Alai

Pour les besoins de cet article de blog (plus à venir sur les différents types de fixateurs…), nous nous concentrerons principalement sur l’utilisation du paraformaldéhyde/formaldéhyde, communément appelé PFA, qui est le fixateur le plus couramment utilisé en cytométrie en flux. Le PFA fait spécifiquement référence à la forme polymère solide du formaldéhyde (et se dissout en formaldéhyde monomère en solution aqueuse), de sorte que ce que l’on appelle habituellement de manière canonique « fixation au PFA » utilise en fait la solution de formaldéhyde monomère. Dans ce cas, PFA et formaldéhyde sont synonymes et interchangeables.
Une solution allant de 1 à 4% de PFA est généralement utilisée pour la fixation d’échantillons pour la cytométrie en flux. Dans le cas de la désinfection d’échantillons infectieux, des concentrations aussi faibles que 0,37 % peuvent désinfecter efficacement des échantillons provenant de patients infectés par le VIH1. Une incubation allant jusqu’à 45-60 minutes avec 1% de PFA, et 15-20 minutes avec 4% de PFA (par exemple le tampon de BioLegend) est suffisante pour fixer complètement les cellules, et les cellules peuvent être soit utilisées pour un traitement en aval (perméabilisation pour les cibles intracellulaires), soit stockées pour une analyse future à ce stade.
Durant une procédure de coloration de cytométrie en flux de routine qui implique une coloration des marqueurs de surface, il y a plusieurs étapes où vous pouvez décider de fixer vos échantillons – fixer après la coloration des marqueurs de surface, ou fixer avant.
Dans certains cas, la décision du moment où vous pouvez fixer est… fixe. Par exemple, si vous analysez des cibles phospho, la liaison de certains antigènes de surface par des anticorps peut modifier les voies de signalisation intracellulaires peu de temps après le contact, entraînant ainsi un artefact dans vos résultats de phosphorylation. Auquel cas, vous devez fixer les cellules avant l’ajout des anticorps de surface (c’est pourquoi le protocole que nous recommandons d’utiliser pour notre tampon True-Phos™ Perm afin d’analyser les cibles de phosphorylation intracellulaires est conçu de manière à ce que l’étape de fixation précède les autres procédures). Chacun a ses propres avantages et inconvénients, mais voici quelques éléments à surveiller dans chaque cas.