Alai

Une brève histoire de T. reesei

Les plus anciennes pratiques biotechnologiques impliquant des champignons pour la production de bière, de vin et de fromage pourraient remonter à plusieurs millénaires, c’est-à-dire au tout début de la civilisation lettrée elle-même . En revanche, la découverte de l’ascomycète mésophile filamenteux Trichoderma reesei (puis Trichoderma viride) pour son étonnant potentiel de production de cellulases extracellulaires a eu lieu il y a un peu plus de 70 ans. Au départ, le potentiel destructeur du Trichoderma sp. original, isolé à partir de matériel de l’armée américaine en décomposition dans les îles Salomon pendant la Seconde Guerre mondiale, était considéré comme plutôt problématique. Néanmoins, il n’a pas fallu longtemps pour que des chercheurs des laboratoires de recherche de l’armée de Natick, dirigés par Mary Mandels et Elwyn T. Reese, le chercheur qui a donné son nom, ont cherché à transformer ce potentiel problématique en produits intentionnels. Lors d’un criblage de 14 000 moisissures de la Quartermaster Collection, Trichoderma sp. QM6a a montré une capacité exceptionnelle à dégrader la cellulose cristalline native. La désignation « QM6a » du dernier isolat original de Trichoderma, qui l’identifiait comme la sixième des six cultures du champignon stockées dans la Quartermaster Collection à Natick, est restée. Cette souche particulière est non seulement considérée comme la souche de référence de T. reesei, mais elle est aussi la seule souche à partir de laquelle tous les mutants utilisés dans l’industrie aujourd’hui ont été dérivés.

Alors et maintenant, la recherche sur T. reesei a été propulsée par l’idée que ses cellulases sécrétées pourraient avoir un impact changeant sur la lutte de 200 ans pour produire économiquement des carburants à partir de la biomasse lignocellulosique renouvelable . Depuis, la recherche sur T. reesei a ouvert la voie au concept de saccharification enzymatique de la cellulose par une combinaison synergique de différentes activités cellulasiques et a jeté les bases de notre compréhension actuelle de la régulation des enzymes concernées. Sa principale cellobiohydrolase CBH1 (CEL7a) a également été la première cellulase eucaryote à être clonée et la première cellulase dont la structure a été résolue. Une étape importante vers l’application industrielle des cellulases de T. reesei a été le développement de procédures efficaces de mutagenèse et de criblage des souches dans les années 1970. Au cours des deux décennies suivantes, le titre de la protéine extracellulaire produite par la souche originale QM6a a pu être multiplié par 20 grâce aux programmes de mutagenèse de Natick et de l’université Rutgers. Ces derniers ont abouti à l’isolement de la souche RUT-C30 (où « RUT » signifie Rutgers). Bien que la norme d’or pour la production de cellulase dans l’industrie ait été signalée comme étant supérieure à 100 g/L, cette souche reste le prototype d’hyperproducteur de cellulase disponible dans le domaine public avec des titres de protéine extracellulaire atteignant 30 g/L sur le substrat lactose inducteur de cellulase .

Au début, cependant, d’autres applications commerciales pour les cellulases ont été développées car il est devenu clair que la saccharification efficace et complète de la biomasse lignocellulosique en sucres fermentescibles nécessite beaucoup plus d’activités enzymatiques que prévu initialement. Là encore, la recherche impliquant T. reesei a continué à innover dans le domaine de l’enzymologie de la dégradation de la cellulose et de l’hémicellulose et continue à le faire aujourd’hui. La microscopie à force atomique à haute vitesse a également permis de visualiser la dégradation de la cellulose et de montrer comment la principale cellobiohydrolase CBH1/CEL7A glisse de manière unidirectionnelle le long de la surface de la cellulose. Au début des années 1990, les techniques de transformation facilitant le génie génétique de T. reesei sont devenues disponibles. Au cours de la décennie suivante, ces technologies ont permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur la régulation de ses enzymes et de modifier le profil enzymatique sécrété par le champignon. À l’époque, T. reesei était également l’un des premiers hôtes pour l’expression de protéines de mammifères, comme le montre l’expression de la chymosine de veau sous des signaux d’expression cbh1 (cel7a).

