HCoV-.229E (VR-740) et HCoV-OC43 (VR-1558) ont été propagées dans des fibroblastes humains diploïdes pulmonaires MRC-5 (CCL-171) et WI-38 (CCL-75), respectivement (toutes provenant de l’ATCC, Manassas, VA). Les deux lignées cellulaires humaines ont été cultivées dans du MEM complété par 10 % de sérum fœtal de bovin (FBS), 2 mM de L-alanyl-L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Le milieu d’infection virale était constitué de MEM ou de RPMI-1640 plus 2 % de FBS inactivé par la chaleur pour HCoV-229E et HCoV-OC43, respectivement. Les souches virales ont été propagées par inoculation de flacons contenant des cellules hôtes vieilles de 24 heures, qui étaient confluentes à 80-90%. Après une heure d’incubation, la monocouche cellulaire a été lavée et incubée dans un milieu d’infection frais pendant trois ou quatre jours à 35 °C pour HCoV-229E et à 33 °C pour HCoV-OC43. Le surnageant contenant le stock viral actif a ensuite été recueilli par centrifugation (300 g pendant 15 minutes). Le titre du virus a été déterminé par la dose infectieuse de 50 % de la culture tissulaire TCID50 en évaluant les effets cytopathiques (CPE), qui ont été notés au microscope à fond clair (10×) comme vacuolisation du cytoplasme, arrondissement des cellules et mue.
Chambre d’irradiation d’aérosol de paillasse
Une chambre d’irradiation d’aérosol/virus dynamique à un passage a été utilisée pour générer, exposer et collecter des échantillons d’aérosol comme décrit précédemment23. Les aérosols viraux ont été générés en ajoutant une solution virale dans un nébuliseur de thérapie respiratoire à aérosol étendu à haut débit (Westmed, Tucson, AZ) et en utilisant une pompe à air avec un débit d’entrée de 11 L/min. Le virus s’est écoulé dans la chambre et a été mélangé à de l’air sec et humidifié pour maintenir l’humidité entre environ 50 et 70 %. L’humidité relative, la température et la distribution granulométrique de l’aérosol ont été contrôlées tout au long du fonctionnement. L’aérosol a été exposé à la lumière UVC lointaine et finalement collecté à l’aide d’un BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
La lampe UVC lointaine a été positionnée à environ 22 cm de la chambre d’exposition aux UV et dirigée vers la fenêtre en plastique transmettant les UV de 26 cm × 25,6 cm × 254 μm (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). Conformément à nos expériences précédentes utilisant cette chambre23, le débit à travers le système était de 12,5 L/min. Le volume de la zone d’exposition aux UV était de 4,2 L, de sorte que chaque aérosol était exposé pendant environ 20 secondes lorsqu’il traversait la fenêtre. L’ensemble de la chambre d’irradiation était contenu dans une armoire de biosécurité de niveau 2 et toutes les entrées et sorties d’air étaient équipées de filtres HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) pour empêcher toute contamination indésirable d’entrer ou de sortir du système.
Performance de la chambre d’irradiation
La chambre d’irradiation personnalisée a simulé la transmission de virus aérosolisés produits par la toux et la respiration humaines. La chambre a fonctionné à une humidité relative moyenne de 66 % et à une température moyenne de 24 °C pour toutes les séries. La distribution moyenne de la taille des particules était de 83 % entre 0,3 μm et 0,5 μm, 12 % entre 0,5 μm et 0,7 μm, et 5 % >0,7 μm (tableau 3). Les virus aérosolisés ont été efficacement transmis par le système, comme en témoigne le contrôle (exposition nulle) montrant une intégration claire du virus (figures 2 et 3, panneaux supérieurs gauches).
Lampe à UVC lointains et dosimétrie
La source d’UVC lointains utilisée dans cette étude était un module de lampe excimère KrCl de 12 W 222-nm fabriqué par USHIO America (article #9101711, Cypress, CA). La lampe est équipée d’une fenêtre de filtrage optique exclusive pour réduire les émissions de la lampe en dehors du pic d’émission de 222 nm du KrCl. La lampe a été positionnée à 22 cm de la fenêtre de la chambre d’exposition et dirigée vers le centre de la fenêtre. Les mesures de la puissance optique ont été effectuées à l’aide d’un photodétecteur en silicium amélioré par l’UV à faible puissance 818-UV/DB avec un wattmètre optique 843-R (Newport, Irvine, CA). La dosimétrie a été effectuée avant de commencer une expérience pour mesurer la fluence à l’intérieur de la chambre à la position de l’aérosol.
