Alai

Establecer el rango de temperatura

Las condiciones de laboratorio comúnmente utilizadas para los cultivos de Macrostomum lignano son las siguientes: temperatura de 20 °C, humedad del 60% y ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h. Estas condiciones se eligieron principalmente porque son óptimas para el crecimiento de la diatomea Nitzschia curvilineata, que es la principal fuente de alimento para los gusanos. Para evaluar las condiciones de temperatura que se pueden utilizar en el experimento, primero se estableció el rango de temperatura en el que los gusanos sobreviven. Aunque la congelación de los gusanos resultó letal, pudieron sobrevivir cuando se mantuvieron a 4 °C durante al menos dos semanas. Sin embargo, como la diatomea no crece en estas condiciones, decidimos excluir los 4 °C de los experimentos posteriores. También se excluyeron del experimento otras temperaturas inferiores a 20 °C, ya que el objetivo principal del estudio era encontrar condiciones que aceleraran el crecimiento y el desarrollo. En el otro lado del espectro de temperaturas, los gusanos se disuelven cuando se mantienen a 42 °C durante dos horas, y mueren tras una semana de cultivo a 37 °C. Por lo tanto, hemos decidido utilizar 20 °C, 25 °C, 30 °C y 35 °C como condiciones experimentales para estudiar los efectos de la temperatura a largo plazo en M. lignano (Fig. 1).

Respuesta al choque térmico

Para investigar qué temperaturas inducen la respuesta al estrés en los gusanos, monitorizamos la actividad del promotor del choque térmico 20 (Mlig-hsp20). En primer lugar, realizamos una RT-PCR cuantitativa para medir el nivel de expresión de Mlig-hsp20 a 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C y 35 °C. No hubo diferencias significativas en el nivel de expresión de Hsp20 entre 20 °C y 25 °C (Fig. 2a). Sin embargo, se observó un pequeño (2 veces), pero significativo (P = 0,027, prueba t), aumento de la expresión a 30 °C en comparación con 20 °C (Fig. 2a). Se observó un aumento de más de diez veces en el nivel de expresión a 33 °C, que aumentó a más de 100 veces a la temperatura más alta probada de 35 °C (Fig. 2a). En la segunda prueba creamos una línea transgénica que expresaba la proteína mScarlet-I bajo el control del promotor Mlig-hsp20 (Fig. 2b) y medimos el nivel de fluorescencia 24 h después de una incubación de 2 horas a diferentes temperaturas que iban de 20 °C a 37 °C (Fig. 2c, d). Se observó un aumento de más de dos y diez veces en la fluorescencia a 34 °C y 37 °C respectivamente (Fig. 2c).

Velocidad del desarrollo embrionario

Según Morris et al. , los huevos de Macrostomum tardan unas 120 h (cinco días) en desarrollarse completamente cuando se mantienen a 20 °C. Para investigar cómo afecta la temperatura a la velocidad de desarrollo embrionario y a la eclosión, recogimos embriones recién puestos y controlamos su desarrollo hasta la eclosión a diferentes temperaturas. Para investigar las posibles diferencias debidas a los antecedentes genéticos, utilizamos dos líneas de M. lignano que se utilizan actualmente en la mayoría de los estudios sobre M. lignano, las líneas DV1 y NL10. Estas líneas se derivan de forma independiente de poblaciones de tipo salvaje de la misma ubicación geográfica y se diferencian por una duplicación del cromosoma completo, pero por lo demás se comportan de forma muy similar en condiciones de laboratorio. Primero estudiamos el efecto de la baja temperatura. A 4 °C el desarrollo de los huevos se detiene y pueden almacenarse durante al menos un mes, y reanudar su desarrollo una vez devueltos a temperaturas más altas. A continuación, estudiamos la rapidez con la que se desarrollan los huevos a temperaturas entre 20 °C y 35 °C. Como se muestra en la Fig. 3, cuando se mantuvieron en condiciones estándar (20 °C) los huevos empezaron a eclosionar al cabo de seis días. El aumento de la temperatura dio lugar a un desarrollo embrionario proporcionalmente más rápido y a una eclosión más precoz, que fue dos veces más rápida a 35 °C en comparación con 20 °C y tardó sólo tres días. Cabe destacar que alrededor del 10% de los huevos permanecen sin eclosionar después de ocho días de incubación a 20 °C, en comparación con menos del 5% a temperaturas más altas, lo que sugiere que incluso la temperatura más alta probada de 35 °C no tiene efectos perjudiciales en la supervivencia de los embriones.

