Méthodes spectroscopiques
Spectroscopie d’absorption. Pour certains dosages enzymatiques, il est possible de mesurer directement le réactif ou le produit en fonction de ses propriétés d’absorbance Fersht (1999). Dans la réaction catalysée par la glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49), un produit (NADH) absorbe la lumière à 340 nm, ce qui permet de suivre la réaction en suivant l’augmentation de l’absorbance à cette longueur d’onde.
Glucose 6-phosphate + NAD+ → 6-phosphogluconate + NADH + H+
Dans d’autres cas, un réactif ou un produit est mesuré indirectement. Avec l’acétylcholinestérase (EC 3.1.1.7), par exemple, l’acétylthiocholine est utilisée comme substrat qui libère de la thiocholine lors de son exposition à l’enzyme. La thiocholine réagit avec le réactif d’Ellman pour donner un produit coloré, ce qui permet de suivre la réaction en suivant l’augmentation de l’absorbance.
Acétylthiocholine + H2O → acétate + H+ + thiocholine
Thiocholine + réactif d’Ellman → dérivé coloré
Des dosages couplés sont parfois utilisés pour suivre l’activité enzymatique. Dans ce cas, la réaction enzymatique d’intérêt est couplée à une seconde réaction qui est couplée pour une mesure pratique. Un exemple de ceci est le dosage de l’hexokinase (EC 2.7.1.1). Dans ce cas, un excès de glucose-6-phosphate déshydrogénase et de NAD+ est inclus dans le mélange de dosage et l’absorbance à 340 nm est surveillée.
Réaction I : Glucose + ATP → glucose 6-phosphate + ADP
Réaction II : Glucose 6-phosphate + NAD+ → 6-phosphogluconate + NADH + H+
Dans cet exemple, la réaction I devrait être à taux limitant et la concentration de glucose 6-phosphate devrait atteindre un état d’équilibre après une période de latence. Cleland Cleland (1979) a formulé une procédure pour s’assurer que l’essai couplé fournit une mesure précise de la vitesse de réaction de l’enzyme. Si possible, il est préférable de surveiller une réaction en continu. Avec les essais décrits ci-dessus, le spectrophotomètre peut être programmé pour donner une lecture continue en fonction du temps. Dans les techniques de séparation, qui peuvent inclure l’utilisation de la radioactivité, de l’électrophorèse ou de la chromatographie, on utilise des essais discontinus ou à point final. Après avoir établi une période de temps linéaire pour un essai, un paramètre est mesuré à un seul moment de la période de temps linéaire (de préférence, un moment proche du milieu de la phase linéaire). La vitesse est ensuite déterminée à partir de la différence de signal à ce point temporel et au début de la réaction. Il convient d’être prudent avec les essais au point final et de vérifier les parcours temporels pour confirmer la linéarité. Des modifications des conditions d’incubation, telles que la température, le pH ou la concentration du substrat, peuvent altérer la linéarité d’un test. Pour les essais enzymatiques de routine, le récipient de réaction contient tous les composants sauf un, et la réaction est lancée en ajoutant le composant manquant (l’enzyme ou l’un des substrats). Les autres composants doivent être équilibrés en termes de pH, de température et de force ionique. La réaction est généralement initiée par l’ajout d’un petit volume d’une solution mère concentrée du composant manquant. Un petit volume garantit que cet ajout ne perturbe pas les conditions d’équilibre déjà établies. Lorsqu’il n’est pas possible d’ajouter un petit composant, les composants séparés doivent être à la même température, à la même force ionique et au même p H. Bien qu’il doive y avoir un mélange complet des deux composants, une agitation vigoureuse doit être évitée car elle peut dénaturer la protéine enzymatique. Le mélange peut être effectué par inversion d’un tube muni d’un bouchon, ou d’une cuvette munie d’un joint Parafilm. Les protéines diluées sont souvent moins stables que les protéines plus concentrées, et les essais sont souvent réalisés en présence d’une protéine inerte, telle que l’albumine de sérum bovin (0,25 mg/ml), pour stabiliser l’enzyme purifiée. Des expériences doivent être réalisées pour s’assurer que la protéine est inerte. L’albumine, par exemple, pouvant se lier à des substrats hydrophobes, elle n’est pas toujours appropriée à cet effet. Pour les essais discontinus, on peut régler la minuterie et aspirer les échantillons à des intervalles de temps spécifiques après le mélange. Pour la plupart des spectrophotomètres, la détection est lancée manuellement à l’aide d’un panneau d’instrument ou d’un clavier d’ordinateur. Pour ajouter un composant à une cuvette, il faut environ 20 secondes pour placer la cuvette dans un spectrophotomètre, et pour commencer la détection en appuyant sur une touche de l’ordinateur. Ce temps n’a généralement pas une grande importance car pour la plupart des réactions, l’essai est réalisé en 10 à 30 minutes. Les mesures de contrôle comprennent un blanc ne contenant pas d’enzyme et un blanc ne contenant pas de substrat. Ces contrôles permettent de s’assurer que des réactions fortuites ne se produisent pas. La vitesse du contrôle (blanc non enzymatique) est soustraite de la date générée par l’expérimental pour fournir la vitesse réelle de la réaction enzymatique. Pour de nombreux essais, il est nécessaire d’éteindre ou d’arrêter la réaction à un moment précis afin d’empêcher toute production supplémentaire de produit. Par exemple, des échantillons peuvent être prélevés à intervalles de 5 minutes pendant une période de temps prédéterminée et le produit mesuré par HPLC.
