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Abstract

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune. El veneno de avispa (VV), que se considera una medicina popular tradicional en la nacionalidad Jingpo en Yunnan, China, alivia la artritis reumatoide. El presente estudio tenía como objetivo investigar el efecto del veneno de avispa para mejorar los síntomas de la artritis reumatoide en ratas experimentales. Se estableció un modelo de artritis inducida por colágeno tipo II (CII) en ratas SD y se examinó la inhibición de la inflamación y la respuesta autoinmune. Los efectos antiartríticos de la VM se evaluaron a través de la hinchazón de la pata, y se valoraron la puntuación histopatológica y los cambios en la histopatología de la pata afectada. Los efectos antiinflamatorios se evaluaron mediante el nivel de IL-6, TNF-α, IL-1β y el número de células inflamatorias en la sangre periférica. La alteración de la proporción de subconjuntos de células T en el bazo de las ratas se detectó mediante citometría de flujo y, al mismo tiempo, se evaluaron el índice de vísceras y los niveles de inmunoglobulina sérica. Los resultados sugirieron que varias dosis de VM (0,125, 0,25 y 0,5 mg/kg) aliviaron significativamente la hinchazón de las patas y la puntuación de la artritis en ratas con CIA con el control no tratado (). La VM (0,25 y 0,5 mg/kg) alivió las lesiones del tejido sinovial de las articulaciones del tobillo y las puntuaciones histopatológicas de hiperplasia sinovial e infiltración de células inflamatorias con el grupo del vehículo (). En lo que respecta a la regulación inmunológica, 0,5 mg/kg de VM redujeron los niveles de inmunoglobulina sérica (), y además descubrimos que la VM (0,5 mg/kg) suprimía la respuesta inmunitaria de las células Th, mientras que potenciaba notablemente las funciones de las células Tc y Treg en las células del bazo (). La acción inmunosupresora de la VM mostrada fue análoga a su efecto inhibidor de los niveles de IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 y PGE2 en el suero de rata. En conclusión, estos resultados demostraron que la VM exhibió una actividad antiartrítica, que podría estar asociada a sus efectos inhibitorios sobre la inmunorregulación y la acción antiinflamatoria.

1. Introducción

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune crónica que puede progresar hacia complicaciones sistémicas, discapacidades físicas e incluso la muerte temprana . La hiperplasia de las células sinoviales, la inflamación crónica de la membrana sinovial y la destrucción del cartílago y el hueso son las principales características de la AR. Además, los efectos sinérgicos de las células T, las células B y las citoquinas proinflamatorias también desempeñan un papel clave en el proceso fisiopatológico. Cuando las células T CD4+ se activan, producen citoquinas proinflamatorias que potencian la respuesta inmunitaria estimulando otras células mononucleares, fibroblastos sinoviales, condrocitos y osteoclastos. La liberación de estas citocinas proinflamatorias, especialmente el TNF-α, la IL-6 y la IL-1β, puede contribuir a la sinovitis.

Actualmente, los fármacos de tratamiento clínico utilizados para tratar la AR se centran principalmente en la reducción de los mediadores inflamatorios, como los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) y los agentes biológicos. Por ejemplo, el metotrexato (MTX), análogo del folato, como AINE, fue aprobado por la FDA para la AR en 1988 . Además, se ha convertido en el más utilizado en el tratamiento de la AR debido a su actividad inmunosupresora, su efecto antiinflamatorio y su bajo coste . Sin embargo, el MTX no es un agente terapéutico ideal por sus efectos secundarios no deseados sobre el sistema neuronal, gastrointestinal e inmunitario, al igual que otros fármacos . Por ello, un número creciente de personas busca nuevas alternativas para hacer frente a la ineficacia y seguridad de estos fármacos. En la teoría de la medicina tradicional china (MTC), la AR se considera un síndrome de artralgia («Bi Zheng» en la MTC), posiblemente causado por el viento exógeno, la humedad y los patógenos del calor o el frío . La aplicación de la MTC en la prevención y el tratamiento de enfermedades tiene una historia de varios siglos, con una importancia creciente en el tratamiento de la AR atribuida a su notable eficacia pero con menos efectos secundarios y costes.