À la fin des années 1990, Kuhls et al. ont découvert que Hypocrea jecorina est en fait la forme sexuelle de T. reesei, ce qui explique pourquoi un certain nombre de publications ultérieures ont utilisé H. jecorina comme nom d’espèce au lieu de T. reesei. Une étude plus détaillée sur le développement sexuel a conduit à l’hypothèse que la souche QM6a est en fait stérile femelle, ce qui pourrait par la suite être lié à une mutation dans le gène codant pour l’échafaudage MAP-kinase ham5 .

Le tournant du millénaire, qui pour la génétique peut être considéré comme un virage loin de l’étude des gènes isolés et des voies vers l’étude des génomes entiers, a vu l’arrivée de T. reesei dans ce qu’on appelle l’ère génomique. La première approche globale pour étudier l’expression des gènes de T. reesei en 2003 a été une étude transcriptomique par Foreman et al. qui ont construit des microréseaux d’ADN basés sur des ADNc correspondant à plus de 5000 transcrits différents du génome de T. reesei. Cinq ans plus tard, le séquençage et l’analyse du génome de l’isolat original QM6a de T. reesei ont jeté les bases de l’application à grande échelle des études sur le génome entier. Au cours des années suivantes, l’analyse génomique comparative d’un certain nombre de souches productrices et non productrices de cellulase a permis de découvrir de nouveaux facteurs potentiels impliqués dans l’hyperproduction de cellulase, tels que le transport nucléocytoplasmique, le trafic des protéines vacuolaires et le renouvellement de l’ARNm. Ces analyses comparatives ont bénéficié du fait que toutes les souches de T. reesei utilisées dans les milieux universitaires et industriels sont dérivées de la souche QM6a. Soixante-cinq ans après les premières études d’Elwyn Reese sur la dégradation de la cellulose par T. reesei, la capacité mondiale installée de production de biocarburants cellulosiques est maintenant de 480,5 millions de litres par an (MMLY) d’éthanol, dont 380,5 MMLY (soit environ 80 %) sont produits à l’aide de formulations enzymatiques de T. reesei telles que Accellerase et Cellic (Fig. 1a). Sans aucun doute, cet effort a nécessité la maturation de la technologie sous-jacente à plusieurs niveaux, y compris l’ingénierie des procédés et le prétraitement du substrat. Néanmoins, la production et l’optimisation des formulations enzymatiques pour l’étape de saccharification de la biomasse était et reste l’un des facteurs clés déterminant la rentabilité des procédés de production d’éthanol cellulosique. De plus, la production d’enzymes à l’aide de T. reesei n’est en aucun cas limitée à la production d’enzymes de bioraffinage. En fait, environ 11 % de toutes les formulations d’enzymes techniques enregistrées par l’Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products sont produites en utilisant T. reesei comme hôte d’expression (Fig. 1b, c). Enfin et surtout, T. reesei conserve son importance dans la recherche, illustrée par plus de 100 articles de recherche traitant du champignon ou de ses enzymes publiés chaque année (Fig. 1d).

Le mélange d’enzymes de la biomasse de T. reesei : nouvelles perspectives et limites

