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Les coronavirus ont provoqué deux pandémies de grande ampleur au cours des deux dernières décennies, le SRAS et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)8,9. On a généralement pensé que le SARSr-CoV – qui se trouve principalement chez les chauves-souris – pourrait provoquer une future épidémie10,11. Nous rapportons ici une série de cas causés par une épidémie de pneumonie non identifiée à Wuhan, dans la province de Hubei, en Chine centrale. Cette épidémie, qui a débuté sur un marché local de fruits de mer, s’est considérablement développée pour infecter 2 761 personnes en Chine, est associée à 80 décès et a entraîné l’infection de 33 personnes dans 10 autres pays au 26 janvier 202012. Les symptômes cliniques typiques de ces patients sont la fièvre, la toux sèche, les difficultés respiratoires (dyspnée), les maux de tête et la pneumonie. L’apparition de la maladie peut entraîner une insuffisance respiratoire progressive due à des lésions alvéolaires (observées par des images de tomographie informatisée thoracique transversale), voire le décès. Les cliniciens ont déterminé que la maladie était causée par une pneumonie d’origine virale en se basant sur les symptômes cliniques et d’autres critères, notamment une augmentation de la température corporelle, une diminution du nombre de lymphocytes et de globules blancs (bien que les taux de ces derniers soient parfois normaux), de nouveaux infiltrats pulmonaires sur la radiographie du thorax et aucune amélioration évidente après un traitement aux antibiotiques pendant trois jours. Il semble que la plupart des premiers cas avaient des antécédents de contact avec le marché de fruits de mer d’origine ; cependant, la maladie a maintenant progressé pour être transmise par contact interhumain.

Des échantillons provenant de sept patients atteints de pneumonie sévère (dont six sont des vendeurs ou des livreurs du marché de fruits de mer), qui ont été admis à l’unité de soins intensifs de l’hôpital Jin Yin-Tan de Wuhan au début de l’épidémie, ont été envoyés au laboratoire de l’Institut de virologie de Wuhan (WIV) pour le diagnostic de l’agent pathogène responsable (tableau de données étendues 1). En tant que laboratoire étudiant le CoV, nous avons d’abord utilisé des amorces PCR pan-CoV pour tester ces échantillons13, étant donné que l’épidémie s’est produite en hiver et sur un marché – le même environnement que les infections du SRAS. Nous avons trouvé cinq échantillons positifs à la PCR pour les CoVs. Un échantillon (WIV04), prélevé dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), a été analysé par métagénomique à l’aide du séquençage de nouvelle génération afin d’identifier les agents étiologiques potentiels. Sur les 10 038 758 lectures totales – dont 1 582 lectures totales ont été retenues après filtrage des lectures du génome humain – 1 378 (87,1 %) séquences correspondaient à la séquence du SARSr-CoV (Fig. 1a). Par assemblage de novo et PCR ciblée, nous avons obtenu un génome de CoV de 29 891 paires de bases qui partageait une identité de séquence de 79,6 % avec le SARS-CoV BJ01 (numéro d’accession GenBank AY278488.2). Une couverture élevée du génome a été obtenue en remappant les lectures totales à ce génome (Données étendues Fig. 1). Cette séquence a été soumise à GISAID (https://www.gisaid.org/) (numéro d’accession EPI_ISL_402124). Suivant le nom donné par l’Organisation mondiale de la santé (OMS), nous l’appelons provisoirement novel coronavirus 2019 (2019-nCoV). Quatre autres séquences génomiques complètes de 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 et WIV07) (numéros d’accession GISAID EPI_ISL_402127-402130) qui étaient identiques à plus de 99,9 % les unes aux autres ont ensuite été obtenues à partir de quatre patients supplémentaires en utilisant le séquençage de nouvelle génération et la PCR (tableau de données étendues 2).

Le génome du virus se compose de six cadres de lecture ouverts (ORF) majeurs qui sont communs aux coronavirus et d’un certain nombre d’autres gènes accessoires (figure 1b). Une analyse plus poussée indique que certains des gènes du 2019-nCoV présentaient une identité de séquence nucléotidique inférieure à 80 % avec le SARS-CoV. Cependant, les séquences d’acides aminés des sept domaines de réplicase conservés dans l’ORF1ab qui ont été utilisés pour la classification des espèces de CoV étaient identiques à 94,4% entre 2019-nCoV et SARS-CoV, ce qui suggère que les deux virus appartiennent à la même espèce, SARSr-CoV.

