Alai

Établissement de la plage de température

Les conditions de laboratoire couramment utilisées pour les cultures de Macrostomum lignano sont les suivantes : température de 20 °C, humidité de 60 % et cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h. Ces conditions ont été choisies principalement parce qu’elles sont optimales pour la croissance de la diatomée Nitzschia curvilineata, qui est la principale source de nourriture des vers. Pour évaluer les conditions de température qui peuvent être utilisées dans l’expérience, nous avons d’abord établi la plage de température dans laquelle les vers survivent. Bien que la congélation des vers se soit avérée mortelle, ils pouvaient survivre lorsqu’ils étaient conservés à 4 °C pendant au moins deux semaines. Cependant, comme la diatomée ne se développe pas dans ces conditions, nous avons décidé d’exclure 4 °C des expériences futures. Les autres températures inférieures à 20 °C ont également été exclues de l’expérience, puisque l’objectif premier de l’étude était de trouver des conditions qui accélèrent la croissance et le développement. De l’autre côté du spectre des températures, les vers se dissolvent lorsqu’ils sont conservés à 42 °C pendant deux heures, et meurent après une semaine de culture à 37 °C. Par conséquent, nous avons décidé d’utiliser 20 °C, 25 °C, 30 °C et 35 °C comme conditions expérimentales pour étudier les effets à long terme de la température sur M. lignano (Fig. 1).

Réponse au choc thermique

Pour étudier quelles températures induisent une réponse au stress chez les vers, nous avons surveillé l’activité du promoteur du choc thermique 20 (Mlig-hsp20). Tout d’abord, nous avons réalisé une RT-PCR quantitative pour mesurer le niveau d’expression de Mlig-hsp20 à 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C et 35 °C. Il n’y avait pas de différence significative dans le niveau d’expression de Hsp20 entre 20 °C et 25 °C (Fig. 2a). Cependant, une augmentation faible (2 fois), mais significative (P = 0,027, test t), de l’expression a été observée à 30 °C par rapport à 20 °C (Fig. 2a). Une augmentation de plus de 10 fois du niveau d’expression a été observée à 33 °C, qui a augmenté à plus de 100 fois à la température la plus élevée testée de 35 °C (Fig. 2a). Dans le second test, nous avons créé une lignée transgénique exprimant la protéine mScarlet-I sous le contrôle du promoteur Mlig-hsp20 (Fig. 2b) et mesuré le niveau de fluorescence 24 h après une incubation de 2 h à différentes températures allant de 20 °C à 37 °C (Fig. 2c, d). Une augmentation de plus de deux et dix fois de la fluorescence a été observée à 34 °C et 37 °C respectivement (Fig. 2c).

Vitesse du développement embryonnaire

Selon Morris et al, il faut environ 120 h (cinq jours) aux œufs de Macrostomum pour se développer complètement lorsque les œufs sont conservés à 20 °C. Pour étudier comment la température affecte la vitesse du développement embryonnaire et de l’éclosion, nous avons prélevé des embryons fraîchement pondus et suivi leur développement jusqu’à l’éclosion à différentes températures. Pour étudier les différences potentielles dues au contexte génétique, nous avons utilisé deux lignées de M. lignano qui sont actuellement utilisées dans la majorité des études sur M. lignano, les lignées DV1 et NL10. Ces lignées sont indépendamment dérivées de populations de type sauvage provenant du même endroit géographique et diffèrent par une duplication du chromosome entier mais se comportent autrement de manière très similaire dans des conditions de laboratoire. Nous avons d’abord étudié l’effet de la basse température. À 4 °C, le développement des œufs est arrêté et ils peuvent être conservés pendant au moins un mois, et reprennent leur développement une fois remis à des températures plus élevées. Ensuite, nous avons étudié la vitesse de développement des œufs à des températures comprises entre 20 °C et 35 °C. Comme le montre la figure 3, lorsqu’ils sont conservés dans des conditions standard (20 °C), les œufs commencent à éclore après six jours. L’augmentation de la température a entraîné un développement embryonnaire proportionnellement plus rapide et une éclosion plus précoce, qui était deux fois plus rapide à 35 °C qu’à 20 °C et ne prenait que trois jours. À noter qu’environ 10 % des œufs ne sont pas éclos après huit jours d’incubation à 20 °C, contre moins de 5 % à des températures plus élevées, ce qui suggère que même la plus haute température testée, 35 °C, n’a pas d’effets néfastes sur la survie des embryons.