Reproducción

La tasa de reproducción es un factor muy importante para un organismo modelo, ya que los animales con un tiempo de generación más corto permiten una generación más rápida de datos en los experimentos genéticos. Además, si los animales producen un gran número de crías, los datos generados tendrán, en la mayoría de los casos, una mayor potencia estadística.

Para evaluar el impacto de la temperatura en la tasa de reproducción de M. lignano hemos comparado el número de crías generadas en el transcurso de cinco semanas por gusanos mantenidos en diferentes condiciones de temperatura. El experimento se inició con crías para incorporar el desarrollo postembrionario en el estudio, y se utilizaron las líneas DV1 y NL10. Las crías de ambas líneas tardaron tres semanas en crecer y producir la primera progenie a 20 °C, mientras que a 25 °C se observaron crías en dos semanas para la línea NL10 pero no para DV1. A 30 °C y 35 °C ambas líneas produjeron progenie ya después de dos semanas (Fig. 4). A partir de las tres semanas, el número de crías producidas por semana aumentó de menos de 200 a 20 °C a más de 300 a temperaturas superiores a 20 °C; el número de crías fue mayor para los gusanos mantenidos a 30 °C. Esto fue así para ambos fondos genéticos, y no observamos diferencias significativas entre las líneas DV1 y NL10 (Fig. 4).

Aunque las temperaturas de 30 °C y superiores dieron lugar a más crías, también activan una respuesta de choque térmico (Fig. 2). Para investigar el efecto a largo plazo de la temperatura elevada y el estrés potencial que puede tener en los gusanos, mantuvimos a los gusanos a las temperaturas seleccionadas y observamos si había aberraciones morfológicas después de tres y seis meses de cultivo. Los gusanos mantenidos a 25 °C no mostraron cambios morfológicos en ambos puntos de control en comparación con los gusanos mantenidos a 20 °C (Fig. 5). Sin embargo, tanto en las condiciones de temperatura de 30 °C como de 35 °C, se observaron diversas aberraciones en la morfología general. Después de tres meses, tanto en la línea DV1 como en la NL10 se observó un mayor número de quistes, tejido dañado y testículos agrandados (Fig. 5). Ninguno de los gusanos mantenidos a 35 °C sobrevivió hasta el punto de control de los seis meses, y todos los gusanos que sobrevivieron a 30 °C mostraron aberraciones morfológicas (Fig. 5). Por tanto, la exposición prolongada a temperaturas superiores a 30 °C es perjudicial para M. lignano.

Tiempo de regeneración

Como el principal atractivo de M. lignano como organismo modelo es su capacidad de regeneración, estudiamos a continuación cómo influye la temperatura en la regeneración. Es comúnmente aceptado que una mayor temperatura conduce a un aumento de la actividad metabólica general . Para evaluar la influencia de la temperatura en el tiempo necesario para que el gusano regenere completamente su cuerpo tras la amputación por encima de la región de los testículos, hicimos un seguimiento de la regeneración de los testículos y de la aparición de espermatozoides en la vesícula seminal utilizando una línea transgénica previamente establecida NL22, que expresa GFP bajo el control del promotor ELAV específico de los testículos y los espermatozoides . El uso de este marcador transgénico proporciona una mayor precisión, consistencia y eficiencia en la evaluación del grado de regeneración. De hecho, no observamos ninguna variación significativa al evaluar el tiempo de aparición de la señal GFP después de la amputación a todas las temperaturas probadas (Tabla 1).