Nous avons ensuite constaté qu’une courte région de l’ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) d’un coronavirus de chauve-souris (BatCoV RaTG13) – qui avait été précédemment détecté chez Rhinolophus affinis de la province du Yunnan – présentait une identité de séquence élevée avec 2019-nCoV. Nous avons effectué un séquençage complet de cet échantillon d’ARN (numéro d’accession GISAID EPI_ISL_402131). L’analyse Simplot a montré que le 2019-nCoV était hautement similaire à RaTG13 sur l’ensemble du génome (Fig. 1c), avec une identité de séquence globale du génome de 96,2 %. En utilisant les séquences génomiques alignées du 2019-nCoV, de RaTG13, du SARS-CoV et des SARSr-CoV de chauve-souris précédemment signalés, aucune preuve d’événements de recombinaison n’a été détectée dans le génome du 2019-nCoV. L’analyse phylogénétique du génome complet et des séquences génétiques de RdRp et de spike (S) a montré que, pour toutes les séquences, RaTG13 est le parent le plus proche de 2019-nCoV et qu’il forme une lignée distincte des autres SARSr-CoV (Fig. 1d et Données étendues Fig. 2). La protéine spike de liaison au récepteur codée par le gène S était très divergente par rapport aux autres CoVs (Données étendues Fig. 2), avec moins de 75 % d’identité de séquence nucléotidique avec tous les SARSr-CoVs précédemment décrits, à l’exception d’une identité nucléotidique de 93,1 % avec RaTG13 (Données étendues Tableau 3). Les gènes S du 2019-nCoV et du RaTG13 sont plus longs que ceux des autres SARSr-CoV. Les principales différences dans la séquence du gène S de 2019-nCoV sont les trois courtes insertions dans le domaine N-terminal ainsi que les changements dans quatre des cinq résidus clés du motif de liaison au récepteur par rapport à la séquence de SARS-CoV (Données étendues, Fig. 3). Il convient d’étudier plus avant si les insertions dans le domaine N-terminal de la protéine S du 2019-nCoV confèrent une activité de liaison aux acides sialiques comme c’est le cas dans le MERS-CoV. La relation phylogénétique étroite avec RaTG13 fournit des preuves que 2019-nCoV pourrait être originaire des chauves-souris.

Nous avons rapidement développé une méthode de détection basée sur la qPCR sur la base de la séquence du domaine de liaison au récepteur du gène S, qui était la région la plus variable du génome (figure 1c). Nos données montrent que les amorces pouvaient différencier le 2019-nCoV de tous les autres coronavirus humains, y compris le bat SARSr-CoV WIV1, qui partage 95 % d’identité avec le SARS-CoV (données étendues Fig. 4a, b). Parmi les échantillons obtenus des sept patients, nous avons constaté que six échantillons de LBA et cinq échantillons d’écouvillons oraux étaient positifs pour le 2019-nCoV lors du premier prélèvement, comme l’ont montré la qPCR et la PCR classique. Cependant, nous n’avons plus pu détecter d’échantillons positifs pour le virus dans les écouvillons oraux, les écouvillons anaux et les échantillons de sang prélevés chez ces patients lors du deuxième échantillonnage (Fig. 2a). Cependant, nous recommandons que d’autres cibles de la qPCR, y compris les gènes RdRp ou de l’enveloppe (E), soient utilisées pour la détection de routine du 2019-nCoV. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la maladie pourrait être transmise par voie aérienne, bien que nous ne puissions pas exclure d’autres voies de transmission possibles, car des investigations supplémentaires, incluant davantage de patients, sont nécessaires.

