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La ATPasa vacuolar (V-ATPasa) es una bomba de protones de múltiples subunidades impulsada por ATP que acidifica las vesículas intracelulares y el medio extracelular y, por tanto, está implicada en un gran número de funciones biológicas . En revisiones anteriores se ha descrito con elegancia la estructura y la función de la V-ATPasa. Aquí revisamos la literatura reciente relativa a la función de la V-ATPasa y su contribución a varios procesos celulares en la fisiología normal, con énfasis en el cáncer. También presentamos en detalle la regulación de Notch y otras vías de señalización por parte de la V-ATPasa, revelando una función hasta ahora menos conocida de la V-ATPasa en la señalización celular.

Isoformas de las subunidades

Estructuralmente, la V-ATPasa es un nanomotor rotatorio formado por múltiples subunidades, cada una con múltiples isoformas . Las subunidades están dispuestas en dos dominios: un dominio V1 periférico, responsable de la hidrólisis del ATP y un dominio VO de membrana integral, que funciona en la translocación de protones. La estructura de la V-ATPasa está muy conservada en todas las células eucariotas y participa en diversas funciones en todas las especies. En los mamíferos, el dominio V1 tiene ocho subunidades diferentes (A, B, C, D, E, F, G y H) mientras que el dominio VO está compuesto por seis subunidades diferentes (a, c, c’, c», d, e) . El requisito diferencial de acidificación en las vesículas intracelulares y el medio extracelular impulsa la función y la regulación de la V-ATPasa. Para disminuir o aumentar la eficiencia de la bomba, la V-ATPasa controla el acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y el bombeo de protones. Este proceso es llevado a cabo por la subunidad «a» de la V-ATPasa. Del mismo modo, la orientación específica de la V-ATPasa a la célula y al compartimento también depende de las isoformas de la subunidad «a». La VOa es una proteína integral de membrana de 100 kDa con una cola citosólica terminal N y 9 dominios transmembrana. Se han identificado cuatro isoformas de la subunidad «a» (a1, a2, a3 y a4) con distinta distribución vesicular y celular. La VOa1 se expresa en las vesículas sinápticas y la VOa2 se expresa en vesículas intracelulares como los golgi y los endosomas tempranos. El VOa3 se expresa en la membrana plasmática de los osteoclastos, mientras que el VOa4 se expresa en la membrana plasmática de las células intercaladas renales. Además, el N-terminal de la subunidad «a» es un motivo importante que une el dominio V1 a la membrana y también se ha informado de que es un sensor de pH único en los lisosomas. La expresión y la localización de la subunidad ‘a’ son fundamentales para el funcionamiento de la V-ATPasa.

Función fisiológica de la V-ATPasa

La V-ATPasa se expresa de forma ubicua y realiza diversas funciones biológicas dentro de las células de la mayoría de los tejidos mediante la acidificación vesicular, luminal y extracelular . Para lograr numerosas funciones celulares, la V-ATPasa facilita la concentración localizada de protones en vesículas ácidas de las vías endocítica y exocítica .

Acidificación vesicular

Endosomas y lisosomas

La V-ATPasa es más conocida por su papel en la acidificación de vesículas intracelulares como los endosomas y los lisosomas. En la superficie de los endosomas, la V-ATPasa acidifica y modula así importantes procesos celulares como la endocitosis de receptores y el tráfico vesicular. La acidificación de los endosomas por la V-ATPasa es crucial para la internalización endocítica de los complejos de ligandos de los receptores. Tras el inicio de la señalización, un pH más bajo en los endosomas libera el ligando reciclándolo a la membrana plasmática . En los lisosomas, las V-ATPasas ayudan a mantener el bajo pH de 4,5 y también son importantes para el transporte de hidrolasas ácidas recién sintetizadas desde el Golgi a los lisosomas. Además, los fagosomas y los autofagosomas de los macrófagos y las células tumorales, respectivamente, también dependen del pH ácido mantenido por la V-ATPasa para la actividad de las enzimas degradativas en estos compartimentos.

Golgi

La clasificación de la maquinaria exocítica y endocítica comienza en el complejo de Golgi. Es importante destacar que la mayoría de las proteínas se someten a la glicosilación, una modificación postraduccional crucial dentro del aparato de golgi . Las mutaciones en la subunidad a2 de la V-ATPasa dan lugar a la cutis laxa, un síndrome autosómico recesivo de piel arrugada en el que se observa una alteración de la glicosilación de las proteínas de la matriz extracelular . Aunque la V-ATPasa se ha correlacionado genéticamente con el defecto de glicosilación, no se ha explorado la relación exacta entre la acidificación del golgi y la maduración de las proteínas.