Reproduction

Le taux de reproduction est un facteur très important pour un organisme modèle, car les animaux avec un temps de génération plus court permettent une génération plus rapide de données dans les expériences génétiques. En outre, si les animaux produisent un grand nombre de descendants, les données générées auront, dans la plupart des cas, une puissance statistique plus élevée.

Pour évaluer l’impact de la température sur le taux de reproduction de M. lignano, nous avons comparé le nombre de descendants générés au cours de cinq semaines par des vers maintenus à différentes conditions de température. L’expérience a commencé avec des éclosions pour incorporer le développement postembryonnaire dans l’étude, et les lignées DV1 et NL10 ont été utilisées. Il a fallu trois semaines aux éclosions des deux lignées pour se développer et produire leur première progéniture à 20 °C, tandis qu’à 25 °C, des éclosions ont été observées en deux semaines pour la lignée NL10, mais pas pour DV1. A 30 °C et 35 °C, les deux lignées ont produit de la progéniture déjà après deux semaines (Fig. 4). À partir de trois semaines, le nombre d’éclosions par semaine a augmenté, passant de moins de 200 à 20 °C à plus de 300 à des températures supérieures à 20 °C ; le nombre d’éclosions était le plus élevé pour les vers maintenus à 30 °C. Cela était vrai pour les deux milieux génétiques. Ceci était vrai pour les deux fonds génétiques, et nous n’avons pas observé de différences significatives entre les lignées DV1 et NL10 (Fig. 4).

Bien que les températures de 30 °C et plus aient entraîné un plus grand nombre d’éclosions, elles activent également une réponse de choc thermique (Fig. 2). Pour étudier l’effet à long terme de la température élevée et les stress potentiels qu’elle peut avoir sur les vers, nous avons conservé les vers aux températures choisies et surveillé les aberrations morphologiques après trois et six mois de culture. Les vers conservés à 25 °C n’ont montré aucun changement morphologique aux deux points de contrôle par rapport aux vers conservés à 20 °C (Fig. 5). Cependant, dans les conditions de température de 30 °C et de 35 °C, diverses aberrations de la morphologie générale ont été observées. Après trois mois, un nombre accru de kystes, des tissus endommagés et des testicules élargis étaient couramment présents dans les lignées DV1 et NL10 (Fig. 5). Aucun des vers maintenus à 35 °C n’a survécu jusqu’au point de contrôle de six mois, et tous les vers ayant survécu à 30 °C présentaient des aberrations morphologiques (Fig. 5). Par conséquent, une exposition prolongée aux températures supérieures à 30 °C est préjudiciable pour M. lignano.

Temps de régénération

Puisque le principal attrait de M. lignano comme organisme modèle est sa capacité de régénération, nous avons ensuite étudié comment la température influence la régénération. Il est communément admis qu’une température plus élevée entraîne une augmentation de l’activité métabolique globale . Pour évaluer l’influence de la température sur le temps nécessaire à un ver pour régénérer complètement son corps après une amputation au-dessus de la région des testicules, nous avons suivi la régénération des testicules et l’apparition des spermatozoïdes dans la vésicule séminale en utilisant une lignée transgénique NL22 établie précédemment, qui exprime la GFP sous le contrôle du promoteur ELAV spécifique des testicules et des spermatozoïdes . L’utilisation d’un tel marqueur transgénique offre une meilleure précision, cohérence et efficacité dans l’évaluation de l’étendue de la régénération. En effet, nous n’avons observé aucune variation significative lors de l’évaluation du temps d’apparition du signal GFP après amputation à toutes les températures testées (tableau 1).