Dans la nature, la déconstruction de la lignocellulose est rarement accomplie par un seul organisme. Elle est plutôt réalisée par l’ordre séquentiel et l’effort collectif de plusieurs organismes qui produisent de multiples enzymes actives sur les glucides (CAZymes) pour dégrader les différents polymères. Il n’est donc pas surprenant que le mélange de cellulases sécrétées de T. reesei ait dû être adapté de manière significative pour fournir une formulation enzymatique compétitive en termes de coûts pour une saccharification complète de la lignocellulose. Très tôt, les chercheurs ont réalisé que les formulations de T. reesei ne présentaient pas une activité β-glucosidase suffisante, car la majeure partie de l’activité est liée à la paroi cellulaire du champignon. Par conséquent, l’augmentation de l’activité β-glucosidase améliore la dégradation de la cellulose car elle contrebalance l’inhibition du produit par le cellobiose, qui, à son tour, est libéré par l’action coopérative des endoglucanases et des cellobiohydrolases . Sinon, ce mécanisme de rétroaction ralentit sérieusement la saccharification de la cellulose. De même, les xylo- et mannooligosaccharides dérivés de l’hémicellulose inhibent les cellobiohydrolases de T. reesei, ce qui indique fortement que des activités β-xylosidase et β-mannosidase suffisantes sont nécessaires pour dégrader efficacement la lignocellulose. En 2003, Foreman et al. ont décrit deux protéines qui sont co-induites avec les principales cellulases et les ont nommées cellulose induced protein 1 et 2 (CIP1 et CIP2). Il a depuis été démontré qu’elles sont importantes pour dégrader efficacement la lignocellulose. Des résultats récents montrent que la CIP1 présente des similitudes structurelles avec les lyases, bien que l’activité lyasique n’ait pu être démontrée, et que la CIP2 est une glucuronoylestérase de la famille CE15. Une autre protéine sécrétée importante est la swollenine SWO1 qui contient un module de liaison aux hydrates de carbone (CBM) lié à un domaine de type expansine. Malgré son activité de perturbation de la cellulose, SWO1 augmente de manière synergique l’activité de l’endoxylanase plutôt que celle de l’endoglucanase ou de la cellobiohydrolase pendant l’hydrolyse enzymatique de la canne de maïs prétraitée. L’un des modes d’action proposés est qu’il rend la partie xylane de la lignocellulose plus accessible à la dégradation par les xylanases et favorise ainsi indirectement l’action des cellulases. La plus grande révolution de ces dernières années dans la dégradation de la cellulose a sans doute été la découverte des monooxygénases lytiques de polysaccharides (LPMO). Ces enzymes ont introduit un nouveau mécanisme oxydatif dans la dégradation des polysaccharides. Dans la dégradation de la cellulose, on suppose que les LPMO agissent sur la surface des fibrilles de cellulose cristalline, les rendant ainsi plus accessibles aux cellulases. Il est intriguant de constater que ces enzymes peuvent obtenir les électrons nécessaires à ce processus à partir de la lignine de la paroi cellulaire de la plante par transfert d’électrons à longue distance, ce qui retourne les mécanismes de défense de la plante contre elle. Par ailleurs, les oxydoréductases GMC ou les cellobiose déshydrogénases peuvent servir de donneurs d’électrons. Cette découverte pourrait bien expliquer comment T. reesei alimente ses LPMO, car il a été démontré précédemment que plusieurs de ces oxydoréductases GMC sont effectivement induites par la paille de blé. Cependant, ce mécanisme d’oxydation n’est en aucun cas limité à la dépolymérisation de la cellulose. Initialement démontré pour la chitine, les GMCs jouent également un rôle dans la dégradation du xyloglucane et de l’amylose. Dans la base de données CAZy, les enzymes appartenant à ce groupe ont été reclassées dans la catégorie des « activités auxiliaires » (AA), par opposition à leur classification antérieure en tant que glycoside hydrolases (par exemple GH61), et se trouvent dans les familles AA 9-11 et 13. Comme indiqué précédemment, les activités hémicellulolytiques sont importantes pour la saccharification complète de la lignocellulose (revue par Harris et al.). Différentes quantités d’activités individuelles sont nécessaires en fonction des types d’hémicellulose présents dans le substrat. Il est donc intéressant de noter que le répertoire enzymatique de T. reesei présente des limitations claires pour certains types de liaisons spécifiques de l’hémicellulose. L’une de ces activités manquantes est l’α-xylosidase. L’ajout d’α-xylosidase à une formulation enzymatique commerciale de T. reesei a amélioré la libération de xylose et de glucose à partir de cannes de maïs prétraitées. De même, l’ajout d’une cellulase de la famille GH 5 ayant une activité contre le glucomannane et le xylane a amélioré de manière significative une préparation enzymatique synthétique de T. reesei . D’autres activités sont absentes ou très limitées dans le mélange de cellulases de T. reesei, notamment l’endo-arabinase et plusieurs activités pectinases. L’ajout de ces activités enzymatiques aux mélanges de cellulases commerciaux a permis d’améliorer la saccharification de différents substrats. Une autre question à laquelle il faut encore répondre est la fonction in vivo des oxydases multicuivres sécrétées de type laccase codées dans le génome de T. reesei .