La terapia con veneno, como enfoque de medicina complementaria y alternativa, se ha utilizado durante varios siglos para tratar el dolor, la inflamación y la artritis en la medicina popular. Ya en el periodo de los Estados Guerreros, el Canon Interior del Emperador Amarillo («Huangdi Neijing» en chino) recoge que «la picadura de abeja es terapéutica a pesar del riesgo tóxico que conlleva». Según la investigación médica moderna, el veneno de abeja (BV) presenta efectos antiartríticos, antiinflamatorios y analgésicos atribuibles a la activación del inhibidor central y a la modulación del sistema inmunitario a través de múltiples mecanismos . Varios ensayos clínicos también han demostrado que el VB podría mejorar los síntomas relacionados con la artritis.

El veneno de avispa contiene una variedad de constituyentes biológicamente activos, incluyendo aminas biogénicas, sustancias de alta masa molecular (como enzimas, alérgenos y péptidos bioactivos) y toxinas de poliamina. El veneno de avispa ha mostrado varios efectos farmacológicos en el tratamiento del dolor, las enfermedades inflamatorias y las enfermedades neurodegenerativas. Vespa magnifica (Smith) es una especie de avispa social que se encuentra en Yunnan, China. En los últimos años, se han separado de su veneno muchos compuestos con actividades anticoagulantes, antiplaquetarias, antiinflamatorias e inmunosupresoras . Basándose en su notable efecto sobre la artritis reumatoide, se ha convertido en un hábito ampliamente utilizado en Jingpo, una minoría nacional china . Sin embargo, por lo que sabemos, sólo ha habido unos pocos informes sobre las acciones antirreumáticas del veneno de avispa.

En el presente trabajo, se adoptó el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) para reproducir de cerca la patogénesis de la AR. Los cambios en el volumen de la pata se han utilizado clásicamente para evaluar los efectos antiinflamatorios en la AR como es habitual . Además, se evaluó el efecto de WV (veneno de avispa de Vespa magnifica) en el mismo modelo. Por último, se observó la eficacia de WV en la antiinflamación y la inmunomodulación mediante tinción H&E del tejido articular, citometría de flujo de subconjuntos de células T en el bazo, así como ELISA de IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 y factores reumatoides (IgG, IgA e IgM) en suero.

2. Materiales y métodos

2.1. Animales experimentales

Las ratas SD macho (60 ratas, 180-220 g) se obtuvieron de Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co. Los animales se alojaron en jaulas estándar de polipropileno forradas con cáscara cruda (renovada después de 48 h). El establo se mantuvo con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, a una temperatura aproximada de 22 ± 2°C y una humedad relativa del 60-70%, y los animales tuvieron libre acceso al agua y al pienso estándar. Las ratas fueron asignadas al azar a 8 controles y 52 modelos, y luego se permitió un período mínimo de 7 d para la adaptación en cada experimento. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Institutos Nacionales de Salud) y fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Dali.

2.2. Las ratas fueron desinfectadas con alcohol e inyectadas por vía subcutánea en la parte derecha de la espalda y la cola con 1 mg/ml de CCII (colágeno de pollo tipo II) para la primera inmunización, que se compone de CCII (C9301, Sigma) emulsionado 1:1 con adyuvante de Freund incompleto (F5506, Sigma). El día de inducción se designó como día 0. La dosis de refuerzo se inyectó de nuevo en el abdomen, la espalda y la cola junto con 1 ml de emulsionante CCII el día 8. La pata inyectada se definió como la pata inflamatoria, mientras que la otra pata sin inyección se anotó como la pata secundaria. A continuación, las ratas con artritis inducida por colágeno (CIA) fueron tratadas el día 14 y finalizaron el día 28. Tras la aparición de la CIA, las ratas modelo se dividieron aleatoriamente en cinco grupos según las puntuaciones clínicas. Grupo I: grupo modelo que recibió una inyección hipodérmica (1 ml/kg) de solución salina normal como vehículo. Grupos II-IV: las ratas de la CIA recibieron una inyección hipodérmica de 0,125, 0,25 y 0,5 mg/kg de VM (veneno de avispa, de Vespa magnifica (Smith) de Yunnan, China, polvo liofilizado a partir del exudado de las glándulas de la cola de las avispas, diluido con solución salina normal), respectivamente, como grupos de tratamiento. Grupo V: el grupo de control positivo recibió TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nº 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) de 9 mg/kg de la misma manera. Simultáneamente, se administró el mismo volumen de solución salina normal sola a las ratas normales del grupo de control. A todas las ratas anteriores se les administró diariamente durante 14 días.

