Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. Para algunos ensayos enzimáticos, es posible medir el reactivo o el producto directamente basándose en sus propiedades de absorbancia Fersht (1999). En la reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), un producto (NADH) absorbe la luz a 340 nm, lo que permite monitorizar la reacción siguiendo el aumento de la absorbancia a esta longitud de onda.
Glucosa 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
En otros casos, un reactivo o producto se mide indirectamente. En el caso de la acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7), por ejemplo, se utiliza acetiltiocolina como sustrato que libera tiocolina al exponerse a la enzima. La tiocolina reacciona con el reactivo de Ellman para producir un producto coloreado, lo que permite monitorizar la reacción siguiendo el aumento de la absorbancia.
Acetiltiocolina + H2O → acetato + H+ + tiocolina
Tiocolina + reactivo de Ellman → derivado coloreado
A veces se utilizan ensayos acoplados para monitorizar la actividad enzimática. En este caso, la reacción enzimática de interés se empareja con una segunda reacción que se acopla para su cómoda medición. Un ejemplo de ello es el ensayo de la hexoquinasa (EC 2.7.1.1). En este caso, se incluye un exceso de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y NAD+ en la mezcla del ensayo y se monitoriza la absorbancia a 340 nm.
Reacción I: Glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP
Reacción II: Glucosa 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
En este ejemplo, la reacción I debería ser limitante de la velocidad y la concentración de glucosa 6-fosfato debería alcanzar un estado estacionario tras un periodo de retardo. Cleland Cleland (1979) formuló un procedimiento para asegurar que el ensayo acoplado está proporcionando una medida exacta de la velocidad de reacción de la enzima. Si es posible, es preferible monitorear una reacción continuamente. Con los ensayos descritos anteriormente, el espectrofotómetro puede programarse para dar una lectura continua en función del tiempo. En las técnicas de separación, que pueden incluir el uso de radiactividad, electroforesis o cromatografía, se emplean ensayos discontinuos o de punto final. Una vez establecido un período de tiempo lineal para un ensayo, se mide un parámetro en un único punto de tiempo dentro del período de tiempo lineal (preferiblemente, un punto de tiempo cercano a la mitad de la fase lineal). La velocidad se determina entonces a partir de la diferencia de la señal en ese punto de tiempo y en el inicio de la reacción. Hay que tener cuidado con los ensayos de punto final, y los cursos de tiempo deben comprobarse para confirmar la linealidad. Los cambios en las condiciones de incubación, como la temperatura, el pH o la concentración de sustrato, pueden alterar la linealidad de un ensayo. Para los ensayos enzimáticos de rutina, el recipiente de reacción contiene todos los componentes menos uno, y la reacción se inicia añadiendo el componente que falta (la enzima o uno de los sustratos). Los demás componentes deben estar equilibrados en términos de pH, temperatura y fuerza iónica. La reacción suele iniciarse añadiendo un pequeño volumen de una solución madre concentrada del componente que falta. Un pequeño volumen asegura que esta adición no perturbe las condiciones de equilibrio ya establecidas. Cuando no es posible añadir un pequeño componente, los componentes separados deben estar a la misma temperatura, fuerza iónica y p H. Aunque debe haber una mezcla completa de los dos componentes, debe evitarse la agitación vigorosa, ya que puede desnaturalizar la proteína enzimática. La mezcla puede realizarse invirtiendo un tubo con un tapón adjunto o una cubeta con un sello de Parafilm. Las proteínas diluidas suelen ser menos estables que las más concentradas, y los ensayos suelen realizarse en presencia de una proteína inerte, como la albúmina de suero bovino (0,25 mg/ml), para estabilizar la enzima purificada. Los experimentos deben realizarse para asegurar que la proteína es inerte. Dado que la albúmina, por ejemplo, puede unirse a sustratos hidrofóbicos, no siempre es apropiada para este propósito. En el caso de los ensayos discontinuos, se puede ajustar el temporizador y aspirar las muestras a intervalos de tiempo específicos después de la mezcla. En la mayoría de los espectrofotómetros, la detección se inicia manualmente mediante el panel del instrumento o el teclado del ordenador. Para añadir un componente a una cubeta, se necesitan unos 20 segundos para colocar la cubeta en un espectrofotómetro y comenzar la detección pulsando una tecla del ordenador. Este tiempo no suele ser de gran importancia, ya que para la mayoría de las reacciones, el ensayo se realiza entre 10 y 30 minutos. Las mediciones de control incluyen un blanco que no contiene enzimas y un blanco que no contiene sustrato. Estos controles garantizan que no se produzcan reacciones adventicias. La velocidad de control (blanco no enzimático) se resta de la fecha generada por el experimental para proporcionar la velocidad real de la reacción enzimática. Para muchos ensayos, es necesario apagar o detener la reacción en un momento específico para evitar que se siga produciendo producto. Por ejemplo, las muestras pueden tomarse a intervalos de 5 minutos durante un período de tiempo predeterminado y el producto se mide por HPLC.