Vesículas especializadas

La V-ATPasa es una proteína importante que se expresa en compartimentos especializados de tipos celulares específicos. Durante la neurotransmisión, la V-ATPasa proporciona la crucial fuerza motriz de protones necesaria para la formación de vesículas sinápticas y la posterior acumulación de neurotransmisores . En las células pancreáticas, la acidificación dependiente de la V-ATPasa es importante para la exocitosis de la insulina. La V-ATPasa también gobierna el equilibrio de fisión-fusión del sistema vesicular al interactuar con el Receptor de Proteínas Solubles de Fijación NSF (SNARE) y la GTPasa .

Acidificación luminal

Las V-ATPasas se identificaron inicialmente en las vesículas intracelulares, pero la importancia de las V-ATPasas de la membrana plasmática ha crecido enormemente . En las células epiteliales del túbulo proximal del riñón, la isoforma a4 de la V-ATPasa mantiene el equilibrio ácido-base y la acidificación de la orina (acidosis sistémica) . Del mismo modo, en las células claras del epidídimo, la V-ATPasa de la membrana plasmática acidifica el compartimento luminal y contribuye a la maduración y el almacenamiento de los espermatozoides . En los osteoclastos del hueso, la V-ATPasa lisosomal se transloca a la membrana plasmática durante la resorción ósea para acidificar las lagunas . La V-ATPasa plasmática es crucial para el funcionamiento de las células interdentales del oído, las células epiteliales de la nariz y la visión. La disfunción de la V-ATPasa se asocia a condiciones patológicas como la acidosis tubular renal, la sordera, el deterioro del sentido del olfato y la osteoporosis En la Fig. 1 se muestra un esquema que describe el papel de la V-ATPasa en la acidificación vesicular y luminal. 1.

Función en los cánceres

Recientemente, la V-ATPasa de la membrana plasmática ha sido ampliamente estudiada en el cáncer, donde ayudan a mantener un entorno intracelular alcalino favorable para el crecimiento y un entorno extracelular ácido favorable para la invasión . En los tumores, se ha demostrado que la expresión de la V-ATPasa es mayor hacia el borde delantero de las células cancerosas en proliferación de los cánceres de mama, próstata, pulmón, ovario, hígado, páncreas, melanoma y esófago . En concreto, las células de cáncer de mama expresan V-ATPasa en la membrana plasmática para acidificar el espacio extracelular y la expresión cuantitativa de V-ATPasa se correlaciona con la capacidad de invasión y el potencial metastásico de la línea celular . La contribución exacta de la V-ATPasa al crecimiento del tumor se consigue a través de su influencia en los mecanismos/vías moleculares que se discuten a continuación.

Inmunomodulación

La isoforma a2 de la ATPasa Vacuolar (VOa2 o a2V) tiene un papel inmunomodulador en el embarazo y el cáncer. Los estudios sobre la a2V en la biología reproductiva descubrieron un papel hasta ahora desconocido de esta molécula en la maduración y producción normal de los espermatozoides, además de la implantación del embrión. En el microambiente tumoral, el dominio terminal N de a2V polariza a los macrófagos hacia los macrófagos asociados al tumor (tipo M2) y estimula diferentes subconjuntos de monocitos a través de la vía de la endocitosis . Tras estos hallazgos, se demostró además que la deficiencia de a2V en las células tumorales altera la población de macrófagos residentes en el microambiente tumoral y afecta al crecimiento tumoral in vivo . a2V se expresa en los gránulos primarios de los neutrófilos y ayuda a mantener el pH en la vía exocítica durante la activación de los neutrófilos . El tratamiento de neutrófilos humanos con el péptido N terminal recombinante de a2V (a2NTD) promueve la migración y la polarización de los neutrófilos. En conjunto, estos estudios ponen de relieve el papel inmunomodulador de la V-ATPasa en la obtención de potentes respuestas inmunitarias.

