit vielen Jahren zur Behandlung von RA eingesetzt, und die Extrakte von TwHF haben sowohl in vivo- als auch in vitro-Studien entzündungshemmende und immunosuppressive Aktivitäten gezeigt. Wir etablierten das Modell der CIA-Ratten für 14 Tage und entfernten 12 offensichtliche Inkompetenzen, die auf Injektionsfehler zurückzuführen sein könnten, von 52 Ratten, d. h. die CIA-Ratten hatten eine Arthritisrate von 77 %. Die Kontrollgruppe zeigte weder Anzeichen von Ödemen noch von Entzündungen (Abbildungen 1 und 5), und unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien zu RA und CIA überein, in denen berichtet wurde, dass CCII-Emulgator die Schwere von Ödemen und Entzündungsschäden in den Gelenken induzierte. Dann waren die verbesserten Symptome in der WV-Gruppe (0,5 mg/kg) ähnlich wie die des positiven Medikaments TwHF, von dem berichtet wurde, dass es die Entzündungsreaktion der RA hemmt, aber die Wirkung der niedrigen Dosis war nicht signifikant auf die Verringerung der Schwellung und die Hemmung von IL-1β und TNF-α (Abbildungen 1 und 5). Außerdem stellten wir fest, dass die Ratten in der Vehikelgruppe ein raueres Fell und einen schlechteren mentalen Zustand hatten als die in der Kontrollgruppe; diese Bedingungen hatten sich in der Behandlungsgruppe umso mehr verbessert.

Um die therapeutische Wirksamkeit von WV weiter zu bewerten, wurde eine H&E-Färbung in Gewebeproben des linken hinteren Sprunggelenks durchgeführt, um die pathologischen Merkmale zu analysieren, und wir stellten fest, dass Synovialzellen eine Entzündung, Proliferation und Invasion von lokalisiertem Knorpel und Knochen in der Vehikelgruppe verursachen (Abbildung 2), und diese makroskopischen Veränderungen stimmen mit früheren Berichten überein. Darüber hinaus reduzierte die 14-tägige Behandlung mit TwHF und WV die Hyperplasie der Synovialzellen und die Infiltration von Entzündungszellen im Vergleich zur unbehandelten Gruppe erheblich (Abbildung 2). Die chronische Synovitis ist die pathologische Grundlage der RA. Die synoviale Entzündung wird durch eine komplexe Interaktion zwischen Synoviozyten und infiltrierenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems angetrieben. Daher wurde in diesem Experiment der viszerale Index von Immunorganen wie Milz und Thymus berechnet. Es ist erwähnenswert, dass wir keinen signifikanten Gewichtsunterschied zwischen der Vehikel- und der Behandlungsgruppe feststellen konnten; daher haben wir den repräsentativen Viszeralindex verwendet, um den allgemeinen Gesundheitszustand der Ratten wiederzugeben. Wir fanden heraus, dass TwHF und WV den Anstieg des Viszeralindex von Milz und Thymus bei CIA-Ratten verringern konnten (Abbildung 3(a)); dies könnte ihre Rolle bei der Abschwächung der durch RA verursachten Immunverstärkung widerspiegeln. Wir beobachteten auch die Veränderung des Leberindexes während dieses Prozesses; unsere Ergebnisse zeigten, dass TwHF den Leberindex nicht wieder ansteigen ließ, obwohl seine Behandlung wirksam war, was uns an seine Toxizität für die Leber in einem früheren Bericht erinnerte. Glücklicherweise wurde dies in der WV-Gruppe nicht festgestellt (Abbildung 3(a)). Mit Ausnahme des verringerten Leberindexes in der Vehikel- und TwHF-Gruppe wurden bei diesen Ratten keine Nebenwirkungen beobachtet, was auf die von uns verwendete niedrige Dosierung zurückzuführen sein könnte. Darüber hinaus wiesen wir auch Rheumafaktoren (RF) nach, einen diagnostischen Marker für RA, der hauptsächlich IgG-, IgA- und IgM-Isotypen umfasst und eine hohe Nachweisrate bei Patienten mit RA aufweist. In dieser Studie wurde festgestellt, dass unbehandelte CIA-Ratten signifikant höhere IgG-, IgA- und IgM-Antikörperspiegel im Serum aufwiesen als die TwHF- und WV-Gruppen (Abbildung 3(b)); diese Ergebnisse stimmen gut mit den klinischen Daten überein. Somit konnte festgestellt werden, dass TwHF und WV (0,5 mg/kg) die übermäßige Autoimmunreaktion von CIA-Ratten auf ein Niveau nahe dem Normalwert herunterregulieren konnten. Im Gegensatz dazu war die Wirkung von WV (0,125 und 0,25 mg/kg) nicht offensichtlich, und es bleibt abzuwarten, ob eine höhere Dosis die Wirkung verbessert, anstatt als Gift zu wirken, so dass wir uns immer noch auf diese drei Dosen konzentrierten, um die Wirkung von WV auf RA in diesem Experiment zu erforschen.