Cada análisis cromatográfico puede tardar 30 minutos en completarse. Los métodos para terminar la reacción suelen implicar la desnaturalización de la enzima mediante la adición de ácido, o la inmersión en un baño de agua hirviendo. La actividad de algunas metaloenzimas puede apagarse con EDTA u otro quelante de iones metálicos. La mayoría de los ensayos enzimáticos se basan en técnicas espectroscópicas, siendo las dos más utilizadas la absorción y la fluorescencia Fersht (1999). La longitud de onda utilizada para seguir la velocidad de reacción debe ser la que produzca la mayor diferencia de absorción entre el sustrato y el producto. Las mediciones de absorción se realizan con un espectrofotómetro estándar con las muestras contenidas en cubetas especializadas, o cubetas. En el mercado existen cubetas de plástico desechables con capacidad para 1 ó 3 ml de muestra. Su uso está restringido al rango de longitudes de onda visibles (350-800 nm). Deben utilizarse cubetas de cuarzo (el vidrio y el plástico absorben la luz en el rango UV) para las mediciones a longitudes de onda inferiores a 350 nm. Las longitudes de recorrido de las cubetas las proporciona el fabricante. Las longitudes de recorrido más habituales son 1,00 cm, 0,40 cm y 0,20 cm. Un número creciente de ensayos se realiza con placas de microtitulación de 96 pocillos con fondos de plástico o de cuarzo. La concentración de una sustancia que absorbe la luz a longitudes de onda específicas puede determinarse a partir de la ley de Beer:
A = εcl,
donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda específica, c es la concentración de la muestra, l es la longitud del trayecto, y ε es el coeficiente de extinción, o absortividad molar. ε tiene las unidades de M-1 cm-1 o mM-1 cm-1. Si se conoce el valor de ε para una sustancia concreta, es posible calcular la concentración de esa sustancia en una solución midiendo su absorción en esa solución. Utilizando la ley de Beer, es posible calcular la tasa de cambio de la concentración durante el curso de una reacción. Un posible error al utilizar las mediciones de absorción se debe a una desviación de la ley de Beer, ya que ésta sólo es válida para un rango finito de valores de absorción. Así, dado que puede no ser aplicable con absorbancias superiores a 1, los ensayos deben diseñarse para mantener los valores experimentales por debajo de este valor. Es posible eludir algunos de estos problemas utilizando cubetas con longitudes de recorrido más cortas. Una muestra con una absorbencia de 1,00 en una cubeta de 1,00 cm de recorrido tendrá una absorbencia de 0,20 en una cubeta de 0,20 cm de recorrido. En general, trabajar con una absorbancia de alrededor de 0,5 representa un compromiso entre minimizar el ruido óptico inherente a un espectrofotómetro y tener una señal razonable para medir. La turbidez de una solución puede dispersar la luz y producir una absorbancia aparente. Se puede utilizar la filtración o la centrifugación para eliminar estas partículas. Aunque las alteraciones de la longitud del trayecto evitan algunas desviaciones de la linealidad (es decir, cuando la absorbancia es tan alta que el espectrofotómetro no puede hacer una medición precisa), frecuentemente las desviaciones se deben a las interacciones intermoleculares entre las especies absorbentes. La dimerización (o la formación de exímeros de orden superior) se produce a mayores concentraciones de las especies absorbentes. En estos casos, la ley de Beer se cumplirá si se disminuye la concentración de producto. Esto puede lograrse ralentizando la reacción (disminuyendo la concentración de enzimas) o realizando mediciones durante un periodo de tiempo más corto (antes de que se encuentren desviaciones de la ley de Beer).