Improving T. reesei as protein production host

Du fait que les cellulases et la majorité des autres enzymes de dégradation de la lignocellulose sont exprimées de manière coordonnée et conditionnelle , leur régulation transcriptionnelle représente une cible d’ingénierie logique pour améliorer la production de cellulase par le champignon. L’un des principaux régulateurs est le facteur de transcription CRE1 de type C2H2, médiateur de la répression des catabolites du carbone. CRE1 bloque la transcription de ses gènes cibles en présence de sources de carbone plus favorables, comme le glucose. Sa troncature est l’une des principales causes de l’amélioration de la production de cellulase obtenue par des programmes de mutagenèse aléatoire de T. reesei QM6a conduisant à la souche RUT-C30, qui présente à la fois un niveau basal et un niveau induit de production de cellulase plus élevés. De même, le remplacement des motifs de liaison de CRE1 dans la région promotrice de la cellobiohydrolase majeure cel7a par ceux d’un activateur de cellulase connu réduit la répression des catabolites du carbone et augmente la transcription de cel7a dans des conditions d’activation et de répression. De plus, la transcription de la cellulase, de la xylanase et d’un certain nombre d’autres gènes codant pour des enzymes impliquées dans la dégradation de la lignocellulose dépend strictement de l’activateur transcriptionnel XYR1 de type Zn(II)2Cys6 . Ceci est en contraste avec d’autres champignons, y compris les Sordariomycètes Neurospora crassa et Fusarium fujikuroi, où l’orthologue XYR1 module exclusivement l’expression du gène de la xylanase. Une mutation conduisant à une forme tronquée de XYR1 a été trouvée pour causer le phénotype cellulase-négatif de la souche QM9136 qui provient du programme de mutagenèse de Natick. Par conséquent, les mutants surproduisant et hyperproduisant la cellulase présentent des niveaux élevés d’ARNm pour les activateurs transcriptionnels xyr1 . Il a également été prouvé que la surexpression de XYR1 conduit à une plus grande expression des cellulases et abolit leur répression des catabolites en présence de glucose . De plus, une mutation ponctuelle dans une région régulatrice putative de XYR1 conduit à un modèle d’expression dérégulé de façon similaire. Outre XYR1 et CRE1, trois facteurs de transcription ACE1, ACE2 et ACE3 régulent l’expression de la cellulase et de la xylanase chez T. reesei. Comme CRE1, ACE1 est un répresseur à doigt de zinc C2H2 et sa délétion améliore donc la production de cellulases et de xylanases . ACE2 et ACE3, tout comme XYR1, sont des activateurs de transcription de type Zn(II)2Cys6 . Lorsque ace2 est absent, la transcription des cellulases et des xylanases est réduite en conséquence, bien que l’induction de la cellulase par le sophorose ne soit apparemment pas affectée. La délétion de l’ACE3 abolit complètement la transcription des cellulases mais réduit seulement celle des xylanases. Alors que la surexpression de l’ACE2 n’a pas encore été tentée, la surexpression de l’ACE3 entraîne une augmentation des activités des deux types d’enzymes, tout comme la surexpression de six autres régulateurs non caractérisés jusqu’à présent. Il s’agit notamment de deux autres facteurs de transcription de type Zn(II)2Cys6, ainsi que de deux protéines WD40, d’une protéine à bromodomaine et d’une acétyltransférase liée à gcn5. Les trois activateurs de transcription de type Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 et ACE3) ressemblent à la protéine Gal4 bien caractérisée de S. cerevisiae. Il est bien établi que Gal4 recrute le complexe SAGA contenant Gcn5 et favorise ainsi la transcription de ses gènes cibles par l’acétylation des histones et la formation d’euchromatine. En fait, l’orthologue Gcn5 de T. reesei est indispensable à l’expression de la cellulase et participe à l’acétylation des histones dans le promoteur cbh1. Ces dernières années, une image a émergé qui montre que la transcription des cellulases et des CAZymes connexes chez les champignons est régie par une combinaison de nombreux facteurs de transcription représentant un réseau transcriptionnel-régulateur complexe influencé par des activateurs et des répresseurs qui s’opposent. Chez Penicillium oxalicum, par exemple, vingt facteurs de transcription modulent l’activation ou la répression des gènes de cellulase. Parmi eux, ClrB a été identifié comme un intégrateur clé de tous les autres régulateurs avec leurs gènes cibles. Des homologues de ces régulateurs sont trouvés chez T. reesei, mais étant donné la diversité des adaptations dans la régulation de la paroi cellulaire des plantes, on s’attend à ce que d’autres régulateurs différents jouent également des rôles importants. Un autre acteur clé de la régulation de la cellulase est l’orthologue de T. reesei de l’énigmatique LaeA d’Aspergillus, qui est impliqué dans la régulation des groupes de gènes de métabolites secondaires chez différents champignons. Alors que la délétion de cette protéine méthyltransférase putative conduit à une forte dérégulation de différents gènes de cellulase et d’autres CAZyme, sa surexpression peut fortement promouvoir leur expression. Des effets similaires ont été trouvés pour la protéine VEL1 du complexe VELVET, qui interagit avec LAE1.

