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Les fibroblastes RTT montrent une activation défectueuse de l’autophagie dans des conditions de famine

Afin de vérifier l’hypothèse concernant une autophagie défectueuse chez les patients RTT, nous avons analysé l’activation de l’autophagie dans des conditions de famine dans des fibroblastes primaires de la peau isolés de patients RTT (n = 4) et de sujets sains (n = 4)17,19.

Nous avons d’abord défini la viabilité dans le temps des fibroblastes sains et RTT cultivés en milieu de famine par des tests d’exclusion au MTT et au bleu Trypan. Par rapport à la viabilité des fibroblastes RTT cultivés en milieu standard, la viabilité des fibroblastes RTT a diminué après 4 h de privation (20 ± 3,3 % de cellules mourantes, p < 0,05) ; ce pourcentage a considérablement augmenté après 6-8 h de privation (60 ± 5,1 % de cellules mourantes, p < 0,05) (Fig. 1a). A l’inverse, les fibroblastes sains étaient encore totalement viables après 4 h de privation de nourriture avec seulement une très faible réduction de la viabilité après 6-8 h (10 ± 1,2% de cellules mourantes, p < 0,01) par rapport à la viabilité des fibroblastes cultivés en milieu standard (Fig. 1a). Ainsi, à partir d’une comparaison directe de la viabilité des deux lignées cellulaires à chaque point de temps, il est apparu que la viabilité des fibroblastes RTT était sévèrement compromise à partir du temps 4 h (voir détails dans les légendes des figures, p < 0,05). De plus, une analyse par Western blotting (WB) a mis en évidence que dans les fibroblastes RTT qui avaient été privés de nourriture pendant 4 h, une bande correspondant au fragment p25 de la poly (ADP-ribose)polymérase-1 (PARP) était fortement augmentée (96 ± 4 %, p < 0,001) par rapport à la faible détection au temps 0. Ce fragment est libéré par la dégradation dépendante des caspases de la protéine pendant la phase précoce de l’induction de l’apoptose (Fig. 1b)35. Le fragment p25 était presque indétectable dans les fibroblastes sains dans les mêmes conditions expérimentales.

Ces données ont confirmé que les fibroblastes RTT ne tolèrent pas la croissance dans un milieu affamé, et subissent rapidement l’apoptose. Par conséquent, nous avons étudié plus avant le flux autophagique en surveillant la clairance du marqueur LC3B-II en présence et en l’absence d’un inhibiteur de lysosome, tel que la chloroquine (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Après avoir exclu un effet cytotoxique lié à la CQ (figure supplémentaire S1), des fibroblastes sains et RTT ont été cultivés dans un milieu de repos ou de famine pendant 2 h en présence ou en l’absence de 20 µM de CQ pour quantifier le rapport LC3B-II/GAPDH par WB (figure 2a). Le profil du rapport LC3B-II/GAPDH (ou tout autre contrôle interne qui n’est pas modulé par l’autophagie) dans des conditions d’activation de l’autophagie et en présence et en absence de CQ (ou tout autre inhibiteur lysosomal) est considéré comme une stratégie valable pour surveiller le flux d’autophagie.

Dans les fibroblastes sains, cultivés dans un milieu standard, LC3B-I était clairement immunodétecté, tandis que LC3B-II était faible. Le rapport LC3BII/GAPDH des fibroblastes sains cultivés en milieu standard en absence et en présence de CQ était comparable (Fig. 2a, panneau de gauche). Cette observation suggère que l’autophagie basale était presque indétectable dans les fibroblastes sains (Fig. 2a, panneau de gauche).