2.3. Evaluación básica de la artritis experimental

La gravedad de la CIA se evaluó periódicamente sobre la base de la hinchazón de las patas y las puntuaciones de la artritis. Se pesó a las ratas en los días 0-28 del estudio, y se midió por separado el grosor y el perímetro de los tobillos de la pata inflamada (la pata derecha) y de la pata secundaria (la pata izquierda) mediante un calibre de vernier y una cinta adhesiva en los días 0, 14 y 28. La puntuación de la artritis se evaluó sobre la base de observaciones independientes de tres estudiosos. Cada pata se puntuó en una escala de 0 a 4, lo que significa que la puntuación total máxima para ambas articulaciones de la pata trasera fue de 8. Los criterios de evaluación fueron los siguientes 0 = sin edema ni cambios visuales; 1 = edema leve y eritema limitado; 2 = edema leve y eritema; 3 = edema evidente y eritema significativo; y 4 = edema grave y eritema extenso . En el día 28, los animales fueron sacrificados y, a continuación, se recogió el suero y las articulaciones del tobillo secundarias y se procesaron para su posterior análisis.

2.4. Histopatología de las articulaciones del tobillo

Las extremidades posteriores izquierdas sin sacrificar los tejidos vecinos se lavaron inmediatamente con PBS durante 2-3 veces, se fijaron con formalina al 10% durante 48 h y se descalcificaron con ácido nítrico al 5% durante 24 h hasta que la corteza ósea se recorrió fácilmente con una punta de aguja. Las muestras se incrustaron en secciones de parafina y se cortaron en rodajas (5 μm) para la tinción rutinaria de hematoxilina-eosina (H&E). Los cambios patológicos de las articulaciones se detectaron con un microscopio de luz (Olympus, Japón) y se fotografiaron. Las imágenes se tomaron con aumentos de 200x. También se detectaron los cambios en la hiperplasia sinoviocitaria y la infiltración de células inflamatorias. Los cambios histopatológicos se puntuaron, respectivamente, utilizando los siguientes criterios 0 = sin cambios detectables; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave.

2,5 Análisis del índice de vísceras

Las ratas fueron sacrificadas y se resecaron el hígado, el bazo y el timo completos con el tejido adiposo y la fascia circundantes cuidadosamente separados. La masa húmeda del hígado, el bazo y el timo se midió con una balanza electrónica, y el índice de vísceras (que incluye el índice del hígado, el índice del bazo y el índice del timo) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula Índice de vísceras = masa del órgano (mg)/masa corporal (g) × 100%.

2,6. ELISA de los índices bioquímicos del suero

Se recogió el suero de las ratas experimentales y se detectaron las concentraciones de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 y PGE2 mediante kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) (Nanjing JianCheng, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los kits ELISA para detectar los niveles de expresión de IgA (ERC015), IgG (ERC016) e IgM (ERC017) se adquirieron de NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, China.

2.7. Citometría de flujo del bazo con artritis

El número de subconjuntos de células T se detectó mediante citometría de flujo. Los linfocitos se cosecharon a partir de células de bazo de rata, que se homogeneizaron pasando por un tamiz de nylon de 200 mallas. Las células se filtraron en tampón PBS que contenía un 10% de suero bovino fetal. La concentración celular se ajustó a unos 2 × 106/ml, y se añadieron 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (Solarbio, China) para disolverlos durante menos de 5 minutos. A continuación, las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, se lavaron dos veces con tampón FBS-PBS que contenía un 10% de suero bovino fetal y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min. Cada 100 μL de suspensión celular se colocó en tubos de centrífuga. A los linfocitos se les realizó una tinción con anti-CD3-FITC (nº 557354; BD, EE.UU.), anti-CD4-APC (nº 565432; BD, EE.UU.), anti-CD8-PerCP (nº 558824; BD, EE.UU.) y anti-CD25-PE (nº 554866; BD, EE.UU.). Los anticuerpos monoclonales se añadieron a cada tubo, se volvieron a mezclar y se dejaron en hielo durante 30 minutos. Se añadió el tampón FBS-PBS (1 ml) a cada tubo de muestra y se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos, y se abandonó el sobrenadante. El paso anterior se repitió dos veces para que las células sin unión a los anticuerpos monoclonales se eluyeran completamente. Las células experimentales se mezclaron con 500 μL de tampón FBS-PBS. Las proporciones de células T CD25+/CD4+ y CD4+/CD8+ se determinaron utilizando un citómetro de flujo FACS Canto (BD, EE.UU.) .

