8.3 Tests chimiques
La visualisation des composants des PHG sur les plaques TLC est possible en utilisant des réactifs généraux pour les phénols ; chlorure ferrique, vanilline et acide chlorhydrique (donnent une gamme de couleurs roses avec les dérivés du résorcinol ou du phloroglucinol), ou en utilisant des tests plus spécifiques avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine (détecte les aldéhydes). Le réactif de Folin-Ciocalteu est également utile pour détecter les phénols avec des noyaux de catéchol ou d’hyroquinone (des taches bleues apparaissent immédiatement après la pulvérisation de la plaque CCM) ou pour d’autres phénols, qui présentent des taches bleues à grises lorsque la plaque est fumée avec de la vapeur d’ammoniac. Le réactif de Gibbs (2 % de chloroimide de 2,6-dichloroquinone dans le chloroforme) suivi d’une fumigation de la plaque avec 2M NH4OH donne une variété de couleurs (par exemple, il est capable de distinguer l’acide vanillique – couleur rose – et l’acide isovanillique – couleur bleue). Les dérivés de l’acide cinnamique donnent une fluorescence bleu clair caractéristique lorsqu’ils sont examinés sous UV (366 nm). Les isomères cis et trans des acides cinnamiques sont présentés sur les plaques TLC lorsque l’extrait est chromatographié dans des solvants aqueux dans deux directions (2D-TLC). Les méthodes spectrophotométriques pour l’estimation du contenu phénolique sont fréquemment utilisées, par exemple, la méthode avec le réactif d’Arnow ou le réactif de Folin-Ciocalteu mentionné précédemment .
Certains tests qualitatifs indiquent la présence de coumarines dans les extraits de plantes, par exemple, Le test de l’anneau lactone (les coumarines hydrolysées par un alcali dilué forment une solution jaune de sels d’acide O-coumarique, qui peut être inversée après acidification ou saturation par le CO2) ; ou le test de couplage azoïque (une couleur rouge se développe en raison de la réaction avec l’acide sulfanilique de diazotation dans une solution alcaline). Les coumarines sont facilement détectées sous la lumière UV (365 nm), car elles donnent une fluorescence colorée caractéristique (sauf la coumarine simple non substituée qui n’a pas de fluorescence). Elles sont détectées par leur couleur bleue, violette, brune, verte ou jaune. Une solution de KOH à 10% dans le méthanol ou une solution de chlorure d’antimoine à 20% dans le chloroforme peuvent intensifier la couleur. Les hydroxycoumarines ne présentent pas de décalage spectral bathochrome en solution alcaline. Dans l’analyse HPLC avec détection par réseau de diodes, divers spectres UV des coumarines permettent une identification rapide des composés .
Les chromones réagissent dans les solutions alcalines pour donner des O-hydroxy-β-dicétones sans régénération du cycle γ-pyrone et également des composés colorés avec un acide concentré et un alcali concentré. Les chromones sont également visibles en lumière UV (fluorescence bleue, jaune, jaune verdâtre, brune à 365 nm).
La présence du cycle phényle actif (chromophore) dans les flavonoïdes les rend faciles à détecter en lumière UV. Leurs spectres UV sont particulièrement informatifs, fournissant des informations structurelles qui permettent de distinguer le type de phénol et le schéma d’oxydation. Différentes réactions chimiques par pulvérisation des chromatogrammes CCM sont possibles ; par exemple, la visualisation en présence de vapeur d’ammoniac (les chalcones et les aurones deviennent respectivement orange et rouge) ou la pulvérisation avec Naturstoff Reagenz A (solution à 1% de l’ester de 2-aminoéthanol et d’acide diphénylborique) et la surpulvérisation avec 5% de solution méthanolique de polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000), qui augmente la sensibilité de cette réaction. Après la dérivatisation, les composés peuvent être observés à la lumière UV (fluorescence du jaune clair au vert). D’autres tests incluent la pulvérisation avec du chlorure ferrique, de l’acide sulfanilique diazoté (les deux sont des réactions pour les phénols), et la réaction spécifique ; cyanidine avec de la poudre de magnésium en présence d’acide chlorhydrique (indique la présence de flavanones et de dihydroflavanols) . Pour l’estimation colorimétrique quantitative des flavonoïdes, on utilise la réaction avec le chlorure d’aluminium (AlCl3) (absorbance mesurée à 425 nm). Les flavonoïdes dissous dans des solutions alcalines donnent une couleur jaune intense, qui diminue après l’ajout d’acide. Les spectres UV des composés flavonoïdes montrent deux bandes principales (maxima d’absorbance) : la bande I à une longueur d’onde plus élevée (attribuée à la partie cinnamoyle de la structure flavonoïde) et la bande II à une longueur d’onde plus faible (due à la partie benzoyle). La bande I se situe normalement entre 304 et 350 nm pour les flavones (H en C-3 dans le cycle C), entre 352 et 385 nm pour les flavonols (groupe OH en C-3), et entre 328 et 357 nm pour les flavonols 3-substitués (O-substitution en C-3). La bande II de la plupart des structures se situe à environ 250-280 nm. Un groupe phénol supplémentaire (-OH) dans le cycle A provoque le déplacement bathochrome (déplacement vers des longueurs d’onde plus grandes) dans la bande II, et un groupe -OH supplémentaire dans le cycle B génère un effet similaire dans la bande I .