Lorsque ces cellules ont été cultivées dans le milieu de famine et en l’absence de CQ pendant 2 h, le ratio LC3B-II/GAPDH a augmenté (60 ± 4.8 %, p < 0,05) par rapport à celui des fibroblastes sains cultivés dans un milieu standard en l’absence ou en présence de CQ (qui était, comme mentionné précédemment, identique) (Fig. 2a, panneau gauche et droit). Ce comportement indique en effet que LC3-I a subi une lipidation pour former LC3B-II, qui est un marqueur précoce de l’activation de l’autophagie24,25,26,27,28,29,30. Afin de tester la présence de cette activation de l’autophagie, nous avons cultivé les cellules dans un milieu de famine en présence de CQ pendant 2 h et elles ont montré une nouvelle augmentation du rapport LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5%, p < 0,001) par rapport aux fibroblastes sains cultivés dans un milieu standard (Fig. 2a, panneau gauche et droit).

De plus, la différence entre le ratio LC3B-II/GAPDH des fibroblastes sains cultivés en milieu de famine en l’absence et en présence de CQ était statistiquement significative (p < 0,05, Fig. 2a, panneau de gauche)

Donc, selon l’interprétation standard du motif LC3B-II par analyse WB, le résultat global indique que, en l’absence de nutriments, les fibroblastes sains stimulent la formation d’autophagosomes qui subissent une accumulation en présence de CQ. Ce comportement est compatible avec un flux autophagique normal24,25,26,27,28,29,30. De manière intéressante, dans le cas des fibroblastes RTT cultivés dans un milieu standard, alors que LC3B-I était clairement immuno-détecté, LC3B-II était très peu visible dans les cellules à la fois en absence et en présence de CQ (Fig. 2a, panneau de gauche). Dans des conditions de famine et en l’absence de CQ, l’apparition d’une faible bande correspondant à LC3B-II dans les fibroblastes RTT seulement après une longue exposition du filtre suggère qu’au moins une lipidation minimale de LC3B-I a eu lieu (Fig. 2a, panneau de gauche). Par conséquent, le rapport LC3B-II/GAPDH entre les fibroblastes RTT cultivés dans un milieu de famine en l’absence de CQ était augmenté (93 ± 5,5%, p < 0,001) par rapport à celui des fibroblastes RTT cultivés dans un milieu standard en l’absence de CQ (Fig. 2a, panneau de droite).

Pour renforcer notre hypothèse concernant un éventuel flux d’autophagie défectueux, nous avons vérifié la dégradation de deux substrats rapporteurs d’autophagie reconnus dans les fibroblastes sains et RTT affamés pendant 2 et 4 h en l’absence de CQ, à savoir : (i) la protéine p62/SQSMT1, qui aide à la clairance des agrégats de protéines poly-ubiquitinées et est elle-même dégradée par les hydrolases lysosomales36 ; (ii) le protéasome 20 S, qui est rapidement dégradé dans des conditions de famine37,38. Par rapport au niveau basal des deux protéines (c’est-à-dire au temps 0), une diminution dans le temps du rapport p62/tubuline (44 ± 10 % après 4 h, p < 0,001) et du rapport PSMA-3/GAPDH (c’est-à-dire la sous-unité α7 du protéasome 20 S) (45 ± 3,1 % après 2 h, 11 ± 5,2 % après 4 h, dans les deux cas p < 0,001) a été observée dans les fibroblastes sains (Fig. 2b, panneau supérieur).

Dans le cas des fibroblastes RTT, la diminution du rapport p62/tubuline au fil du temps n’était pas statistiquement significative, même après 4 h (89 ± 9 %), tandis que la diminution du rapport PSMA3/GAPDH à 2 h (81 ± 4,4 %, p < 0,05) et 4 h (78 ± 5,1 %, p < 0,05) était significativement différente si on la compare au niveau basal de la protéine (c’est-à-dire au temps 0) (Fig. 2b, panneau inférieur). Cependant, les différences entre le groupe sain et le groupe RTT n’étaient statistiquement significatives dans le cas du rapport p62/tubuline qu’à 4 h (p < 0,05), tandis que le rapport PSMA3/GAPDH était significativement différent entre les groupes expérimentaux à la fois à 2 h (p < 0.05) et 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, panneau inférieur).