2,8. Análisis estadísticos

Los datos se analizaron estadísticamente utilizando SPSS10.0. Los datos se presentaron como media ± desviación estándar de la media (S.D.M). La significación de las diferencias entre cada grupo se analizó mediante un ANOVA de una vía seguido de una prueba de Tukey. En particular, la puntuación de la artritis y la puntuación histopatológica se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Los valores de se consideraron estadísticamente significativos.

3. Resultados

3.1. WV alivió el síntoma de artritis en ratas con CIA

Los síntomas artríticos se indujeron con éxito en las ratas mediante la inyección de colágeno de tipo II según las instrucciones, lo que se plasmó en signos macroscópicos significativos de enrojecimiento e hinchazón graves en la pata secundaria y la articulación del tobillo de las ratas con CIA en la Figura1(a), si se compara con el grupo de control sano. El grosor y el perímetro de la articulación del tobillo estaban aparentemente aumentados en los vehículos en el día 14 (Figura 1(b)) en comparación con los de los controles; sin embargo, disminuyeron notablemente después de TwHF y en todos los grupos tratados con VM en el día 28 en comparación con los del grupo modelo (todos ) (Figura 1(b)). Cuando medimos el grosor y el perímetro de las articulaciones del tobillo tanto en el pie inflamado como en el pie secundario, se demostró el evidente descenso de la hinchazón según los datos (Figura 1(b)). Los resultados del grado de hinchazón indicaron que la VM podía controlar el edema de la pata y aliviar la inflamación secundaria en la pata y la articulación del tobillo correspondiente al efecto TwHF.

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Además, la puntuación de la artritis se redujo con diversos grados a través del tratamiento de VM dependiendo de la cantidad de dosis como se muestra en la Figura 1(c). La puntuación de artritis del grupo del vehículo fue de 6,5 ± 1,0 el día 14 (frente al día 0, ). El índice disminuyó significativamente en el grupo tratado con TwHF el día 28, mostrando 2,8 ± 0,8 (frente al día 14, ). Del mismo modo, la disminución de los índices por parte de la VM fue significativa y dependiente de la dosis (3,2 ± 0,6 a 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 a 0,25 mg/kg y 5,6 ± 0,7 a 0,125 mg/kg) (severamente frente a los 14 días, ). Esto indicó que la potencia de la VM a 0,5 mg/kg era proporcional a la del grupo tratado con TwHF.

3.2. WV alivió los cambios patológicos de las articulaciones en las ratas de la CIA

H&E (Figura 2(a)) mostró que la membrana sinovial de las articulaciones del tobillo de las ratas de control tenía una disposición celular regular, sin hiperplasia de sinoviocitos, infiltración de células inflamatorias y una superficie cartilaginosa lisa. En comparación, la arquitectura histológica de las articulaciones de las ratas del grupo del vehículo era marcadamente anormal, con infiltración de células inmunitarias, hiperplasia de sinoviocitos, mayor número de vasos y erosión del cartílago y el hueso. Las articulaciones de los grupos TwHF y WV se atenuaron significativamente respecto a las del grupo vehículo y se acercaron a las del grupo control. Las puntuaciones histopatológicas (Figura 2(b)) indicaban (grupo vehículo) la anormalidad de las células de revestimiento sinovial y la infiltración de células inflamatorias en las articulaciones artríticas; los tratamientos con TwHF y WV redujeron significativamente la puntuación histopatológica media y restauraron el cartílago en comparación con el grupo vehículo ().

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Figura 2

Efectos de la VM sobre la progresión de la artritis y la histología de las articulaciones en ratas con CIA. (a) Histopatología de secciones de tejido articular de ratas con CIA tratadas con diferentes dosis de VM y TwHF y ratas normales mediante tinción de H&E. Aumento original ×200. a, destrucción ósea; b, infiltración de células inmunitarias; c, sinovia hipertrófica. (b) Puntuaciones histopatológicas de hiperplasia sinovial e infiltración de células inflamatorias en todos los grupos. (c) Efectos de la VM en las vísceras, en comparación con el grupo de control; (d) Efectos de la VM en las vísceras, en comparación con el grupo del vehículo. Efectos de WV sobre el índice de vísceras y los niveles de inmunoglobulina sérica en ratas con CIA

En comparación con el grupo de control, el índice hepático del grupo del vehículo disminuyó significativamente () y WV (0,25 y 0,5 mg/kg) aumentó notablemente (). En comparación con el grupo de control, el índice del bazo y el índice del timo del grupo del vehículo aumentaron notablemente (); TwHF y WV ejercieron un efecto inhibidor sobre ellos que se reflejó particularmente en el efecto de la dosis de 0,5 mg/kg de WV sobre el índice del timo (Figura 3(a)).