Efecto Warburg

Un rasgo distintivo del cáncer es el efecto Warburg, en el que las células pasan de la fosforilación oxidativa a la glucólisis aeróbica . Varios estudios apuntan a la hipótesis de que las células cancerosas dependen de la V-ATPasa más que de otros reguladores del pH, como los intercambiadores de Na+H+, los transportadores de bicarbonato y los simpatizantes de protones y lactato, para conseguir un pH intracelular alcalino favorable y un pH extracelular ácido. La alcalinización del citosol activa la glucólisis y suprime la fosforilación oxidativa. Además, algunos oncogenes relacionados con la glucólisis, como el factor inducido por la hipoxia (HIF-1), están regulados por la alteración del pH inducida por la V-ATPasa.

Proteasas ácidas

La consecuencia de la acidificación extracelular en los tumores es la activación de las proteinasas ácidas, que son enzimas que escinden la matriz extracelular durante la invasión tumoral. Estas enzimas pertenecen a la clase de proteinasas ácidas como las catepsinas , las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y las gelatinasas y son activas a pH ácido . Además, la actividad de enzimas intracelulares como la γ-secretasa, que son activas a pH ácido, también se ve potenciada con el aumento de la actividad de la V-ATPasa en las vesículas . Posteriormente, esto conduce a la desregulación de vías oncogénicas como Notch.

Resistencia a los fármacos e inhibidores de la V-ATPasa

La alteración del pH del microambiente tumoral puede influir en la sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos . Las antraciclinas y los alcaloides tienen un pKa de 7 a 8 y se internalizan en el compartimento endosomal. Datos recientes sugieren que el uso de inhibidores de la V-ATPasa no sólo provoca alteraciones del pH citosólico que conducen a la muerte celular, sino que también mejora la captación de fármacos, convirtiéndose así en un componente eficaz del tratamiento combinatorio contra el cáncer. En el cáncer de ovario, la a2V se expresa en el borde delantero de las células cancerosas y modula la actividad de la MMP9. Además, a2V contribuye a la resistencia a los fármacos mediada por el cisplatino en el cáncer de ovario y la inhibición selectiva de a2V podría servir como una estrategia eficaz para tratar el cáncer de ovario quimiorresistente. Los inhibidores de la V-ATPasa, bafilomicina y concanamicina, pertenecen a una clase de pleomacrólidos que se dirigen al sector de la VO e inhiben eficazmente la actividad de la V-ATPasa. Recientemente, se ha informado de que el apiculareno y los archazólidos son inhibidores potentes y específicos de la V-ATPasa. Sin embargo, todos los inhibidores de moléculas pequeñas disponibles tienen una toxicidad significativa teniendo en cuenta la implicación de la V-ATPasa en la fisiología celular normal . Por lo tanto, el desarrollo de anticuerpos neutralizantes específicos contra la isoforma de la subunidad «a», que tiene una expresión específica en las células, podría ser una alternativa eficaz para provocar la inhibición directa de la V-ATPasa y, al mismo tiempo, abordar la resistencia a múltiples fármacos de forma indirecta con el uso combinatorio.

Autofagia

La autofagia es el proceso de degradación o reciclaje selectivo de las cargas entregadas por los autofagosomas a los lisosomas. Las células tumorales muestran una dependencia variada de la autofagia a medida que progresan desde el tumor primario hasta el tumor sólido altamente metastásico . Las cargas celulares marcadas para su degradación son entregadas a los lisosomas mediante procesos autofágicos. La actividad de bombeo de protones de la V-ATPasa es responsable de la activación de las hidrolasas ácidas lisosomales que degradan la carga captada por los autofagosomas . Aunque los estudios apuntan a la necesidad de una V-ATPasa funcional para la autofagia y el inhibidor de la V-ATPasa, la bafilomicina, se utiliza como inhibidor clásico de la autofagia, no se conoce el papel exacto de la V-ATPasa en la dinámica de la membrana del flujo autofágico. Un estudio reciente informó de que el tratamiento con bafilomicina, que inhibe la actividad tanto de la V-ATPasa como de la bomba de Ca2+ SERCA, condujo al bloqueo del flujo autofágico, mientras que los lisosomas deficientes en V-ATPasa seguían siendo capaces de fusionarse con los autofagosomas. Estos resultados sugieren la implicación de la V_ATPasa en la degradación de la carga autofágica en los lisosomas que en el flujo autofágico y destacan la necesidad de desarrollar inhibidores específicos y técnicas de manipulación genética para estudiar el papel exacto de la V-ATPasa en varios procesos celulares importantes.

Señalización

La vía endolisosomal es importante para la regulación tanto positiva como negativa de las vías de señalización . El primer informe conocido sobre la implicación de la V-ATPasa en la señalización provino de un estudio que mostraba que la inhibición de la V-ATPasa por la bafilomicina afectaba a la internalización del EGFR . Desde entonces, la V-ATPasa se ha relacionado con la transducción de señales asociada a la regulación de m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β y Notch Signaling.