Il est intéressant de noter que les profils de β-tubuline et de GAPDH, utilisés comme contrôles internes pour la coloration de p62 et la coloration de PSMA3, respectivement, n’ont pas été modifiés pendant 4 h de privation de nourriture dans les fibroblastes sains. Cependant, l’intensité de la bande de β-tubuline, ainsi que celle de la bande de GAPDH, ont diminué de manière significative dans les fibroblastes RTT privés de nourriture pendant 4 h par rapport à ce qui a été observé au temps 0 ou au temps 2 h pour ces cellules (Fig. 2b, panneau supérieur). Cette réduction est probablement due au nombre plus faible de fibroblastes RTT vivants récoltés à ce moment-là (en accord avec la faible viabilité des fibroblastes RTT à 4 h de privation de nourriture rapportée dans la Fig. 1a) et non à une régulation négative de la β-tubuline au fil du temps. Dans l’ensemble, il a été constaté que les fibroblastes RTT ne dégradaient pas efficacement ces substrats rapporteurs d’autophagie, soutenant l’hypothèse d’une autophagie défectueuse.

Pour éclairer davantage les caractéristiques de ce blocage, nous avons réalisé une analyse par immuno-fluorescence en utilisant l’anticorps LC3B. Nous avons analysé des fibroblastes sains et RTT cultivés dans un milieu standard en l’absence de CQ (condition de repos) et dans le milieu de famine pendant 2 h en présence ou en l’absence de 20 µM de CQ (Fig. 2c). Conformément à la lenteur du métabolisme des cellules primaires, nous avons constaté que les fibroblastes sains au repos et les fibroblastes RTT présentaient une coloration LC3B+ faible et diffuse avec un faible pourcentage de cellules présentant plus de 10 points (c’est-à-dire des autophagosomes) (8 ± 5 % et 1 ± 0,5 %, respectivement), ce qui indique que, par immunofluorescence, l’autophagie basale était peu détectable, en accord avec les données rapportées dans la figure 2a. 2a.

Par rapport aux cellules cultivées en milieu standard, le pourcentage de fibroblastes sains cultivés en milieu de famine (en l’absence de CQ) présentant au moins 10 autophagosomes LC3B+ était nettement augmenté (82 ± 10%, p < 0,005), alors que les fibroblastes RTT cultivés en milieu de famine présentaient une légère augmentation (17 ± 8%, p < 0,001). En fait, le pourcentage de fibroblastes sains cultivés en milieu de famine présentant au moins 10 autophagosomes était significativement plus élevé que celui des fibroblastes RTT cultivés dans les mêmes conditions expérimentales (p < 0,005). Les autophagosomes étaient principalement localisés dans la région périnucléaire. En présence de CQ, une coloration LC3B+ diffuse et intense attendue a en outre été observée, même si dans ce cas, la coloration diffuse n’a pas permis de quantifier précisément le nombre de points.

L’administration de CQ était inefficace dans les fibroblastes RTT, indiquant clairement une biogénèse des autophagosomes sévèrement altérée (Fig. 2c).

Compte tenu de la pertinence de l’altération putative sur la biogénèse des autophagosomes, une approche supplémentaire a été adoptée pour confirmer cette observation. Les fibroblastes sains et RTT, affamés pendant 2 h en l’absence de CQ, ont été colorés avec un colorant spécifique (Cyto-ID) pour la membrane autophagosomale et analysés par immuno-fluorescence. Même dans ce cas, alors que dans les fibroblastes sains, plusieurs autophagosomes ont été effectivement détectés, dans les fibroblastes RTT, seul un nombre limité de petites vésicules isolées a été observé (figure supplémentaire S2). La différence dans le pourcentage de cellules présentant au moins 5 points positifs Cyto-ID entre les fibroblastes sains et les fibroblastes RTT était très significative (80 ± 4% vs 8 ± 6%, respectivement, p < 0,001). Par conséquent, l’analyse globale a fourni la preuve qu’une biogenèse défectueuse des autophagosomes se produit dans les fibroblastes primaires RTT.