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Figura 3

Efectos de la VM sobre el índice de vísceras y los niveles de inmunoglobulina sérica en ratas con CIA. (a) Cambios en el índice de bazo, timo e hígado en todos los grupos. (b) Los niveles de expresión de IgG, IgA e IgM en el suero de todos los grupos. Los niveles de expresión de IgG, IgA e IgM en el suero de todos los grupos mejoraron drásticamente en las ratas de la CIA en comparación con el grupo de control, mientras que se redujeron tras el tratamiento con TwHF. Y los niveles de IgG en suero disminuyeron en el grupo de VM (0,5 mg/kg) en comparación con el grupo del vehículo (). Esta inhibición también se aplicó a la IgA y la IgM en los grupos de VM (0,25 y 0,5 mg/kg) (Figura 3(b)).

3.4. Efectos de WV en los subconjuntos de células T en el bazo de ratas con CIA

El número de células T CD4+ aumentó significativamente en los grupos con vehículo en comparación con el grupo de control (), mientras que los de los grupos con TwHF y WV (0,5 mg/kg) fueron significativamente menores que los del grupo con vehículo (Figura 4(a)). En comparación con el grupo de control, el número de células T CD4+CD25+ en el grupo del vehículo disminuyó significativamente (), mientras que aumentó significativamente en los grupos de TwHF y WV (0,5 mg/kg) (), pero no fue evidente en los demás grupos (Figura 4(a)). En comparación con el grupo de control, la reducción en el grupo del vehículo del número de células T CD8+ fue notable, pero sólo WV (0,125 y 0,25 mg/kg) hizo que el número aumentara (, ) en la Figura 4(b).

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Figura 4

El número de subconjuntos de células T en las células del bazo por citometría de flujo. (a) Los resultados de FCM sobre el número de células Th y células Tc (izquierda); los resultados de FCM sobre el número de células Treg (derecha). (b) El gráfico de barras indica el efecto negativo de WV y TwHF en las células Th y el efecto positivo en las células Tc y Treg. (b) El gráfico de barras indica el efecto negativo de WV y TwHF sobre las células Th y el efecto positivo sobre las células Tc y las células Treg. Los kits de ELISA (Figura 5) mostraron que, en comparación con el grupo de control, los niveles séricos de IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 e IL-8 aumentaron significativamente en el grupo del vehículo y se restauraron notablemente con TwHF (9 mg/kg) y WV (0,5 mg/kg) (). Mientras tanto, las expresiones de IL-6 y PGE2 se suprimieron con dosis de 0,125 y 0,25 mg/kg de VM (). La VM (0,125 y 0,25 mg/kg) redujo igualmente la expresión de COX-2 e IL-8 en comparación con el vehículo (, ). Esto indicó que la inflamación inducida por la CCII probablemente mediaba los cambios patológicos observados en las ratas artríticas, y la VM podía aliviar la respuesta inflamatoria.

Figura 5

Efectos de WV en los niveles de IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 y COX-2 en el suero de las ratas CIA. En comparación con el grupo de control; en comparación con el grupo del vehículo.

4. Discusión

La AR es una enfermedad autoinmune crónica que se caracteriza por el dolor, la inflamación y la destrucción gradual de las articulaciones, lo que da lugar a la pérdida de la función . cAunque los comprimidos de metotrexato (MTX) están considerados como un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide, normalmente se asocian con reacciones adversas a los medicamentos (RAM). Por lo tanto, tratamos de evaluar si el veneno de avispa (WV) podría representar un posible fármaco alternativo para la AR.