La distance entre la lampe et la chambre d’irradiation a permis à une seule lampe d’irradier uniformément toute la zone de la fenêtre d’exposition. Les mesures effectuées à l’aide du photodétecteur en silicium ont indiqué une intensité d’exposition d’environ 90 μW/cm2 sur toute la zone d’exposition. La chambre est équipée d’une surface en aluminium réfléchissante opposée à la fenêtre d’exposition. Comme dans nos précédents travaux avec cette chambre23, la réflectivité de cette surface était d’environ 15 %. Nous avons donc estimé de manière conservatrice que l’intensité sur l’ensemble de la zone d’exposition était de 100 μW/cm2. La lampe étant positionnée à 22 cm de la fenêtre et compte tenu des 20 secondes nécessaires à une particule aérosol pour traverser la fenêtre d’exposition, nous avons calculé que la dose d’exposition totale à une particule était de 2 mJ/cm2. Nous avons utilisé des feuilles supplémentaires de fenêtres en plastique transmettant les UV pour réduire uniformément l’intensité à travers la région d’exposition afin de créer différentes conditions d’exposition. Alors que dans nos travaux précédents avec ces feuilles, nous avons mesuré une transmission plus proche de 65%23, pour ces tests, nous avons mesuré la transmission 222-nm de chaque feuille à environ 50%. Cette diminution de la transmission est probablement due à la photodégradation du plastique au fil du temps4. L’ajout d’une ou deux feuilles du plastique couvrant la fenêtre d’exposition diminue la dose d’exposition à 1 et 0,5 mJ/cm2, respectivement.
Protocole expérimental
Comme décrit précédemment23, la solution virale dans le nébuliseur était composée de 1 ml de milieu d’Eagle modifié (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) contenant 107-108 TCID50 de coronavirus, 20 ml d’eau déionisée et 0,05 ml de solution saline équilibrée de Hank avec calcium et magnésium (HBSS++). La chambre d’irradiation a fonctionné avec des particules virales en aérosol circulant dans la chambre et le canal de dérivation pendant 5 minutes avant chaque prélèvement, afin d’établir la valeur d’HR souhaitée. Le prélèvement des échantillons a été initié en modifiant le flux d’air du canal de dérivation vers le BioSampler à l’aide d’un ensemble de vannes à trois voies. Le BioSampler a été initialement rempli de 20 ml de HBSS++ pour capturer l’aérosol. Pendant chaque période d’échantillonnage, qui a duré 30 minutes, l’intérieur de la chambre d’irradiation a été exposé à une lumière UVC lointaine de 222 nm entrant par la fenêtre en plastique. La variation de la dose d’UVC lointains délivrée aux particules d’aérosol a été obtenue en insérant des films plastiques transparents aux UV supplémentaires comme décrit ci-dessus, délivrant ainsi les trois doses d’essai de 0,5, 1,0 et 2,0 mJ/cm2. Les études de contrôle à dose nulle ont été réalisées avec la lampe excimère éteinte. Une fois la période d’échantillonnage terminée, la solution du BioSampler a été utilisée pour les essais d’infectivité virale.
TCID50
Nous avons utilisé l’essai de dose infectieuse de 50 % sur culture tissulaire pour déterminer l’infectivité virale28. Brièvement, 105 cellules hôtes ont été plaquées dans chaque puits de plaques à 96 puits le jour précédant l’expérience. Les cellules ont été lavées deux fois dans du HBSS++ et des dilutions sérielles 1:10 dans le milieu d’infection du virus exposé provenant du BioSampler ont été superposées aux cellules pendant deux heures. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans du HBSS++, recouvertes de milieu d’infection frais et incubées pendant trois ou quatre jours à 34 °C. Les effets cytopathiques (ECP) ont été notés au microscope à fond clair (10×) comme la vacuolisation du cytoplasme, l’arrondissement des cellules et la desquamation. La DICT50 a été calculée selon la méthode de Reed et Muench28,38. Pour confirmer les scores de l’ECP, les échantillons ont été fixés dans du méthanol à 100 % pendant cinq minutes et colorés avec du cristal violet à 0,1 %. Les résultats sont rapportés en tant qu’estimation des unités formant des plaques (PFU)/ml en utilisant la conversion PFU/ml = 0,7 TCID50 en appliquant la distribution de Poisson29.