La plupart des anthraquinones ou leurs glycosides forment des cristaux jaunes ou rouge-orange et peuvent présenter une fluorescence dépendant du pH . La principale réaction colorée est le test de Bornträger, qui s’effectue en dissolvant la quinone dans un milieu aqueux alcalin. La réaction colorée va du rouge-orange au violet-violet (selon la structure et les substituants de la quinone). Les anthraquinones donnent une couleur rouge avec cette réaction. Pour les 1,8-dihydroquinones, la réaction avec l’acétate de magnésium est également utilisée. Les anthraquinones peuvent être détectées sur des plaques CCM après pulvérisation d’une solution de KOH méthanolique à 10 %. Les couleurs d’origine, jaune ou jaune-brun, deviennent rouges, violettes, vertes ou violettes. La rhubarbe en poudre peut être examinée à la lumière UV pour détecter la présence de raponthicine (glycoside stilbénoïde, qui est toxique). Dans la rhubarbe originale (Rheum palmatum), une fluorescence rouge-brun apparaît, mais on ne voit pas de taches bleu-violet brillantes (comme dans la cause de la rhubarbe rhapontique-Rheum rhaponticum).
Comme cela a été mentionné précédemment les saponines sont des composés tensioactifs (modifiant la tension superficielle) et ont des propriétés émulsifiantes. Pour une vérification qualitative rapide si une plante a des SPG, un test de moussage en secouant le matériel végétal avec de l’eau est couramment utilisé. Les saponines ont des propriétés de perméabilisation des membranes. De faibles concentrations de saponines sont capables de détruire les membranes des érythrocytes (ce qui peut précipiter le cholestérol qui existe dans les membranes des globules rouges), provoquant l’hémolyse du sang in vitro. Cette capacité a conduit à l’utilisation généralisée de l’hémolyse (indice hémolytique-IH) comme méthode de détermination de l’activité biologique. L’IH est défini comme la quantité de suspension isotonique de sang bovin à 2 % (en ml), qui subit une hémolyse lorsqu’elle est traitée avec 1 g de matériel végétal testé (ou extrait testé). Comme référence, on a utilisé le mélange de saponines de Gypsophila paniculata (IH=30 000) ou le Saponin Album (Merck) (IH=15 000). Comme décrit par Hostettmann et Marston, l’activité hémolytique des saponosides varie considérablement avec la structure de la partie glycoside. Les saponines monodesmosidiques (sauf les acylglycosides et la glycyrrhizine) sont fortement hémolytiques. Aucune réaction colorée n’est particulièrement spécifique aux GSP. Cependant, il existe une réaction de Lieberman (avec de l’anhydride acétique en présence d’acide sulfurique), où les couleurs diffèrent selon le type d’aglycone (triterpène-rose à rouge -ou stéroïde-bleu-vert) .
Les réactions chimiques permettant d’identifier les GCR dans le matériel végétal peuvent être dues aux aglycones ou aux sucres. Le test de Liebermann et de Salkoviski indique la fraction stéroïdienne, il n’est donc pas spécifique des CRG. Les tests de Keller Kiliani et Xanthidrole indiquent tous deux des désoxy-sucres (digitoxose ou cymarose). La réaction de Kedde ou de Baljet est plus spécifique, car elle est liée à la présence d’un cycle lactone α,β-insaturé. La réaction de fluorescence des GCR est également possible, par exemple, le groupe hydroxyle de la digoxine en C-14 et C-16 élimine l’eau avec H2SO4 avec la formation de deux doubles liaisons supplémentaires. Il en résulte un système conjugué (avec une double liaison dans le cycle lactone) qui rend la digoxine fluorescente dans la lumière UV. La réaction de Jensen (après pulvérisation avec de l’acide trichloracétique dans l’éthanol) est utilisée pour visualiser les CRG sur les chromatogrammes TLC .
La mesure directe du HCN total par hydrolyse acide des glycosides cyanogènes présents dans les aliments ainsi que la décomposition des cyanohydrines intermédiaires en HCN a les avantages d’être applicable à tous les types d’échantillons, bien que tout le HCN potentiel des glycosides cyanogènes ne soit probablement pas disponible in vivo. La visualisation de la présence de ces composés dans les plantes est possible sur du papier filtre imprégné de réactifs, tels que l’acide picrique/carbonate de sodium ou benzidine/acétate de cuivre. Ces réactifs sont capables de donner des réactions colorées avec le HCN libéré par les tissus végétaux écrasés. Un papier imprégné est placé dans un tube au-dessus du matériel végétal broyé et laissé en incubation à 40°C pendant 2 h. Un changement de couleur du jaune au brun rougeâtre indique la libération enzymatique de HCN. Le papier picrate n’est pas entièrement spécifique au cyanogène (les isothiocyanates volatils des espèces de Brassica répondent également à cette réaction). C’est pourquoi un autre test est également utilisé en utilisant un mélange (1:1) de solutions fraîchement préparées de 1 % de 4,4-tétraméthyldiamine diphénylamine dans du chloroforme (p/v) et de 1 % d’acétoacétate de cuivre éthylique dans du chloroforme (p/v). La réaction colorée passe du bleu-vert pâle au vert vif. Une autre méthode possible consiste à distiller le tissu végétal dans de l’eau acide et à titrer le HCN libéré avec du nitrate d’argent. Les méthodes chromatographiques telles que la HPLC/MS ou la GC/MS des dérivés du triméthylsilyle sont efficaces pour l’analyse des glycosides cyanogènes ou des cyanohydrines individuels, et fournissent une caractérisation chimique ainsi qu’une quantification des composés .
En raison de la diversité des produits formés dans les plantes à partir des glucosinolates (en fonction de sa structure aglycone) l’estimation des isothiocyanates par la méthode spectrophotométrique (où les produits colorés 1,3-benzodithiol-2-tiones sont formés par condensation de l’isothiocyanate avec le 1,2-benzène-dithiol) peut être insuffisante pour déterminer la teneur en glucosinolates dans les plantes .