Les GR matures des patients RTT porteurs de la mutation R255X MeCP2 conservent les mitochondries

Nous avons ensuite cherché à déterminer si d’autres signes d’autophagie défectueuse pouvaient être observés ex vivo chez les patients RTT. Étant donné que la clairance des mitochondries est un mécanisme classique d’autophagie qui se produit dans les réticulocytes circulants au stade final de la maturation des GR32,33,34, nous avons étendu notre étude aux GR humains ex vivo pour vérifier si les mitochondries sont retenues dans ces cellules.

Donc, les GR des patients RTT (n = 15) et des donneurs sains (n = 11) ont été analysés par microscopie électronique à transmission (MET). L’examen TEM a mis en évidence la présence de structures ressemblant à des mitochondries (SRM) dans les globules rouges de forme biconcave isolés de la majorité des patients RTT (11 sur 15). Parmi ces 11 patients RTT, trois d’entre eux présentaient la cohorte de symptômes la plus sévère et également une fréquence élevée de GR (20 ± 4%) (Fig. 3a-h). Comme prévu, les MRS étaient indétectables dans les GR sains (Fig. 3I). Les différences entre les sujets sains et les sujets RTT étaient statistiquement significatives (p < 0,0004 ; Fig. 3, panneau inférieur).

Néanmoins, la gravité des symptômes était basée sur l’évaluation clinique et, en conséquence, les trois patients présentant les symptômes les plus sévères portaient tous la mutation R255X du gène MeCP2 qui est associée à un pronostic sévère39.

En conséquence et compte tenu du fait que nous n’avions pas la possibilité de recruter un plus grand nombre de sujets porteurs d’autres mutations avec une fréquence faible ou nulle de globules rouges retenant la mitochondrie, nous avons concentré notre attention sur l’analyse de ces trois patients. L’analyse TEM a documenté, dans ces trois cas susmentionnés, la présence de structures ressemblant à des mitochondries intactes ou partiellement digérées (soit denses aux électrons, soit lucides), qui étaient de forme normale ou en haltère (allongée), et généralement petites avec des cristaux peu visibles (Fig. 3a-h). En fait, la taille et la forme générale de ces structures correspondent à celles des mitochondries retenues dans les GR matures dans des modèles murins non RTT de macroautophagie défectueuse (c’est-à-dire les souris Ulk1-/-) ou de mitophagie (c’est-à-dire les souris Nix-/-) rapportés par d’autres auteurs32,33. Il est intéressant de noter que les altérations morphologiques des mitochondries que nous avons observées, telles que la dimension réduite, la structure allongée (c’est-à-dire en forme d’haltère) et, en particulier, la présence de cristaux peu visibles, ont déjà été décrites dans le muscle et le cervelet de patients atteints de RTT20,21. Pour confirmer l’identité mitochondriale de la MRS, nous avons coloré des globules rouges provenant de donneurs sains et de ces patients RTT présentant des symptômes sévères avec un anticorps anti-COX-IV (cytochrome c oxydase). Un nombre statistiquement significatif d’érythrocytes provenant des trois patients RTT par rapport aux érythrocytes de sujets sains (35 ± 5 % contre 0,2 ± 0,01 %, respectivement, p < 0,005) présentait un motif en pointillé COX-IV+ qui suggérait la rétention de mitochondries (Fig. 4). Le contenu moyen de mitochondries par cellule a été calculé comme étant de 1,2 ± 0,2 organites par RBC chez les patients RTT et de 0,002 ± 0,0002 chez les sujets sains (p < 0,005) (Fig. 4). Les différences dans le pourcentage de RBCs présentant des mitochondries entre la TEM et les investigations IF peuvent être attribuées au fait que la possibilité de détecter les organelles par TEM dépend strictement de la section fine de la cellule, ce qui peut entraver leur présence, alors que l’approche IF n’est pas limitée de cette façon.

