La medicina de laboratorio ha hecho avances significativos en las últimas dos décadas. Los ensayos de carga viral han evolucionado desde los ensayos de PCR anidada hasta la amplificación mediada por transcripción y la PCR en tiempo real, y siguen evolucionando con métodos como la PCR digital. Este avance ha dado lugar a ensayos de carga viral más sensibles con un rango dinámico más amplio, lo que permite a los médicos una mejor comprensión de la respuesta de un paciente a la terapia y la progresión de la enfermedad.
Un ejemplo de mejora en la gestión de los pacientes con el avance de los diagnósticos moleculares ha sido la gestión de los pacientes con VIH-1. Según las directrices de tratamiento actuales, el éxito del tratamiento se define como una concentración de ARN del VIH-1 inferior a 75 copias/mL.1 La definición de fracaso del tratamiento varía según las directrices mundiales, nacionales y específicas de cada país, pero suele definirse como una concentración de ARN del VIH-1 entre 50-1000 copias/mL.1-3
Estos puntos de corte del tratamiento se encuentran en el extremo inferior del rango dinámico de los ensayos de PCR en tiempo real, donde la precisión y la reproducibilidad pueden verse afectadas. Los factores que podrían influir en el rendimiento del ensayo de carga viral son la plataforma automatizada, la química de extracción de ácidos nucleicos, la selección y el diseño del cebador/sonda de la PCR, las condiciones de amplificación de la PCR y la estrategia de calibración del ensayo. Aquí revisaremos diferentes enfoques de diseño y su impacto potencial en el rendimiento del ensayo y el resultado clínico. (Figura 1)
Proceso de extracción
A la hora de seleccionar la química de extracción se debe considerar cuidadosamente el tipo de muestra y el analito. Por ejemplo, en los casos de VIH-1, el Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS) aconseja que se utilice el ARN del VIH-1 como marcador de la viremia del VIH-1.1
La distinción entre el ARN del VIH-1 y el ADN proviral es importante, ya que este último no es un marcador de la replicación viral activa, sino de la liberación del reservorio latente del virus, que ya se ha integrado en las células. Una química de extracción que purifique tanto el ARN del VIH-1 como el ADN proviral no proporcionaría al médico una representación precisa de la verdadera replicación viral; por lo tanto, en el caso de este virus, sólo debe utilizarse la química de extracción que purifica específicamente el ARN del VIH-1 para excluir el ADN proviral de la cuantificación posterior.
Alternativamente, el uso de la química de extracción de ácido nucleico total (TNA) para la cuantificación del VIH-1 podría conducir potencialmente a resultados falsos positivos o a una cuantificación inexacta, lo que tendría efectos adversos en el tratamiento del paciente. La química de extracción de TNA puede utilizarse para tipos de muestras más difíciles, como la orina o las heces, o para ensayos que necesiten detectar objetivos de ARN/ADN.
Selección de objetivos
La extrema diversidad viral encontrada entre las cepas del VIH, el VHB y el VHC es de suma importancia para garantizar que las pruebas de diagnóstico molecular (MDx) den el resultado correcto, independientemente de la cepa o cepas presentes en una muestra.
Para hacer frente a esta preocupación, el diseño óptimo del ensayo debe comenzar con la selección de la diana del cebador/sonda en una región genéticamente conservadora donde la diversidad viral tendrá el menor impacto potencial. Las regiones genéticamente conservadoras sólo pueden determinarse comparando las secuencias de diversas cepas virales.
Para satisfacer esta necesidad, es fundamental un programa de vigilancia mundial que evalúe de forma exhaustiva la diversidad viral existente en circulación para las cepas del VIH, el VHB y el VHC.4 En un programa de vigilancia, las secuencias generadas a partir de cepas recogidas en regiones geográficamente diversas se utilizan para determinar qué regiones del genoma viral están mejor conservadas y son susceptibles de ser detectadas por una prueba de diagnóstico molecular. Al utilizar las secuencias virales circulantes para informar el diseño del ensayo, se reduce significativamente el riesgo de que las cepas no sean detectadas por una prueba.
Diseño de la sonda y condiciones de ciclado de la PCR
Además de la selección de la región diana, el diseño de la sonda y las condiciones de ciclado de la PCR son fundamentales para garantizar una cuantificación precisa de la carga viral. El diseño de la sonda debe ser tolerante a los polimorfismos que se producen de forma natural y, a su vez, a los posibles desajustes que puedan producirse dentro de la región diana dada. Con el tiempo, la tecnología de las sondas ha evolucionado, al igual que la metodología de la PCR. La amplia gama de aplicaciones MDx basadas en la tecnología PCR más allá de la cuantificación viral requiere la utilización de diferentes diseños de sonda. Las sondas de unión al surco menor se utilizan normalmente para el genotipado y la detección del polimorfismo de un solo nucleótido.