La plupart des études susmentionnées fournissent des informations fondamentales sur la régulation de la formation de la cellulase. Comme la plupart de ces études ont été réalisées soit dans l’isolat original de T. reesei QM6a, soit dans la souche modérément surproductrice QM9414, il reste difficile de savoir si et dans quelle mesure ces effets peuvent être mis en œuvre dans les souches hyperproductrices. Dans ces souches, des processus tels que la traduction, la sécrétion et le renouvellement des enzymes sécrétées, plutôt que la transcription, pourraient limiter une nouvelle augmentation de la production de cellulase. Il sera intéressant de voir si plusieurs des moyens rapportés pour améliorer l’expression du gène de la cellulase peuvent être empilés et comment ces souches se comporteraient par rapport aux hyperproducteurs dérivés par mutagenèse aléatoire.

Simplement booster la transcription du gène d’intérêt ne conduit pas toujours à une meilleure formation du produit, en particulier dans le cas de protéines non fongiques. Une stratégie réussie pour contourner la faible formation de produits est l’approche du gène de fusion qui utilise outre la région du promoteur et du terminateur d’un gène hautement exprimé également la protéine codée comme amplificateur d’expression. Pour T. reesei, il s’agit de la cellobiohydrolase codant pour cel7A, qui est la protéine la plus fortement exprimée dans des conditions d’induction de la cellulase. On pense que ces fusions de gènes augmentent généralement la stabilité de l’ARNm, son importation dans le RE et son passage par la voie sécrétoire. À cette fin, la structure modulaire de CEL7A, composée d’un module catalytique, d’un lieur et d’un CBM, est souvent exploitée, remplaçant ainsi le CBM C-terminal par le gène d’intérêt. Il existe maintenant des variantes de cette approche de fusion de gènes qui ciblent la protéine vers le RE pour un repliement correct, la formation de ponts disulfure et la glycosylation, mais qui visent ensuite l’accumulation intracellulaire de la protéine pour éviter la dégradation du produit souhaité par les protéases extracellulaires. Une telle stratégie utilise des hydrophobines avec un signal de rétention du RE attaché comme support. Ces protéines de fusion s’auto-assemblent en structures de type micelle et peuvent être purifiées à l’aide d’un système à deux phases aqueuses à base de tensioactifs. Une autre stratégie pour cibler les protéines vers le RE utilise le peptide γ-zein (ZERA) dérivé de la protéine de stockage du maïs. De la même manière, ces protéines de fusion auto-assemblées forment des corps protéiques entourés de la membrane du RE qui les protègent de la protéolyse. Le développement des champignons en tant qu’hôtes efficaces pour la production de protéines de mammifères nécessite également l’inactivation des protéases fréquemment rencontrées dans le bouillon de fermentation. Dans une étude systématique, différentes protéases sécrétées liées à la dégradation de produits biopharmaceutiques, y compris les anticorps, l’interféron α 2b et le facteur de croissance analogue à l’insuline, ont été identifiées et plusieurs ont été inactivées. Cela a conduit non seulement à une réduction drastique de l’activité protéasique mais aussi à une forte augmentation de la stabilité des trois protéines recombinantes, l’anticorps présentant l’effet le plus prononcé. Bien que l’ingénierie du modèle de N-glycosylation pour la production de protéines thérapeutiques de grande valeur ait été tentée auparavant, la création d’un modèle de glycosylation humaine authentique dans un hôte d’expression fongique ne semble pas réalisable pour le moment. On peut donc se demander si de tels produits biopharmaceutiques seront produits par des usines de cellules fongiques à l’avenir, surtout compte tenu du développement rapide des cellules CHO .