Pour confirmer davantage ces résultats, nous avons effectué une analyse cytofluorimétrique des GR des sujets sains et des trois patients RTT en utilisant un anticorps anti-CD71 (récepteur de la transferrine) et anti-COX-IV. La fréquence de la positivité de CD71, un marqueur des GR immatures, n’était pas significativement différente chez les sujets sains et les patients RTT (1,34 ± 0,13 % contre 1,03 ± 0,3 % ; figure supplémentaire S3). Il faut souligner que les patients RTT inclus dans l’étude présentaient des paramètres hématologiques normaux et, même si l’indice réticulocytaire était, au moins chez quelques sujets, inférieur à celui trouvé chez les sujets sains, les différences globales entre les deux groupes de patients n’étaient pas statistiquement significatives (Tableau 1). Inversement, une population COX-IV+ très faible a été observée dans les GR sains, alors qu’une fréquence plus élevée de cellules COX-IV+ a été détectée dans les GR RTT (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, respectivement, p < 0,01). Ces résultats ont été confirmés en utilisant la coloration verte Mitotracker (MT) (Fig. S3 supplémentaire), qui a documenté une augmentation des RBC MT+ chez un patient RTT (portant la mutation R255X MeCP2) par rapport à un patient sain (0,37% vs 0,16%), similaire à celle observée avec l’anticorps COX-IV précédemment décrit.

Afin de valider davantage l’identité des MRS, un nombre égal de GR a été lysé et analysé par WB dans des conditions dénaturantes et réductrices. Les filtres ont été colorés avec des anticorps contre la sirtuine-3, une dé-acétylase spécifiquement exprimée dans la matrice mitochondriale40. La sirtuine3 a été choisie comme marqueur mitochondrial dans cette approche car, contrairement à la COX-IV et à d’autres marqueurs mitochondriaux, son poids moléculaire ne se chevauche pas avec celui des chaînes d’hémoglobine ou des oligomères d’hémoglobine dans le schéma électrophorétique. Chez les trois patients RTT examinés, une augmentation statistiquement significative du rapport sirtuine-3/GAPDH a été observée pour chaque patient par rapport au même rapport dans les lysats de GR sains (p < 0. 001) (figure supplémentaire S4).

Ces trois patients, tous porteurs de la mutation MeCP2 (c’est-à-dire R255X), présentaient le pire phénotype, avec un pourcentage très élevé de GR présentant au moins une mitochondrie. Cependant, le nombre très limité de patients à notre disposition a rendu difficile toute conclusion statistiquement significative concernant la possibilité d’une relation entre la gravité de la maladie et le degré de rétention des mitochondries à l’intérieur des GR matures. Un autre point, qui semble mériter d’être mentionné, est que la rétention des mitochondries à l’intérieur des GR matures dans les modèles murins Ulk1-/- et Nix-/- précédemment cités a conduit à une anémie ou à d’autres pathologies sanguines probablement déterminées par la clairance accrue de ces érythrocytes anormaux par les macrophages de la rate32,33. Chez les patients RTT recrutés dans cette étude, seule une diminution très limitée et non statistiquement significative des valeurs hématologiques a été enregistrée, et ils ne semblaient pas être anémiques ou souffrir d’autres pathologies sanguines. La divergence entre nos résultats et ceux des modèles murins pourrait être due au fait que le knock-down des gènes de macroautophagie ou de mitophagie (c’est-à-dire les souris Ulk1-/- et Nix-/-, respectivement) induit un pourcentage très élevé de GR contenant des mitochondries et la rétention de plusieurs organelles dans les GR, ce qui est un défaut considérablement plus grave que celui documenté chez les patients RTT32,33. Même si nous avons observé un nombre significativement élevé de GR contenant des mitochondries chez les patients porteurs de la mutation R255X (Fig. 4), le nombre d’organites dans chaque cellule était très faible dans les GR RTT (Fig. 4). Cela pourrait ne pas être suffisant pour entraîner des altérations morphologiques et fonctionnelles majeures dans les GR. Il convient de mentionner que, bien que la rétention des mitochondries à l’intérieur des GR puisse être au moins un facteur déterminant du grave déséquilibre redox observé dans les GR RTT en association avec un changement significatif de l’état énergétique et du métabolisme (c’est-à-dire, ATP/ADP et rapport NADH/NAD), des études récentes ont rapporté que la cinétique des liaisons de l’oxygène à l’hémoglobine et la diffusion de l’oxygène se superposent presque à celles des patients sains16,17,23,41.