Pour la détection sérologique du 2019-nCoV, nous avons utilisé une protéine de nucléocapside (N) précédemment développée à partir de la Rp3 du SARSr-CoV de chauve-souris comme antigène pour les tests immuno-enzymatiques (ELISA) IgG et IgM, car cette protéine partageait 92% d’identité d’acides aminés avec la protéine N du 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) et n’a montré aucune réactivité croisée avec d’autres coronavirus humains, à l’exception du SARSr-CoV7. Nous n’avons pu obtenir que cinq échantillons de sérum des sept patients présentant des infections virales. Nous avons contrôlé les taux d’anticorps viraux chez un patient (ICU-06) 7, 8, 9 et 18 jours après le début de la maladie (tableau 2 des données étendues). Une tendance claire a été observée pour les titres d’IgG et d’IgM, qui ont augmenté avec le temps, sauf que le titre d’IgM a diminué dans le dernier échantillon (Fig. 2b). Comme deuxième analyse, nous avons testé les échantillons de 5 des 7 patients positifs au virus environ 20 jours après l’apparition de la maladie pour la présence d’anticorps viraux (tableaux de données étendues 1, 2). Tous les échantillons des patients – mais pas ceux des individus sains – étaient fortement positifs pour les IgG virales (Fig. 2b). Nous avons ensuite isolé avec succès le virus (appelé 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) à partir de cellules Vero E6 et Huh7 en utilisant l’échantillon de LBA du patient ICU-06. Des effets cytopathogènes clairs ont été observés dans les cellules après une incubation de trois jours (Données étendues Fig. 6a, b). L’identité de la souche WIV04 a été vérifiée dans les cellules Vero E6 par microscopie à immunofluorescence en utilisant l’anticorps viral N à réaction croisée (Données étendues Fig. 6c, d) et par séquençage métagénomique, dont la plupart des lectures correspondaient à 2019-nCoV, et l’analyse qPCR a montré que la charge virale augmentait du jour 1 au jour 3 (Données étendues Fig. 6e, f). Les particules virales dans les coupes ultrafines des cellules infectées présentaient une morphologie typique de coronavirus, comme visualisé par microscopie électronique (Données étendues Fig. 6g). Pour confirmer davantage l’activité de neutralisation des échantillons viraux IgG-positifs, nous avons effectué des essais de séroneutralisation dans des cellules Vero E6 en utilisant les cinq sérums de patients qui étaient IgG-positifs. Nous démontrons que tous les échantillons étaient capables de neutraliser 100 TCID50 (50 % de la dose infectieuse en culture tissulaire) du 2019-nCoV à une dilution de 1:40-1:80. Nous montrons également que ce virus pourrait être neutralisé de manière croisée par le sérum anti-SARS-CoV de cheval (don de L.-F. Wang) à des dilutions de 1:40 ; cependant, le potentiel de réactivité croisée avec les anticorps du SRAS-CoV doit être confirmé avec le sérum anti-SARS-CoV des humains (tableau de données étendues 4).

ACE2 est connu pour être un récepteur cellulaire pour le SARS-CoV14. Pour déterminer si le 2019-nCoV utilise également l’ACE2 comme récepteur d’entrée cellulaire, nous avons mené des études sur l’infectivité du virus en utilisant des cellules HeLa exprimant ou non des protéines ACE2 provenant d’humains, de chauves-souris chinoises, de civettes, de porcs et de souris. Nous montrons que 2019-nCoV est capable d’utiliser toutes les protéines ACE2, à l’exception de l’ACE2 de souris, comme récepteur d’entrée pour pénétrer dans les cellules exprimant l’ACE2, mais pas dans les cellules qui n’expriment pas l’ACE2, ce qui indique que l’ACE2 est probablement le récepteur cellulaire par lequel 2019-nCoV pénètre dans les cellules (Fig. 3). Nous montrons également que 2019-nCoV n’utilise pas d’autres récepteurs de coronavirus, tels que l’aminopeptidase N (APN) et la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) (Données étendues Fig. 7).

L’étude fournit un rapport détaillé sur 2019-nCoV, l’agent étiologique probable responsable de l’épidémie actuelle de syndrome respiratoire aigu en Chine et dans d’autres pays. Une séroconversion nucléotidique et protéique virale spécifique a été observée chez tous les patients testés et apporte la preuve d’une association entre la maladie et la présence de ce virus. Cependant, il reste encore de nombreuses questions urgentes à résoudre. L’association entre le 2019-nCoV et la maladie n’a pas été vérifiée par des expérimentations animales pour répondre aux postulats de Koch visant à établir une relation causale entre un micro-organisme et une maladie. Nous ne connaissons pas encore la routine de transmission de ce virus entre les hôtes. Il semble que le virus soit de plus en plus transmissible entre les humains. Nous devons surveiller de près si le virus continue à évoluer pour devenir plus virulent. En raison de la pénurie de traitements spécifiques et compte tenu de la parenté du 2019-nCoV avec le SARS-CoV, certains médicaments et vaccins précliniques contre le SARS-CoV pourraient probablement être utilisés pour traiter ce virus. Enfin, compte tenu de la large diffusion du SARSr-CoV dans leurs réservoirs naturels, les recherches futures devraient être axées sur la surveillance active de ces virus dans des régions géographiques plus vastes. À long terme, des médicaments antiviraux et des vaccins à large spectre devraient être préparés pour les maladies infectieuses émergentes qui seront causées par ce groupe de virus à l’avenir. Plus important encore, des réglementations strictes contre la domestication et la consommation d’animaux sauvages devraient être mises en œuvre.

Note ajoutée dans la preuve : Depuis que cet article a été accepté, l’ICTV a désigné le virus comme étant le SARS-CoV-215 ; en outre, l’OMS a publié le nom officiel de la maladie causée par ce virus, qui est COVID-1916.