Comme prévu, la vitesse de régénération a augmenté avec la température (tableau 1). Si nous prenons le temps de régénération à 20 °C comme taux standard, alors pour la régénération des testicules, les coefficients de température calculés sont Q10 = 4 à 25 °C et Q10 = 3 pour 30 °C et 35 °C. Cela montre que l’effet le plus important est obtenu en augmentant la température à 25 °C, et que la régénération la plus rapide a lieu à 30 °C, sans autre avantage de l’augmentation de la température sur le temps de régénération. Par conséquent, des températures de 25 °C et 30 °C devraient être envisagées dans les expériences de régénération sur M. lignano, car cela raccourcit la durée d’une expérience de deux à trois fois (tableau 1).

Interférence ARN

La réduction de l’expression des gènes par interférence ARN (ARNi) est actuellement la principale approche pour les études de perte de fonction chez M. lignano . Dans cette approche, les animaux sont imbibés d’ARN double brin contre le gène cible, et souvent des traitements prolongés pendant plusieurs semaines sont nécessaires pour observer un phénotype . Nous avons testé l’influence de la température sur la vitesse de développement du phénotype après un traitement ARNi. Pour ce faire, nous avons éliminé Mlig-ddx39, un gène connu pour sa fonction dans la prolifération cellulaire chez M. lignano et un phénotype létal robuste. Comme pour le test de reproduction, nous avons utilisé les lignées DV1 et NL10 pour cette expérience (Tableau 2). À 20 °C, il a fallu environ 20 jours pour que tous les animaux meurent après le knockdown de Mlig-ddx39. Lorsque les vers étaient maintenus à des températures plus élevées, la mort survenait plus rapidement : à 11 et 8 jours pour les vers maintenus à 25 °C et 30 °C respectivement. Il n’y avait pas de différence visible entre les deux souches utilisées pour l’expérience (tableau 2). Ensuite, nous avons cherché à savoir si l’augmentation observée de la vitesse de manifestation du phénotype ARNi ddx39 à des températures plus élevées est attribuable à une plus grande efficacité de l’élimination du gène par l’ARNi, ou à d’autres facteurs. Pour cela, nous avons mesuré par qRT-PCR l’abondance des transcrits Mlig-ddx39 à différents moments après le début de l’expérience RNAi à différentes températures (Fig. 6). Les animaux traités avec un ARNdb contre gfp ont été utilisés comme contrôles de référence. À toutes les températures testées, aucune variation significative n’a été observée dans les niveaux d’expression de Mlig-ddx39 entre les échantillons de contrôle au cours de l’expérience (Fig. 6). Dans le même temps, pour les animaux traités par le dsRNA Mlig-ddx39, une baisse de ~ 80 % du niveau de transcrits ddx39 a été observée déjà après un jour de traitement à 20 °C ou 25 °C, et même une baisse plus importante de ~ 90 % à 30 °C. Cependant, les jours suivants, les niveaux de knockdown se sont stabilisés à environ 95 % à toutes les températures. Ainsi, nous concluons que la cinétique de l’ARNi elle-même n’est pas significativement affectée par la température. Au lieu de cela, le raccourcissement observé du temps pour la manifestation du phénotype Mlig-ddx39 RNAi à des températures plus élevées peut être expliqué par l’augmentation du taux de renouvellement cellulaire.

Pour vérifier si l’accélération du développement des phénotypes ARNi à des températures élevées peut être généralisée à d’autres gènes, nous avons étudié le gène Mlig-sperm1, dont le knockdown entraîne une morphologie anormale des spermatozoïdes et des testicules hypertrophiés . Il s’agit d’un phénotype ARNi lent qui prend 2 à 3 semaines pour se développer à 20 °C. Pour quantifier l’étendue du phénotype à différentes températures, au jour 4 du traitement ARNi, nous avons compté la fraction d’animaux dont les testicules étaient élargis au point de se toucher. (Fig. 7). Comme pour les résultats obtenus avec l’ARNi Mlig-ddx39, les températures plus élevées ont entraîné un développement plus rapide du phénotype, et alors qu’aucun testicule suffisamment élargi n’a été observé après quatre jours de traitement par ARNd à 20 °C, 25 et 85 % des animaux avaient développé des testicules élargis à 25 °C et 30 °C respectivement (Tableau 2). Par conséquent, comme pour la régénération, les phénotypes ARNi peuvent être accélérés avec la température chez M. lignano et des températures plus élevées peuvent être utilisées pour raccourcir la durée des expériences.

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