Les hydrophobines mentionnées ci-dessus sont un autre groupe de protéines qui ont reçu une attention considérable en raison de leurs propriétés tensioactives . Ces petites protéines extracellulaires s’auto-assemblent en couches protéiques aux interfaces hydrophobes/hydrophiles en raison de leurs propriétés amphiphiles et rendent les surfaces hydrophobes mouillables ou les surfaces hydrophiles hydrophobes. Ils ont un large potentiel dans les applications alimentaires et médicales pour disperser les matériaux hydrophobes, stabiliser les mousses ou cibler différentes molécules sur les surfaces. Les cérato-platanines sont un autre groupe de petites protéines sécrétées avec quatre cystéines conservées. Elles se lient à la chitine et aux oligosaccharides N-acétylglucosamine et possèdent des propriétés d’auto-assemblage aux interfaces hydrophobes/hydrophiles. Contrairement aux hydrophobines, les cérato-platanines améliorent plutôt les propriétés de polarité/apolarité des surfaces . Une fonction de ciblage est également attribuée aux CBMs présents dans différents CAZymes. Ils peuvent améliorer l’activité hydrolytique du domaine catalytique auquel ils sont attachés et conduire à un optimum de pH et de température plus favorable. Leurs propriétés de liaison aux hydrates de carbone peuvent en outre être exploitées pour la purification par affinité de protéines de fusion en utilisant, par exemple, des colonnes de cellulose. Le large éventail d’autres applications des MBC recombinants a récemment été examiné ailleurs .

Trichoderma reesei pour le biotraitement consolidé et la catalyse à cellules entières

Le biotraitement consolidé (CBP) est classiquement compris comme l’intégration des étapes de production d’enzymes cellulolytiques, d’hydrolyse enzymatique et de fermentation d’un processus de production d’éthanol cellulosique en une seule opération unitaire. Par conséquent, un organisme unique possédant de bonnes propriétés cellulolytiques et une voie de fermentation de l’éthanol efficace serait souhaitable. Néanmoins, l’utilisation de consortiums microbiens a également reçu une certaine attention. Malheureusement, aucun organisme unique répondant aux deux exigences n’est actuellement disponible (Fig. 2). Par conséquent, des efforts ont été entrepris pour faire en sorte que les éthanologènes deviennent cellulolytiques ou que les organismes cellulolytiques deviennent éthanologènes. Dans le cadre du premier scénario, T. reesei a souvent servi de donneur de gènes CAZyme, notamment pour cel5a et cel7b codant pour deux de ses endoglucanases et pour ses deux cellobiohydrolases cel6a et cel7a (tableau 1). Dans toutes les études publiées, la capacité de sécrétion relativement faible de S. cerevisiae a limité la conversion du substrat par les CAZymes hétérologues sécrétés ou ancrés dans la membrane. Par conséquent, les rendements élevés en éthanol avec des substrats cellulosiques réalistes ont nécessité l’ajout de cocktails enzymatiques commerciaux de T. reesei. Néanmoins, alors que les efforts visant à améliorer la capacité de sécrétion et d’affichage de surface des souches de S. cerevisiae modifiées sont en cours, les souches affichant la cellulase actuellement disponibles ont déjà le potentiel de conduire à des réductions substantielles des charges enzymatiques requises pour la saccharification de la biomasse. Dans le contexte du deuxième scénario, T. reesei lui-même représente un organisme cible prometteur. Mais bien que ce champignon possède naturellement la capacité de métaboliser tous les sucres liés à la biomasse et de les convertir en éthanol, les rendements sont faibles et de l’acide acétique est formé comme sous-produit indésirable . D’autre part, les régimes de fermentation à grande échelle pour T. reesei sont bien établis en raison de sa large application dans la production commerciale d’enzymes, et les outils moléculaires pour son génie génétique sont également très bien développés. L’un des grands défis restants pour l’utilisation de T. reesei comme organisme CBP est que plusieurs de ses cellulases et gènes glycolytiques sont réprimés par l’hypoxie, qui est nécessaire pour la production d’éthanol. De plus, la répression transcriptionnelle des cellulases en présence d’éthanol représente un autre défi à relever. Cependant, la souche hyperproductive de cellulase RUT-C30 a une plus grande tolérance à l’éthanol que la souche QM9414 de la lignée Natick, et représente donc une souche de plateforme parfaite pour développer T. reesei en tant qu’organisme CBP, d’autant plus qu’elle est également dérépressive des catabolites du carbone. En outre, en présence d’une pâte lignocellulosique, la RUT-C30 présente une morphologie semblable à celle d’une pastille au cours des premiers stades de la fermentation, ce qui peut être obtenu de manière indépendante de la croissance par l’ajout du surfactant Triton X-100 et conduit ensuite à une production d’enzymes plus élevée. Cet aspect est important, car la faible capacité de mélange et les faibles densités cellulaires maximales dues à la croissance filamenteuse ont jusqu’à présent entravé l’utilisation de T. reesei comme organisme CBP. De manière plus générale, le biotraitement consolidé pourrait également être utilisé pour décrire d’autres processus intégrés dans lesquels le substrat n’est pas nécessairement la biomasse lignocellulosique mais un autre biopolymère tel que la chitine ou l’amidon et le produit n’est pas l’éthanol, mais tout autre métabolite . À cette fin, un certain nombre d’études récentes visaient à surproduire différents métabolites via l’ingénierie de T. reesei (tableau 2). Cependant, les rendements qui ont pu être obtenus étaient dans la plupart des cas loin de la commercialisation, nécessitant donc une optimisation supplémentaire.