Como era de esperar, la velocidad de regeneración aumentó con la temperatura (Tabla 1). Si tomamos el tiempo de regeneración a 20 °C como la velocidad estándar, entonces para la regeneración de los testículos los coeficientes de temperatura calculados son Q10 = 4 a 25 °C y Q10 = 3 para 30 °C y 35 °C. Esto demuestra que el mayor efecto se obtiene al aumentar la temperatura a 25 °C, y que la regeneración más rápida tiene lugar a 30 °C, sin que el aumento de la temperatura tenga más ventajas sobre el tiempo de regeneración. Por lo tanto, las temperaturas de 25 °C y 30 °C deben ser consideradas en los experimentos de regeneración en M. lignano, ya que acorta la duración de un experimento de dos a tres veces (Tabla 1).

Interferencia de ARN

El bloqueo de la expresión génica por interferencia de ARN (RNAi) es actualmente el enfoque principal para los estudios de pérdida de función en M. lignano . En este enfoque, los animales se empapan con ARN de doble cadena contra el gen objetivo, y a menudo se requieren tratamientos prolongados durante varias semanas para observar un fenotipo . Hemos comprobado cómo influye la temperatura en la velocidad de desarrollo del fenotipo tras el tratamiento con RNAi. Para ello, derribamos Mlig-ddx39, un gen conocido por su función en la proliferación celular en M. lignano y un fenotipo letal robusto . Al igual que en la prueba de reproducción, utilizamos las líneas DV1 y NL10 para este experimento (Tabla 2). A 20 °C, todos los animales tardaron unos 20 días en morir tras el knockdown de Mlig-ddx39. Cuando los gusanos se mantuvieron a temperaturas más altas, la muerte se produjo más rápidamente: a los 11 y 8 días para los gusanos mantenidos a 25 °C y 30 °C respectivamente. No hubo diferencias visibles entre las dos cepas utilizadas para el experimento (Tabla 2). A continuación, investigamos si el aumento observado en la velocidad de manifestación del fenotipo ddx39 RNAi a temperaturas más elevadas es atribuible a una mayor eficiencia de eliminación del gen por RNAi, o a otros factores. Para ello, medimos mediante qRT-PCR la abundancia de los transcritos de Mlig-ddx39 en diferentes puntos temporales tras el inicio del experimento de RNAi a diferentes temperaturas (Fig. 6). Los animales tratados con dsRNA contra gfp se utilizaron como controles de referencia. En todas las temperaturas probadas no se observaron variaciones significativas en los niveles de expresión de Mlig-ddx39 entre las muestras de control durante el curso del experimento (Fig. 6). Al mismo tiempo, para los animales tratados con Mlig-ddx39 dsRNA se observó una caída de ~ 80% en el nivel de transcritos de ddx39 ya después de un día de tratamiento a 20 °C o 25 °C, e incluso una caída mayor de ~ 90% a 30 °C. Sin embargo, en los días siguientes, los niveles de knockdown se estabilizaron en torno al 95% en todas las temperaturas. Por lo tanto, concluimos que la cinética del ARNi en sí no se ve afectada significativamente por la temperatura. En cambio, el acortamiento del tiempo observado para la manifestación del fenotipo Mlig-ddx39 RNAi a temperaturas más altas puede explicarse por el aumento de la tasa de recambio celular.

Para comprobar si la aceleración del desarrollo de los fenotipos de RNAi a temperaturas elevadas puede generalizarse a otros genes, investigamos el gen Mlig-sperm1, cuyo knockdown conduce a una morfología anormal de los espermatozoides y a testículos agrandados . Se trata de un fenotipo de ARNi lento que tarda entre 2 y 3 semanas en desarrollarse a 20 °C . Para cuantificar el alcance del fenotipo a diferentes temperaturas, en el día 4 del tratamiento con RNAi contamos la fracción de animales con testículos agrandados hasta el punto de que se tocaban entre sí. (Fig. 7). De forma similar a los resultados obtenidos con el ARNi Mlig-ddx39, las temperaturas más altas dieron lugar a un desarrollo más rápido del fenotipo, y mientras que no se observaron testículos suficientemente agrandados tras cuatro días de tratamiento con ARNd a 20 °C, el 25 y el 85% de los animales habían desarrollado testículos agrandados a 25 °C y 30 °C respectivamente (Tabla 2). Por lo tanto, de forma similar a la regeneración, los fenotipos RNAi pueden acelerarse con la temperatura en M. lignano y pueden utilizarse temperaturas más altas para acortar la duración de los experimentos.