La médecine de laboratoire a fait des progrès considérables au cours des deux dernières décennies. Les tests de charge virale ont évolué, passant des tests PCR nichés à l’amplification médiée par la transcription puis à la PCR en temps réel, et continuent d’évoluer avec des méthodes comme la PCR numérique. Ces progrès ont permis d’obtenir des tests de charge virale plus sensibles avec une gamme dynamique plus large, ce qui permet aux médecins de mieux comprendre la réponse d’un patient au traitement et la progression de la maladie.
Un exemple d’amélioration de la prise en charge des patients grâce aux progrès du diagnostic moléculaire a été la prise en charge des patients atteints du VIH-1. Selon les directives de traitement actuelles, le succès du traitement est défini comme une concentration d’ARN du VIH-1 inférieure à 75 copies/mL.1 La définition de l’échec du traitement varie selon les directives mondiales, nationales et nationales, mais est généralement définie comme une concentration d’ARN du VIH-1 comprise entre 50 et 1000 copies/mL.1-3
Ces seuils de traitement se situent à l’extrémité inférieure de la plage dynamique des tests PCR en temps réel, où la précision et la reproductibilité peuvent être remises en question. Les facteurs susceptibles d’influencer les performances des tests de charge virale sont la plateforme automatisée, la chimie d’extraction des acides nucléiques, la sélection et la conception des amorces/sondes PCR, les conditions d’amplification PCR et la stratégie de calibration des tests. Nous passerons ici en revue différentes approches de conception et leur impact potentiel sur la performance du test et le résultat clinique. (Figure 1)
Procédé d’extraction
Il convient de considérer attentivement le type d’échantillon et l’analyte lors du choix de la chimie d’extraction. Par exemple, dans le cas du VIH-1, le Department of Health and Human Services (DHHS) conseille d’utiliser l’ARN du VIH-1 comme marqueur de la virémie du VIH-1.1
La distinction entre l’ARN du VIH-1 et l’ADN proviral est importante car ce dernier n’est pas un marqueur de la réplication virale active, mais plutôt de la libération du réservoir latent du virus, qui a déjà été intégré dans les cellules. Une chimie d’extraction qui purifie à la fois l’ARN du VIH-1 et l’ADN proviral ne fournirait pas une représentation précise de la véritable réplication virale au médecin ; par conséquent, dans le cas de ce virus, seule la chimie d’extraction qui purifie spécifiquement l’ARN du VIH-1 devrait être utilisée afin d’exclure l’ADN proviral de la quantification en aval.
Alternativement, l’utilisation de la chimie d’extraction de l’acide nucléique total (TNA) pour la quantification du VIH-1 pourrait potentiellement conduire à des résultats faussement positifs ou à une quantification inexacte, ce qui aurait des effets indésirables sur la gestion du patient. La chimie d’extraction TNA peut être utilisée pour des types d’échantillons plus difficiles tels que l’urine ou les selles ou pour les tests qui doivent détecter les deux cibles ARN/ADN.
Sélection de la cible
L’extrême diversité virale rencontrée parmi les souches de VIH, de VHB et de VHC est une préoccupation majeure pour s’assurer que les tests de diagnostic moléculaire (MDx) donnent le bon résultat, quelle que soit la ou les souches présentes dans un échantillon.
Pour répondre à cette préoccupation, la conception optimale du test doit commencer par la sélection de la cible de l’amorce/sonde dans une région génétiquement conservatrice où la diversité virale aura le moins d’impact potentiel. Les régions génétiquement conservatrices ne peuvent être déterminées qu’en comparant les séquences de diverses souches virales.
Pour répondre à ce besoin, un programme de surveillance mondial est essentiel pour évaluer de manière exhaustive la diversité virale existante en circulation pour les souches de VIH, de VHB et de VHC.4 Dans un programme de surveillance, les séquences générées à partir de souches collectées dans des régions géographiquement diverses sont utilisées pour déterminer quelles régions d’un génome viral sont les mieux conservées et se prêtent à la détection par un test de diagnostic moléculaire. En utilisant les séquences virales circulantes pour informer la conception du test, le risque que des souches soient manquées par un test est considérablement réduit.
Conception de la sonde et conditions de cyclage de la PCR
En plus de la sélection de la région cible, la conception de la sonde et les conditions de cyclage de la PCR sont critiques lorsque nous cherchons à assurer une quantification précise de la charge virale. La conception de la sonde doit être tolérante aux polymorphismes naturels et, par conséquent, aux mésappariements potentiels qui peuvent se produire dans la région cible donnée. Au fil du temps, la technologie des sondes a évolué, tout comme la méthodologie de la PCR. L’éventail plus large d’applications MDx basées sur la technologie PCR, au-delà de la quantification virale, nécessite l’utilisation de différents modèles de sondes. Les sondes de liaison au sillon mineur sont généralement utilisées pour le génotypage et la détection du polymorphisme d’un seul nucléotide.