Señalización Notch

Quizás la vía de señalización más estudiada y regulada por la V-ATPasa sea Notch. Esto puede atribuirse al hecho de que la señalización Notch depende de la vía endolisosomal para su activación, mantenimiento y degradación de los mediadores clave de la vía . La V-ATPasa mantiene el equilibrio del pH celular y desempeña un papel importante en la endocitosis, la activación de proteasas y la degradación de proteínas. En concreto, a2V (subunidad de la V-ATPasa- VOa2) se localizó previamente en los endosomas tempranos, el lugar de endocitosis del receptor. Tras la unión del ligando, el receptor Notch toma la ruta endocítica y es escindido por proteasas para su activación. Posteriormente, los receptores se degradan en el lisosoma . En Drososphila, las mutaciones en Vps25, un componente de la maquinaria ESCRT que regula la clasificación endosomal de los receptores de señalización, provoca la acumulación del receptor Notch en los endosomas y potencia la señalización Notch . En un estudio en el que se analizan mutaciones en Hrs, otro componente de ESCRT, Notch se acumula en los endosomas pero no causa una activación ectópica de la señalización Notch . La pérdida de autofagia conduce a la activación de la señalización Notch en las células del folículo ovárico de Drosophila debido a la interrupción de la degradación de Notch . Contrariamente a estos informes, un estudio independiente encontró que las mutaciones en Rabconnection-3 interrumpen la actividad de bombeo de protones de la V-ATPasa y acumulan Notch en endosomas tardíos después de la escisión S2, reduciendo así la señalización de Notch en Drosophila y células de mamífero . Estos hallazgos fueron seguidos por informes en Drosophila indicando además que a través de la acidificación de la vía endolisosomal, la V-ATPasa es necesaria para la activación de Notch en los endosomas así como para la degradación de Notch en los lisosomas . Durante el desarrollo de los mamíferos, la expresión de una subunidad negativa dominante de la V-ATPasa en los precursores neurales redujo la señalización de Notch y agotó las células madre neurales, lo que condujo a la diferenciación neuronal. Recientemente, estudios en astrocitos de la retina de ratas mutadas en Nuc1 demostraron que la señalización Notch estaba desregulada. La reducción de la señalización de Notch se debió a la mutación de la βA3/A1-cristalina, que regula la actividad de la V-ATPasa, lo que provoca un deterioro de la acidificación endosomal y de la actividad de la γ-secretasa, afectando así a la tasa de procesamiento del receptor Notch. Se trata de un hallazgo interesante si se tiene en cuenta que el papel de la V-ATPasa en la visión está emergiendo en la actualidad. En conjunto, estos hallazgos indican que la regulación de la señalización Notch por parte de la V-ATPasa puede tener resultados tanto positivos como negativos dependiendo de la localización celular de la actividad V-ATPasa afectada (endosomas frente a lisosomas) y de la dependencia del procesamiento del receptor Notch en la vía endosomal . Aunque la interrelación entre la V-ATPasa y Notch se ha investigado en el contexto de la acidificación endolisosomal dependiente de la V-ATPasa que afecta a la señalización de Notch, un informe reciente sugiere que la regulación también podría ser viceversa. En concreto, los autores sugieren que Presinilin1 (PS1), un componente del complejo enzimático γ-secretasa responsable de la escisión del receptor Notch y del péptido β-amiloide, interactúa físicamente con la isoforma VOa1 de la V-ATPasa y la dirige desde el retículo endoplásmico a los lisosomas. Nuestros estudios han identificado que la V-ATPasa regula la señalización Notch en el cáncer de mama y en el desarrollo de la glándula mamaria . a2V se expresa en la superficie de las células epiteliales mamarias en proliferación y en las células de cáncer de mama triple negativo (TNBC), lo que indica su papel en la proliferación celular durante el desarrollo normal y la enfermedad. En el TNBC, la inhibición de a2V aumenta la señalización Notch mediante el bloqueo de la degradación lisosomal y autofágica del receptor Notch. La pérdida de a2V en la glándula mamaria del ratón conduce a una activación anormal de Notch y deteriora la morfogénesis ductal, causando defectos de lactancia . La señalización Notch se activa durante el parto prematuro inducido por la infección con PGN + poli (I:C), lo que da lugar a la regulación de las respuestas proinflamatorias, y su inhibición mejora la supervivencia intrauterina de los fetos vivos. Además, en el parto prematuro inducido por la respuesta inflamatoria a la inyección de LPS, se observó una regulación al alza de la inflamación relacionada con Notch y una regulación a la baja de los factores de angiogénesis. Tanto en los modelos de infección como en los de parto prematuro inflamatorio, pudimos rescatar el fenotipo mediante el tratamiento con inhibidores de la γ-secretasa (GSI). Esto allana el camino para una importante dirección futura, especialmente porque GSI es un eficiente inhibidor de la señalización Notch y está actualmente en ensayos clínicos para varios cánceres. De este modo, la interacción entre la V-ATPasa y Notch resulta ser importante durante el desarrollo normal y en enfermedades como el Alzheimer y varios tipos de cáncer. En los seres humanos, la desregulación de la señalización Wnt se ha implicado en el cáncer . Un ejemplo clásico de desregulación de la señalización Wnt es el cáncer colorrectal, en el que la pérdida de Adenomatous Polyposis Coli (APC), un regulador negativo de la señalización Wnt, desencadena la tumorigénesis. Durante la señalización, los ligandos Wnt actúan sobre las células diana uniéndose a Frizzed, Fz y LRP (lipoproteína de baja densidad), un complejo de receptores de la superficie celular que conduce a la desintegración de la Glucógeno Sintasa Kinasa (GSK-3) y a la posterior liberación de β-catenina. La β-catenina es el principal mediador descendente de la vía Wnt, que activa genes oncogénicos diana de Wnt como c myc y ciclinaD1 . El (P) RR, Receptor de Pro Renina también llamado ATP6ap2 actúa como una molécula adaptadora entre la V-ATPasa y el complejo receptor Wnt LRP 5/6 . En Xenopus y Drosophila, se ha demostrado que la V-ATPasa interactúa con el complejo de receptores LRP 5/6 y que tanto el knockdown genético como la inhibición farmacológica de la V-ATPasa interfieren en la transducción de señales y reducen significativamente la respuesta celular a la señalización Wnt . Además, se ha demostrado que la V-ATPasa regula indirectamente el mediador de la señalización Wnt β-catenina y el mediador Notch NICD a través de la autofagia.

