Para los propósitos de esta entrada del blog (más por venir en los diferentes tipos de fijadores…), nos centraremos principalmente en el uso de paraformaldehído/formaldehído, comúnmente conocido como PFA, que es el fijador más comúnmente utilizado en la citometría de flujo. El PFA se refiere específicamente a la forma sólida y polimérica del formaldehído (y se disuelve en formaldehído monomérico en solución acuosa), por lo que lo que se suele denominar canónicamente «fijación con PFA» es en realidad el uso de la solución monomérica de formaldehído. En este caso, PFA y formaldehído son sinónimos e intercambiables.
Para la fijación de muestras para la citometría de flujo se suele utilizar una solución que oscila entre el 1 y el 4% de PFA. En el caso de la higienización de muestras infecciosas, concentraciones tan bajas como el 0,37% pueden desinfectar eficazmente las muestras de pacientes infectados por el VIH1. La incubación durante un máximo de 45-60 minutos con PFA al 1%, y de 15-20 minutos con PFA al 4% (por ejemplo, el tampón de BioLegend) es suficiente para fijar completamente las células, y éstas pueden utilizarse para el procesamiento posterior (permeabilización para objetivos intracelulares) o almacenarse para futuros análisis en esta fase.
Durante un procedimiento rutinario de tinción de citometría de flujo que implique la tinción de marcadores de superficie, hay varios pasos en los que puede decidir fijar sus muestras: fijar después de la tinción de marcadores de superficie o fijar antes.
En algunos casos, la decisión de cuándo puede fijar es… fija. Por ejemplo, si usted está analizando fosfo-objetivos, la unión de ciertos antígenos de superficie por los anticuerpos puede alterar las vías de señalización intracelular poco después del contacto, lo que conduce a un artefacto en sus resultados de fosforilación. En este caso, debe fijar las células antes de añadir los anticuerpos de superficie (por lo que nuestro protocolo recomendado para usar nuestro True-Phos™ Perm Buffer para analizar objetivos de fosforilación intracelular está diseñado para que el paso de fijación preceda a otros procedimientos). Cada uno tiene sus propios beneficios e inconvenientes, pero aquí hay un par de cosas a tener en cuenta en cada caso.