Les sondes TaqMan sont souvent utilisées dans les tests où les régions cibles ont un haut degré de conservation. Les sondes partiellement double brin, qui tolèrent mieux les niveaux élevés d’hétérogénéité génétique principalement en raison de la longueur de la sonde et des conditions de liaison, sont utilisées dans les régions où le degré d’hétérogénéité est élevé5.
En plus de la conception de la sonde, les conditions de cyclage font souvent l’objet d’une optimisation de la conception, afin d’atteindre l’exigence de performance (par exemple, la tolérance des mésappariements potentiels.) Le cyclage à phases appariées est une approche qui incorpore des cycles à une température plus basse pour réduire la rigueur initiale, qui est suivie par des cycles à des températures élevées pour préserver la spécificité. Cette approche atténue l’effet négatif sur la quantification de l’échantillon des mésappariements potentiels des amorces. Dans le cas où il est difficile d’éviter l’impact significatif de polymorphismes rares, la détection d’une seconde cible peut être intégrée dans la conception du test. Lorsque la diversité des séquences affecte la détection d’une région du génome viral, la détection d’une seconde région garantit l’obtention d’un résultat précis. Compte tenu de la complexité des tests moléculaires et de la grande diversité virale, il convient d’envisager une approche globale faisant appel à la surveillance mondiale et à la conception de sondes spécifiques à une cible lors de la conception de tests moléculaires. La simple adaptation d’une stratégie telle que la double cible peut donner un faux sentiment de sécurité.
Stratégie d’étalonnage
La stratégie d’étalonnage fait partie intégrante de la conception des tests moléculaires et est essentielle pour garantir la reproductibilité sur une large gamme dynamique. La plupart des méthodologies quantitatives de gestion thérapeutique utilisent actuellement une courbe d’étalonnage externe pour déterminer la concentration d’un analyte.
Dans ces tests, le signal de l’analyte dans un échantillon de patient est comparé à un ensemble d’échantillons dont la concentration est connue et une régression linéaire simple (y=mx+b) est utilisée pour calculer la charge virale. Cette approche utilise généralement des calibrateurs qui sont traités comme des échantillons de patients tout au long du processus, ce qui permet d’étalonner à la fois les réactifs et les instruments d’extraction et d’amplification.
On pourrait aussi utiliser des calibrateurs qui ne sont pas traités par l’extraction, mais cette approche comporte le risque que la différence de récupération ou un changement dans la composition du réactif ne soit pas pris en compte, ce qui pourrait entraîner des différences de quantification.
Une autre stratégie moins fréquemment utilisée est un standard quantitatif interne. Cette application utilise une ligne de régression polynomiale d’ordre 3 (y = ax3 + bx2 + cx + d) à travers la gamme linéaire avec une différence maximale autorisée par rapport à la linéarité. Des études antérieures ont suggéré que la différence admissible acceptable par rapport à la linéarité pour certains des tests était de ± 0,2 Log10.6 Cette différence admissible par rapport à la linéarité et à l’approche d’étalonnage explique également le biais souvent observé entre les méthodologies, ainsi qu’une plus grande imprécision à l’extrémité inférieure de la gamme dynamique où les décisions cliniques sont souvent prises.
Conclusion
La performance exacte et précise des tests moléculaires est essentielle pour une gestion thérapeutique appropriée. Des résultats de charge virale inexacts pourraient conduire à une prise en charge inappropriée et le patient pourrait être laissé sous traitement défaillant. Cette erreur de diagnostic a des implications beaucoup plus larges que la prise en charge d’un seul patient, car elle peut également entraîner une augmentation de la transmission de la souche virale résistante. Du point de vue de la gestion du traitement, un virus présentant des mutations associées à la résistance est plus difficile à traiter avec des options thérapeutiques plus restreintes. En outre, les taux de faux positifs peuvent ajouter des coûts inutiles pour des tests répétés ou des tests de résistance plus coûteux, ainsi que de l’anxiété pour le patient et le médecin.
- Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV developed by Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Consulté en septembre 2019.
- Société clinique européenne du sida (EACS). Lignes directrices de l’EACS version 9.1 octobre 2018.
- Département national de la santé, Afrique du Sud, avril 2015, consulté le 2 août 2017 : https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. Surveillance mondiale du VIH : fondement de la découverte de rétrovirus et du développement de tests. Journal de virologie médicale. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Sondes d’ADN linéaire partiellement double brin : nouvelle conception pour la détection sensible de cibles génétiquement polymorphes. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Développement d’une deuxième version du test quantitatif du virus de l’hépatite C Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan avec une meilleure inclusivité du génotype. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Reconnaissance : L’auteur tient à reconnaître et à remercier Mary Rodgers et Shihai Huang pour leur révision de cet article.