Señalización TGF-β

Las mutaciones en el gen a2V causan el síndrome autosómico recesivo de Cutis Laxa (ACL), en el que los pacientes presentan una cantidad reducida de proteínas de la matriz extracelular, como el colágeno, lo que da lugar a un fenotipo de piel arrugada. En apoyo de estos hallazgos, una investigación mecánica de las mutaciones responsables de la cutis laxa en humanos identificó que la mutación a2P405L es inestable y defectuosa en el tráfico de golgi en comparación con el tipo salvaje. Además, los informes apuntan a un defecto de glicosilación en el LCA que da lugar a una elevada promoción de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) en estos pacientes con mutaciones en a2V . La V-ATPasa promueve la transición epitelial-mesenquimal inducida por el TGF-β en las células epiteliales tubulares proximales de rata . Además de su efecto sobre la señalización Notch, la inhibición de a2V activó la vía Wnt en el TNBC y la vía TGF-β en las células epiteliales mamarias . Esto sugiere que el papel de a2V en la modulación de los mediadores de señalización no es exclusivo de Notch. Además, estos ratones también mostraron una reducción del colágeno total debido a la alteración de la glicosilación.

Señalización mTOR

En la señalización mTOR, la serina treonina quinasa mTOR y otros componentes del complejo mTOR 1 (mTORC1) detectan la disponibilidad de aminoácidos estrés celular, y modulan el crecimiento .Tras la estimulación de aminoácidos, la V-ATPasa activa la actividad del Factor de Intercambio de Guanina (GEF) de Ragulator hacia RagA, que a su vez promueve la hidrólisis de GTP de RagC. El RagA unido a GTP y el RagC cargado de GDP reclutan juntos a mTORC1 a la superficie lisosomal . La activación de mTORC1 responde a la señalización del factor de crecimiento y controla el cambio de regulación de la muerte celular a la proliferación. Un informe reciente sugiere la implicación del regulador de la bomba de protones de los osteoclastos Atp6v1c1 en la potenciación del crecimiento del cáncer de mama mediante la activación de la vía mTORC1 y la metástasis ósea mediante el aumento de la actividad de la V-ATPasa .