L’apparente divergence entre nos résultats et ceux provenant de modèles murins pourrait également trouver une explication dans le fait que le syndrome RTT est un trouble lié au chromosome X qui affecte presque exclusivement le sexe féminin et que l’inactivation d’une des deux copies du chromosome X (XCI) est un phénomène aléatoire se produisant au cours de l’embryogenèse, comme cela est largement documenté42,43. Ainsi, dans le cas du syndrome RTT, on s’attendrait à ce que le XCI aléatoire produise, dans les cellules somatiques, un mosaïcisme avec la moitié des cellules exprimant l’allèle de type sauvage, l’autre moitié exprimant l’allèle muté du gène MeCP2. Il est intéressant de noter que la possibilité qu’au moins certaines mutations de MeCP2 puissent être associées à un XCI non aléatoire dans le tissu neuronal est en accord avec la variabilité phénotypique des patients atteints de RTT (et également pour les cas familiers de RTT), une caractéristique qui a été largement documentée42,43. En théorie, si la moitié des progéniteurs hématologiques de la moelle osseuse conservent le chromosome X portant la mutation MeCP2, seule la moitié des GR matures circulants porteraient l’allèle pathologique, ce qui limiterait le nombre de GR circulants contenant des mitochondries. Néanmoins, une prévalence accrue de XCI non aléatoire en faveur de l’allèle de type sauvage a été observée dans les leucocytes circulants de patients RTT sporadiques42,43. Sur ce point, il serait très difficile de déterminer si les patients qui présentent ou non un faible nombre d’érythrocytes contenant des mitochondries présentent également une déficience moins importante de la mitophagie ou de la XCI non aléatoire, ce qui entraînerait une sélection positive des progéniteurs hématologiques portant l’allèle MeCP2 de type sauvage.

En conséquence, étant donné la complexité de la pathologie du RTT, nous préférons affirmer que les patients RTT, ainsi que les patients affectés par le syndrome de Pearson, pourraient représenter les premiers cas de rétention de mitochondries dans les GR matures humains44.

Mise en évidence d’une autophagie défectueuse dans le cervelet des souris Mecp2-null

Compte tenu du fait que le RTT est un trouble neurodéveloppemental, afin d’étayer davantage nos résultats qui pointent vers une autophagie défectueuse systémique, nous avons réalisé des analyses immuno-histochimiques pour p62 et l’ubiquitine du cervelet (i.Nous avons réalisé des analyses immuno-histochimiques de la p62 et de l’ubiquitine du cervelet (organe dans lequel des altérations des mitochondries et d’autres anomalies histologiques majeures ont été observées)21,45 de souris de type sauvage âgées de 9 semaines et de souris Mecp2 -/y âgées de 5 semaines (asymptomatiques) et de 9 semaines (symptomatiques). Pour chaque condition expérimentale, l’organe isolé de trois animaux a été analysé. Par rapport à la souris wt, le cervelet RTT a montré une augmentation de l’intensité de la coloration p62 (Fig. 5a) et Ub (Fig. 5b) dans toutes les couches (c’est-à-dire les granules, Purkinje et les couches corticales), qui était linéaire avec l’âge des animaux. De plus, les structures hyper colorées ressemblaient à des agrégats intracellulaires. Selon l’évaluation semi-quantitative de l’intensité de la coloration de p62/SQSTM1 et Ub, les différences entre le cervelet des animaux de 5 semaines par rapport aux animaux sains, et des animaux de 9 semaines par rapport aux animaux de 5 semaines étaient statistiquement significatives (p < 0.05).

La différence histologique entre les animaux asymptomatiques et les animaux symptomatiques suggère que l’altération de l’autophagie pourrait être absente ou faible à la naissance, tandis qu’elle se renforce progressivement au cours des premières semaines de vie (et peut-être lorsque l’activité de MeCP2 atteint un pic), donnant lieu aux symptômes.