Vorangegangene Forschungen haben gezeigt, dass synoviale Entzündungen Immunzellen rekrutieren und aktivieren, indem sie Mediatoren produzieren, und T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von RA. Was die Rolle der proinflammatorischen Zytokine bei der Autoimmunität betrifft, ist es wichtig, das Gleichgewicht zwischen verschiedenen T-Zell-Untergruppen zu berücksichtigen, die je nach Funktion und Phänotyp hauptsächlich in zwei Hypotypen unterteilt werden: CD4+ T-Helferzellen (Th) und CD8+ zytotoxische T-Zellen (Tc). Th-Zellen und Tc-Zellen, die durch die Produktion verschiedener spezifischer Zytokine gekennzeichnet sind, erleichtern die adaptive Immunantwort. Im Gegensatz dazu haben CD4+CD25+ T-Zellen (Treg-Zellen) eine Schlüsselfunktion bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz, indem sie Entzündungsreaktionen kontrollieren und die Aktivität der oben genannten Immunzellen unterdrücken. In dieser Studie stellten wir eine hohe Konzentration von Th- und Tc-Zellen in den Milzzellen fest und bemerkten auch eine eingeschränkte Funktion der Treg-Zellen bei CIA-Ratten. Glücklicherweise konnte das Gleichgewicht zwischen den T-Zell-Untergruppen durch die Behandlung mit TwHF und WV geschützt werden (Abbildung 4). Bemerkenswert ist, dass die Ansammlung von Immunzellen die lokale Gelenkentzündung fördert und die aktivierten Immunzellen eine große Menge an proinflammatorischen Zytokinen freisetzen, die dann die Aktivierung und Proliferation von Synovialzellen induzieren und das Fortschreiten der Gelenkentzündung weiter verschlimmern. Frühere Studien haben gezeigt, dass IL-6 das wichtigste Zytokin in der Pathogenese der RA ist, und in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten wurden übermäßige Mengen von IL-1β sowie TNF-α und IL-8 gefunden. Die Produktion von COX-2 und PGE2 nach Stimulation mit IL-1β ist ebenfalls erhöht, und ihre Blockierung linderte die Symptome der RA deutlich. Ähnliche Befunde wurden in unseren experimentellen Ergebnissen beobachtet, und wir bestätigten, dass TwHF und WV (0,5 mg/kg) die Werte von IL-6, IL-8, PGE2 und COX-2 wirksam reduzieren konnten; auch die erhöhten Konzentrationen von IL-1β und TNF-α, die durch RA induziert wurden, wurden mit Ausnahme der WV (0,125 und 0.25 mg/kg) unterdrückt (Abbildung 5).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WV die Funktionen der Linderung von Gelenkschwellungen, der Hemmung von Synovialentzündungen, der Unterdrückung übermäßiger Immunreaktionen und des Schutzes der Immunhomöostase hat, die die Symptome verbessern und wirksame Heilmittel für RA werden können. Es wurde berichtet, dass Wespengift eine Reihe bioaktiver Moleküle enthält, darunter Amine, kleine Peptide und sogar Enzyme, Allergene und Toxine mit hoher Molekülmasse. Der Unterschied zwischen WV und BV besteht darin, dass BV vor allem entzündungshemmende, antioxidative und schmerzlindernde Wirkungen auf die RA hat und eine Vielzahl verschiedener Peptide enthält, darunter Melittin, Phospholipase A2, Apamin und so weiter. Die Mechanismen der Behandlung von RA mit diesen beiden Giften könnten unterschiedlich sein und sollten weiter untersucht werden. Obwohl im Bereich von 0,125 bis 0,5 mg/kg WV keine Nebenwirkungen beobachtet wurden, ist eine weitere Bewertung der Wirkstoffe und der Sicherheit des WV-Extrakts erforderlich.

5. Schlussfolgerungen

Wespengift linderte die durch CIA verursachte Synovialhyperplasie und Knorpelzerstörung, möglicherweise aufgrund der Verringerung der proinflammatorischen Faktoren und der immunregulierenden Wirkung. Diese Studie zeigte, dass Wespengift eine potenzielle therapeutische Alternative für RA sein könnte. Abgesehen davon, dass WV seit vielen Jahren ein Volksrezept ist, verdient es weitere Studien, um entdeckt, erforscht und anerkannt zu werden.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind in dem Artikel enthalten und können frei zugänglich gemacht werden.

Ethische Genehmigung

Die Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Dali genehmigt.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Beiträge der Autoren

YG schrieb das Manuskript und half bei der Konstruktion und Gruppierung der Tiermodelle. WXY und HL führten die H&E-Färbung und die Durchflusszytometrie durch. XMD und LLN waren für die ELISA-Kits verantwortlich. ZBY, HRZ und HX waren maßgeblich an der Erstellung des Manuskripts beteiligt. ZBY und CGZ verwalteten und überwachten das Projekt. Alle Autoren lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.

Danksagungen

Ein Teil dieser Arbeit wurde vom Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics unterstützt. Die vorliegende Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 81360679 und 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (Zuschuss Nr. 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (Zuschuss Nr. 2017FA050), und Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (Zuschuss Nr. ZKLX2019101).