Outils pour la conception et l’ingénierie cellulaire

Alors que deux revues complètes sur la boîte à outils moléculaire de T. reesei et d’autres espèces de Trichoderma n’ont été données que récemment , nous voulons les mettre à jour avec les avancées les plus récentes dans le domaine. L’ingénierie ciblée des souches en vue d’améliorer la production de cellulase ou pour l’ingénierie métabolique nécessite des méthodes efficaces pour introduire des modifications génétiques dirigées dans l’organisme. L’efficacité généralement faible du ciblage génétique a longtemps été un défi majeur pour obtenir un nombre raisonnable de transformants par intégration homologue d’une cassette de délétion ou d’expression. Ce problème a été principalement résolu par l’inactivation de composants de la voie de réparation de l’ADN par jonction des extrémités non homologues (NHEJ), tels que tku70 ou tmus53 . Les souches délétées de Tku70 montrent une amélioration du ciblage des gènes, bien que l’efficacité de l’intégration homologue dans ces souches puisse encore varier en fonction du locus ciblé et puisse ainsi tomber à 30 %. Sur la base de cette amélioration, un certain nombre de nouvelles approches ont été développées pour insérer des cassettes d’expression dans une région génomique définie, évitant ainsi les effets pléiotropiques causés par leur intégration aléatoire. En utilisant un fond tku70, Jorgensen et al. ont développé une plateforme d’expression qui utilise le locus ade2, facile à cribler, comme site d’intégration privilégié. Lors de l’intégration de la cassette d’expression dans ce locus, ade2 est détruit et les transformants qui en résultent développent une pigmentation rouge distincte. Dans une autre étude, les loci pyr4 et asl1 ont été choisis pour développer une souche auxotrophe en uridine et en l-arginine qui permet une intégration dirigée à ces sites. Ouaedraogo et al. ont suivi une stratégie différente et ont exprimé la méganucléase I-SceI de S. cerevisiae dans T. reesei. L’I-SceI génère des cassures double-brin artificielles sur un site de reconnaissance de l’I-SceI qui a été introduit au préalable à un locus prédéfini et a amélioré les efficacités de transformation et d’intégration homologue. Dans une étude de suivi, les cassures double brin induites par I-SceI ont été combinées avec une délétion tku70. Dans ce cas, l’incapacité de réparer les cassures double brin par NHEJ favorise l’intégration de la cassette, ce qui conduit à des efficacités de recombinaison homologue allant jusqu’à 100 %. Une révolution pour le génie génétique ou l’édition du génome a été introduite avec le système CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 . Soulignant à la fois la nécessité d’une telle technologie et son importance croissante en tant que producteur d’enzymes, ce système a été testé pour la première fois sur des champignons filamenteux, à savoir T. reesei . Il introduit des cassures spécifiques du double brin d’ADN pour stimuler le ciblage des gènes et dépend uniquement d’une nucléase Cas9 (associée à CRISPR) qui utilise un seul ARN guide chimérique pour le ciblage. Le ciblage précis de cette Cas9 guidée par l’ARN vers une séquence d’ADN spécifique est obtenu par la séquence protospacer de l’ARN guide via un simple appariement de bases. En utilisant des régions flanquantes de 200 pb en amont et en aval pour la construction de la délétion du gène, des fréquences HR supérieures à 90 % ont pu être atteintes. Les doubles délétions et les triples délétions se sont produites à une fréquence de 45 et 4 %, respectivement, après un seul cycle de transformation. Alors que dans cette étude, les ARN guides transcrits in vitro ont été co-transformés avec la cassette de délétion dans un T. reesei exprimant Cas9, Nødvig et al. ont utilisé deux séquences ribozymes flanquantes pour libérer les ARN guides d’une transcription plus importante qui code également pour l’enzyme Cas9 dans différents Aspergilli. Les promoteurs, qui permettent l’expression des gènes de manière contrôlable, constituent un autre outil essentiel pour l’expression des protéines recombinantes et l’ingénierie des souches. Bien qu’un certain nombre de promoteurs inductibles et répressibles soient disponibles avec les différentes régions promotrices de la cellulase, ils présentent généralement des inconvénients car leur expression est liée au métabolisme de l’hôte et les activateurs peuvent être limités en raison des effets de titrage du promoteur. Parmi les alternatives utiles, on peut citer un ensemble de gènes de T. reesei répressibles par la l-méthionine, avec une force d’expression basale différente. Il a été démontré que l’un de ces promoteurs peut entraîner l’expression répressible de différents gènes rapporteurs sur plusieurs sources de carbone, dont la paille de blé. Dans une étude similaire, le promoteur d’un gène de perméase du cuivre de T. reesei a été utilisé pour contrôler l’expression du régulateur majeur de la cellulase et de l’hémicellulase xyr1 en l’absence de cuivre . Cependant, étant donné que les enzymes contenant du cuivre de la famille AA 9 sont des composants importants du mélange de cellulase de T. reesei , il est cependant douteux que ce système puisse être appliqué dans un scénario de production de cellulase.