El presente estudio fue el primero, hasta donde sabemos, en investigar el papel terapéutico del WV (de Vespa magnifica) en la artritis inducida por colágeno (CIA) inducida en ratas SD y comparado con el efecto clínicamente probado del TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), también conocido como Lei Gong Teng en la MTC, se ha utilizado para tratar la AR durante muchos años en China, y los extractos de TwHF han mostrado actividades antiinflamatorias e inmunosupresoras tanto en estudios in vivo como in vitro . Establecimos el modelo de ratas CIA durante 14 días y eliminamos 12 aparentes incompetencias que podrían haberse debido a fallos en la inyección de 52 ratas, es decir, las ratas CIA tenían una tasa de artritis del 77%. El grupo de control no mostró signos ni de edema ni de inflamación (Figuras 1 y 5), y nuestros resultados concuerdan con estudios anteriores sobre la AR y la CIA, que informaron de que el emulsionante CCII inducía la gravedad del edema y el daño inflamatorio en las articulaciones . A continuación, la mejora de los síntomas en el grupo WV (0,5 mg/kg) fue similar a la del fármaco positivo TwHF, del que se ha informado que inhibe la respuesta inflamatoria de la AR , pero el efecto de la dosis baja no fue significativo en la reducción de la inflamación y la inhibición de la IL-1β y el TNF-α (Figuras 1 y 5). Además, observamos que las ratas del grupo del vehículo tenían un pelaje más áspero y un estado mental más pobre que las del grupo de control; estas condiciones habían mejorado en el grupo de tratamiento.

Para evaluar más a fondo la eficacia terapéutica de la VM, se realizó la tinción H&E en muestras de tejido de las articulaciones del tobillo izquierdo para analizar la característica patológica, y encontramos que las células sinoviales causan inflamación, proliferación e invasión del cartílago y el hueso localizados en el grupo del vehículo (Figura 2), y estos cambios macroscópicos son consistentes con informes anteriores. Además, el tratamiento con TwHF y WV durante 14 días redujo significativamente la hiperplasia de células sinoviales y la infiltración de células inflamatorias en comparación con el grupo no tratado (Figura 2). La sinovitis crónica es la base patológica de la AR. La inflamación sinovial se debe a una compleja interacción entre los sinoviocitos y las células infiltrantes de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Por lo tanto, en este experimento se calculó el índice visceral de órganos inmunitarios como el bazo y el timo. Cabe mencionar que no encontramos la diferencia significativa de peso entre el grupo del vehículo y el del tratamiento; por lo tanto, utilizamos el índice visceral representativo para reflejar la salud general de las ratas. Descubrimos que el TwHF y el WV podían disminuir el aumento del índice visceral del bazo y el timo en las ratas de la CIA (Figura 3(a)); esto podría reflejar su papel en el alivio de la mejora inmunológica causada por la AR. También observamos el cambio en el índice hepático durante este proceso; nuestros resultados mostraron que el TwHF no revivió el índice hepático aunque su tratamiento fue eficaz, lo que nos recordó su toxicidad para el hígado en el informe anterior . Afortunadamente, esto no se encontró en el grupo WV (Figura 3(a)). A excepción de la disminución del índice hepático en el grupo del vehículo y del TwHF, no se observaron efectos secundarios en estas ratas, lo que podría deberse a la baja dosis que utilizamos. Además, también detectamos factores reumatoides (FR), como marcador diagnóstico de la AR, que incluye principalmente los isotipos IgG, IgA e IgM; tiene una alta tasa de detección en pacientes con AR . En este estudio se observó que las ratas de la CIA no tratadas tenían niveles significativamente más altos de anticuerpos IgG, IgA e IgM en el suero que las de los grupos TwHF y WV (figura 3(b)); estos resultados concordaban bien con los datos clínicos comunicados. Por lo tanto, se observó que el TwHF y la VM (0,5 mg/kg) podían reducir la respuesta autoinmune excesiva de las ratas con CIA a un nivel cercano al normal. Por el contrario, el efecto de la VM (0,125 y 0,25 mg/kg) no fue evidente, mientras que queda por ver si una dosis más alta mejorará el efecto en lugar de actuar como un veneno, por lo que todavía nos centramos en estas tres dosis para explorar el efecto de la VM en la AR en este experimento.