Immunofluorescence
Pour évaluer si des doses croissantes de lumière 222-nm réduisaient le nombre de cellules infectées, nous avons effectué un protocole standard d’immunocoloration fluorescente pour détecter un antigène viral dans les cellules humaines hôtes23. En bref, 2 × 105 cellules hôtes (cellules MRC-5 pour HCoV-229E et WI-38 pour HCoV-OC43) ont été placées dans chaque puits de plaques à 48 puits le jour précédant l’expérience. Après un passage dans la chambre d’irradiation pendant 30 minutes, 150 μl de suspension virale recueillie dans le BioSampler ont été superposés sur la monocouche de cellules hôtes. Les cellules ont été incubées avec le virus pendant une heure, puis lavées trois fois avec du HBSS++, et enfin incubées pendant la nuit dans un milieu d’infection frais. Les cellules infectées ont ensuite été fixées dans du méthanol glacé à 100 % à 4 °C pendant 5 minutes et marquées avec une glycoprotéine de pointe anti-coronavirus humain (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) au 1:200 dans du HBSS++ contenant 1 % d’albumine de sérum bovin (BSA ; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) à température ambiante pendant une heure en agitant légèrement. Les cellules ont été lavées trois fois dans du HBSS++ et marquées avec de l’anti-souris de chèvre Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 dans du HBSS++ contenant 1% de BSA, à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité avec une légère agitation. Après trois lavages dans HBSS++, les cellules ont été colorées avec du Vectashield contenant du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et observées avec l’objectif 10× d’un microscope à fluorescence Olympus IX70 équipé d’un appareil photo numérique à haute résolution et à haut rendement Photometrics PVCAM et du logiciel Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Pour chaque dose de 222 nm et chaque genre de virus, les résultats représentatifs ont été répétés deux fois. Pour chaque échantillon, jusqu’à dix champs de vue d’images fusionnées de DAPI et d’Alexa Fluor-488 ont été acquis.
Analyse des données
La fraction survivante (S) du virus a été calculée en divisant la fraction PFU/ml à chaque dose UV (PFUUV) par la fraction à dose nulle (PFUcontrols) : S = PFUUV/PFUcontrols. Les valeurs de survie ont été calculées pour chaque expérience répétée et transformées en logarithme naturel (ln) pour rapprocher la distribution des erreurs de la normale39. Une régression linéaire robuste utilisant les moindres carrés itérés repondérés (IWLS)40,41 a été effectuée dans le logiciel R 3.6.2 en utilisant ces valeurs ln normalisées comme variable dépendante et la dose d’UV (D, mJ/cm2) comme variable indépendante. En utilisant cette approche, la survie du virus a été décrite par une cinétique de premier ordre selon l’équation4:
où k est la constante de vitesse d’inactivation UV ou le facteur de susceptibilité (cm2/mJ). La régression a été effectuée avec le terme d’interception fixé à zéro représentant la définition d’une survie relative de 100 % à une dose UV nulle, séparément pour chaque souche virale étudiée. Les données à la dose zéro, qui par définition représentent ln = 0, n’ont pas été incluses dans la régression. Les incertitudes (intervalles de confiance à 95 %, IC) pour le paramètre k de chaque souche virale ont été estimées par bootstrapping pour chaque méthode de régression, car le bootstrapping peut donner lieu à des estimations d’incertitude plus réalistes, par rapport à l’approximation analytique standard basée sur la normalité asymptotique, dans de petits ensembles de données tels que ceux utilisés ici (n = 3 pour HCoV-229E et n = 4 pour HCoV-OC43). La qualité de l’ajustement a été évaluée par le coefficient de détermination (R2). L’analyse des résidus pour l’autocorrélation et l’hétéroscédasticité a été effectuée à l’aide du test de Durbin-Watson42 et du test de Breusch-Pagan (mis en œuvre par le paquet R lmtest)43, respectivement. Les estimations des paramètres (k) pour chaque souche virale ont été comparées entre elles sur la base des IC à 95 % et directement par un test t, en utilisant les tailles d’échantillon, les valeurs k et leurs erreurs standard. La section transversale d’inactivation du virus, D90, qui correspond à la dose d’UV inactivant 90 % du virus exposé, a été calculée comme suit : D90 = – ln/k. Les autres valeurs de D ont été calculées de la même manière. Les autres valeurs de D ont été calculées de façon similaire.