À côté de ces outils moléculaires passionnants, certaines astuces plus anciennes de la génétique classique sont maintenant disponibles aussi. Le développement de souches de T. reesei a longtemps été entravé par le fait que l’on pensait que le champignon était asexué, ce qui empêchait le croisement des souches. Une étape importante à cet égard a été la découverte que QM6a possède un locus de type d’accouplement MAT1-2 et peut être facilement croisé avec certains isolats de type sauvage MAT1-1 de T. reesei. Mais lorsque le locus MAT1-2 de QM6a a été remplacé par son homologue MAT1-1, aucun stroma ne s’est formé lors de la confrontation avec la souche originale MAT1-2 de QM6a. Par conséquent, il était impossible d’exploiter l’accouplement pour l’ingénierie des souches dans les différentes souches universitaires et industrielles de T. reesei dérivées de QM6a. En utilisant une approche biologique des systèmes, le gène manquant responsable de la stérilité femelle a été identifié comme étant ham5 . Chez N. crassa, ham-5 code pour une protéine qui sert d’échafaudage à la MAP kinase pendant la fusion cellulaire. La réintroduction d’un ham5 fonctionnel restaure la formation de stroma dans la souche QM6a et permet la restauration de la fertilité femelle dans d’autres souches issues de QM6a. Cette découverte est particulièrement importante car le croisement avec les isolats de H. jecorina mentionnés ci-dessus peut conduire à des descendances aneuploïdes segmentaires. Avec cet outil en main, la base pour l’identification des mutations pertinentes menant à l’hyperproduction de cellulase par exemple est posée. Il s’agit d’un point important, car les approches traditionnelles de complémentation visant à identifier le(s) gène(s) à l’origine des phénotypes mutants se sont révélées largement infructueuses chez des espèces telles que T. reesei. Et bien que le séquençage à haut débit et l’analyse comparative des génomes puissent facilement identifier les mutations dans la lignée de souches QM6a d’hyperproducteurs et de non-producteurs de cellulase, ce n’est que dans quelques cas que cela a déjà permis d’associer une mutation à un phénotype particulier. Mais dans les cas où un nombre élevé de mutations a été trouvé ou si les mutations affectaient des gènes dont la fonction est inconnue, l’analyse comparative des séquences n’a pas révélé la nature des gènes cibles souhaités . Plusieurs chercheurs ont donc appliqué avec succès l’analyse des ségrégations en masse en combinaison avec le séquençage de nouvelle génération pour identifier les mutations pertinentes. Dans cette approche, le mutant est croisé avec une souche de référence et les ADN génomiques des ségrégants présentant le phénotype recherché sont regroupés et séquencés. La comparaison du génome de ce pool d’ADN séquencé avec les génomes des souches parentales peut alors révéler des mutations conservées pertinentes pour le phénotype. Les mutations qui ne sont pas liées au phénotype seront sous-représentées. Bien qu’il ne faille pas s’attendre à ce que cette approche conduise à l’identification d’une mutation unique, car les mutations proches de la mutation pertinente sont généralement co-ségrégées, le nombre de cibles à étudier ultérieurement est considérablement réduit.