Chaque analyse chromatographique peut prendre 30 minutes. Les méthodes pour terminer la réaction impliquent généralement la dénaturation de l’enzyme par l’ajout d’acide, ou l’immersion dans un bain d’eau bouillante. L’activité de certaines métalloenzymes peut être éteinte avec de l’EDTA ou un autre chélateur d’ions métalliques. La plupart des dosages enzymatiques sont basés sur des techniques spectroscopiques, les deux plus couramment utilisées étant l’absorption et la fluorescence Fersht (1999). La longueur d’onde utilisée pour suivre la vitesse de réaction doit être celle qui donne la plus grande différence d’absorption entre le substrat et le produit. Les mesures d’absorption sont effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre standard avec les échantillons contenus dans des cellules spécialisées, ou cuvettes. Des cuvettes en plastique jetables pouvant contenir des échantillons de 1 ou 3 ml sont disponibles dans le commerce. Leur utilisation est limitée à la gamme des longueurs d’onde visibles (350-800 nm). Il faut utiliser des cuvettes en quartz (le verre et le plastique absorbent la lumière dans la gamme des UV) pour les mesures à des longueurs d’onde inférieures à 350 nm. La longueur du trajet des cuvettes est indiquée par le fabricant. Les longueurs de trajet les plus courantes sont 1,00 cm, 0,40 cm et 0,20 cm. Un nombre croissant d’analyses sont réalisées avec des plaques de microtitration à 96 puits avec fond en plastique ou en quartz. La concentration d’une substance qui absorbe la lumière à des longueurs d’onde spécifiques peut être déterminée à partir de la loi de Beer :
A = εcl,
où A est l’absorbance de l’échantillon à une longueur d’onde spécifiée, c est la concentration de l’échantillon, l est la longueur du trajet, et ε est le coefficient d’extinction, ou absorptivité molaire. ε a pour unité M-1 cm-1 ou mM-1 cm-1. Si la valeur de ε est connue pour une substance particulière, il est possible de calculer la concentration de cette substance dans une solution en mesurant son absorption dans cette solution. En utilisant la loi de Beer, il est possible de calculer la vitesse de changement de la concentration au cours d’une réaction. Une erreur potentielle en utilisant les mesures d’absorption résulte d’une déviation de la loi de Beer, car elle n’est valable que pour une gamme finie de valeurs d’absorption. Ainsi, comme elle peut ne pas s’appliquer à des absorbances supérieures à 1, les essais doivent être conçus pour que les valeurs expérimentales soient inférieures à cette valeur. Il est possible de contourner certains de ces problèmes en utilisant des cuvettes dont la longueur du trajet est plus courte. Un échantillon dont l’absorbance est de 1,00 dans une cuvette de 1,00 cm de longueur de trajet aura une absorbance de 0,20 dans une cuvette de 0,20 cm de longueur de trajet. En général, travailler avec une absorbance d’environ 0,5 représente un compromis entre la minimisation du bruit optique inhérent à un spectrophotomètre et l’obtention d’un signal raisonnable à mesurer. La turbidité d’une solution peut disperser la lumière et produire une absorbance apparente. La filtration ou la centrifugation peuvent être utilisées pour éliminer ces particules. Bien que les modifications de la longueur du trajet permettent de contourner certains écarts par rapport à la linéarité (c’est-à-dire lorsque l’absorbance est si élevée que le spectrophotomètre ne peut pas effectuer une mesure précise), ces écarts sont souvent dus à des interactions intermoléculaires entre les espèces absorbantes. La dimérisation (ou la formation d’eximères d’ordre supérieur) se produit à des concentrations plus élevées de l’espèce absorbante. Dans ces cas, la loi de Beer sera respectée si la concentration du produit est diminuée. Ceci peut être réalisé soit en ralentissant la réaction (en diminuant la concentration d’enzyme), soit en prenant des mesures sur une période plus courte (avant que des déviations de la loi de Beer ne soient rencontrées).