Investigaciones anteriores han demostrado que la inflamación sinovial recluta y activa las células inmunes mediante la producción de mediadores, y las células T desempeñan papeles vitales en la regulación de la AR . En cuanto a las funciones de las citocinas proinflamatorias en la autoinmunidad, es esencial considerar el equilibrio entre los diferentes subconjuntos de células T, divididos principalmente en dos hipotipos según su función y fenotipos: Las células T auxiliares (Th) CD4+ y las células T citotóxicas (Tc) CD8+. Las células Th y las células Tc, caracterizadas por la producción de diversas citoquinas específicas, facilitan la respuesta inmunitaria adaptativa . En cambio, las células T CD4+CD25+ (Treg) tienen una función fundamental en el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria al controlar las respuestas inflamatorias y suprimir la actividad de las células inmunitarias antes mencionadas . En este estudio, encontramos una gran concentración de células Th y Tc en las células esplénicas y también observamos un deterioro de la función de las células Treg en las ratas con CIA. Afortunadamente, el equilibrio entre los subconjuntos de células T quedó protegido con el tratamiento con TwHF y WV (Figura 4). Cabe destacar que la acumulación de células inmunitarias es el promotor de la inflamación local de las articulaciones, y las células inmunitarias activadas liberan una gran cantidad de citoquinas proinflamatorias, que luego inducen la activación y proliferación de las células sinoviales y agravan aún más la progresión de la inflamación articular . Estudios anteriores han demostrado que la IL-6 es la citoquina más dominante en la patogénesis de la AR , y se han encontrado cantidades excesivas de IL-1β, así como de TNF-α e IL-8, en el líquido sinovial de los pacientes con AR . La producción de COX-2 y PGE2 tras la estimulación con IL-1β también ha aumentado, y su bloqueo alivió significativamente los síntomas de la AR . En nuestros resultados experimentales se observaron hallazgos similares, y confirmamos que el TwHF y la VM (0,5 mg/kg) podían reducir eficazmente los niveles de IL-6, IL-8, PGE2 y COX-2; también se suprimió el aumento de las concentraciones de IL-1β y TNF-α inducido por la AR, excepto en los grupos de VM (0,125 y 0.25 mg/kg) (Figura 5).

Estos resultados sugieren que la VM tiene las funciones de aliviar la hinchazón articular, inhibir la inflamación sinovial, suprimir la respuesta inmunitaria excesiva y proteger la homeostasis inmunitaria, lo que puede mejorar los síntomas y convertirse en remedios eficaces para la AR. Se ha informado de que el veneno de avispa contiene una serie de moléculas bioactivas, entre las que se encuentran aminas, pequeños péptidos e incluso enzimas, alérgenos y toxinas de alta masa molecular. Lo que hace a la VM diferente de la VB es que la VB tiene principalmente efectos antiinflamatorios, antioxidantes y analgésicos sobre la AR, y contiene una variedad de péptidos diferentes, incluyendo la melitina, la fosfolipasa A2, la apamina, etc. . Los mecanismos de tratamiento de la AR con estos dos venenos pueden ser diferentes y merecen un estudio más profundo. Aunque no se observaron efectos secundarios en el rango de 0,125 a 0,5 mg/kg de VM, es necesario seguir evaluando los principios activos y la seguridad del extracto de VM.

5. Conclusiones

El veneno de avispa alivió la hiperplasia sinovial y la destrucción del cartílago causadas por la CIA, posiblemente debido a la reducción del factor proinflamatorio y al efecto de inmunorregulación. Este estudio demostró que el veneno de avispa podría ser una alternativa terapéutica potencial para la AR. Además de ser una prescripción popular desde hace muchos años, el VM merece más estudios para ser descubierto, explorado y reconocido.

Disponibilidad de los datos

Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen dentro del artículo y pueden estar disponibles libremente.

Aprobación ética

El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Dali.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses en relación con la publicación de este trabajo.

Contribuciones de los autores

YG redactó el manuscrito y colaboró en la construcción y agrupación de los modelos animales. WXY y HL realizaron la tinción de H&E y la citometría de flujo. XMD y LLN se encargaron de los kits ELISA. ZBY, HRZ, y HX fueron los principales colaboradores en la redacción del manuscrito. ZBY y CGZ administrado y supervisado el proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Agradecimientos

Parte de este trabajo fue apoyado por el Centro de Innovación Colaborativa de Yunnan Provincial 2011 para Entomoceutics. El presente estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención núm. 81360679 y 81703742), la Investigación Básica Aplicada de Yunnan para Jóvenes Académicos (subvención núm. 2016FD074), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Yunnan (subvención núm. 2017FA050), y el Equipo de Innovación de la Universidad de Dali de Farmacéutica Avanzada de Biofarmacia Entomológica R&D (subvención nº ZKLX2019101).