Las sondas TaqMan se utilizan a menudo en ensayos en los que las regiones objetivo tienen un alto grado de conservación. Las sondas parcialmente de doble cadena, que toleran mejor los altos niveles de heterogeneidad genética debido principalmente a la longitud de la sonda y a las condiciones de unión, se utilizan en áreas donde hay un alto grado de heterogeneidad.5
Además del diseño de la sonda, las condiciones de ciclado son a menudo objeto de optimización del diseño, con el fin de lograr el requisito de rendimiento (por ejemplo, la tolerancia de posibles desajustes.) El ciclado por fases es un enfoque que incorpora ciclos a una temperatura más baja para reducir la rigurosidad inicial, que es seguido por ciclos a altas temperaturas para preservar la especificidad. Este enfoque mitiga el efecto adverso sobre la cuantificación de la muestra de los posibles desajustes del cebador. En el caso de que sea difícil evitar el impacto significativo de los polimorfismos raros, la detección de una segunda diana puede incorporarse al diseño del ensayo. Cuando la diversidad de secuencias afecta a la detección de una región del genoma viral, la detección de una segunda región garantiza la obtención de un resultado preciso. Dada la complejidad de los ensayos moleculares y el alto nivel de diversidad viral, a la hora de diseñar los ensayos moleculares se debe considerar un enfoque integral que utilice la vigilancia global y el diseño de sondas específicas para la diana. La simple adaptación de una estrategia, como la de doble diana, puede proporcionar una falsa sensación de seguridad.
Estrategia de calibración
La estrategia de calibración es un componente integral del diseño de ensayos moleculares y es fundamental para garantizar la reproducibilidad en un amplio rango dinámico. La mayoría de las metodologías cuantitativas para la gestión de la terapia utilizan actualmente una curva de calibración externa para determinar la concentración de un analito.
En estos ensayos, la señal del analito en una muestra del paciente se compara con un conjunto de muestras con una concentración conocida y se utiliza una simple regresión lineal (y=mx+b) para calcular la carga viral. Este enfoque suele utilizar calibradores que se procesan como muestras de pacientes a lo largo de todo el proceso, lo que permite la calibración tanto de los reactivos de extracción y amplificación como de los instrumentos.
Alternativamente, podrían utilizarse calibradores que no se procesan a través de la extracción, sin embargo, este enfoque conlleva el riesgo de que no se tengan en cuenta las diferencias en la recuperación o un cambio en la composición del reactivo, lo que podría dar lugar a diferencias en la cuantificación.
Otra estrategia menos utilizada es un estándar cuantitativo interno. Esta aplicación utiliza una línea de regresión polinómica de 3er orden (y = ax3 + bx2 + cx + d) en todo el rango lineal con una diferencia máxima permitida con respecto a la linealidad. Estudios anteriores han sugerido que la diferencia admisible con respecto a la linealidad para algunos de los ensayos era de ± 0,2 Log10.6 Esta diferencia admisible con respecto a la linealidad y el enfoque de calibración también explican el sesgo observado a menudo entre las metodologías, así como la mayor imprecisión en el extremo inferior del rango dinámico, donde a menudo se toman las decisiones clínicas.
Conclusión
El rendimiento exacto y preciso de los ensayos moleculares es fundamental para una gestión terapéutica adecuada. Unos resultados inexactos de la carga viral podrían conducir a un manejo inadecuado y el paciente podría quedar con una terapia fallida. Este diagnóstico erróneo tiene implicaciones mucho más amplias que el manejo de un solo paciente, ya que también podría conducir a un aumento de la transmisión de la cepa viral resistente. Desde el punto de vista de la gestión del tratamiento, un virus con mutaciones asociadas a la resistencia es más difícil de tratar con opciones terapéuticas más limitadas. Además, las tasas de falsos positivos pueden añadir un coste innecesario por la repetición de las pruebas o por pruebas de resistencia más caras, así como ansiedad para el paciente y el médico.
- Directrices para el uso de agentes antirretrovirales en adultos y adolescentes con VIH desarrolladas por el Departamento de Salud y Servicios Humanos. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Consultado en septiembre de 2019.
- Sociedad Clínica Europea del SIDA (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- Departamento Nacional de Salud, Sudáfrica, abril de 2015, consultado el 2 de agosto de 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. Vigilancia global del VIH: base para el descubrimiento retroviral y el desarrollo de ensayos. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Partially double-stranded linear DNA probes: novel design for sensitive detection of genetically polymorphic targets. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Desarrollo de una segunda versión de la prueba cuantitativa del virus de la hepatitis C Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan con inclusión mejorada del genotipo. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Reconocimiento: El autor desea reconocer y agradecer a Mary Rodgers y Shihai Huang por su revisión de este artículo.