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Abstracto

Este estudio buscó determinar si la fase folicular acortada en mujeres mayores ovulatorias es secundaria a una foliculogénesis avanzada (es decir, más temprana) o acelerada (es decir, más rápida). Las mujeres ovulatorias normales, de entre 40 y 45 años (n = 15) y de entre 20 y 25 años (n = 13), se sometieron a una venopunción diaria y a una ecografía transvaginal a lo largo de la fase folicular de un ciclo menstrual espontáneo (ciclo de control) y después de la desregulación hipofisaria con un agonista de la GnRH (ciclo de estudio). Como era de esperar, los sujetos de mayor edad en los ciclos de control demostraron una FSH d 3 elevada y una fase folicular acortada en comparación con los sujetos más jóvenes. Tras la liberación de la supresión del eje hipotálamo-hipófisis-ovario, el pico de FSH de la fase folicular temprana se produjo antes (6,8 frente a 9,8 d; P < 0,01) y fue de mayor magnitud (12,1 frente a 6,5 mIU/ml; P < 0,01) en los sujetos de mayor edad. El tiempo transcurrido desde la liberación de la supresión hasta el subsiguiente aumento de LH también fue más corto (17,5 frente a 20,8 días; P < 0,01) en el grupo de mayor edad. Sin embargo, el tiempo desde el pico de FSH hasta el aumento de LH fue similar en los grupos de mayor y menor edad (10,7 frente a 11,0 días; P = 0,74). En comparación con las mujeres más jóvenes, los sujetos de mayor edad tenían niveles normales de estradiol e inhibina A en la fase folicular y niveles más bajos de inhibina B tanto en los ciclos de control como en los del estudio. Concluimos que la fase folicular acortada observada en las mujeres ovulatorias de mayor edad se debe a una selección más temprana del folículo dominante, independientemente de las influencias hormonales de la fase lútea precedente.

El envejecimiento reproductivo es un continuo que comienza muchos años antes de que se produzca una disfunción absoluta. Una manifestación importante del proceso de envejecimiento es una disminución progresiva de la fertilidad femenina que comienza en la última parte de la tercera década y se vuelve exponencial después de los 35 años (1, 2). Este deterioro de la fertilidad precede a los signos manifiestos de disfunción del eje hipotálamo-hipófisis-ovario (HPO), como la irregularidad menstrual, y la mayoría de las mujeres siguen teniendo ciclos menstruales regulares y ovulatorios hasta bien entrados los 40 años (3, 4). En los años que preceden a la transición menopáusica, la ovulación regular se mantiene, mientras que los ciclos menstruales se acortan progresivamente (4-6). Este fenómeno se debe a un acortamiento de la fase folicular sin ningún cambio asociado en la duración de la fase lútea (5, 7). Otro rasgo distintivo de la edad reproductiva avanzada es el aumento de la FSH no acompañado de un aumento de la LH (aumento monotrópico de la FSH) (6-9). El inicio del aumento monotrópico de la FSH y el adelanto de la ovulación parecen estar asociados temporalmente a una aceleración de la tasa de atresia folicular que, en última instancia, conduce al agotamiento de la reserva folicular (10). Por lo tanto, el aumento monotrópico de la FSH y el acortamiento de la fase folicular sirven como indicadores clínicos del avance de la edad reproductiva y de la rápida disminución de la fertilidad (11).

Durante el ciclo menstrual normal, la FSH se eleva en la fase lútea tardía o en la fase folicular temprana y suele alcanzar un pico en la fase folicular temprana (12, 13). Con la selección y el posterior desarrollo del folículo dominante, la FSH desciende a un nivel relativamente bajo hasta la oleada de gonadotropinas de mitad de ciclo. El folículo dominante en las mujeres eumenorreicas de edad reproductiva avanzada es relativamente saludable, crece hasta alcanzar un tamaño normal, produce niveles normales o elevados de estradiol (E2) y secreta niveles normales de progesterona después de la luteinización (7, 8, 14). Estas características normales del folículo dominante de edad avanzada sugieren que la ovulación más temprana en las mujeres de edad avanzada no se debe a un defecto intrínseco del folículo, sino al medio hormonal extrafolicular. Los cambios endocrinológicos descritos de forma más consistente en los estudios sobre el envejecimiento reproductivo son un aumento del nivel absoluto de FSH (6-9), un aumento más temprano de la FSH en la fase folicular temprana (7) y una disminución de los niveles de inhibina B en la fase folicular temprana (15-18).

El presente estudio se llevó a cabo para determinar si la fase folicular acortada en las mujeres mayores ovuladoras es secundaria a una foliculogénesis avanzada (es decir, más temprana) o acelerada (es decir, más rápida). Nuestra hipótesis es que el desarrollo folicular dominante más temprano en las mujeres mayores es secundario al aumento más temprano de la FSH folicular en comparación con el de los controles más jóvenes, y que la tasa absoluta de crecimiento folicular sería similar en ambas edades. En otras palabras, nuestra hipótesis es que el desarrollo folicular en las mujeres de edad reproductiva avanzada se adelanta en lugar de acelerarse. Los efectos hormonales e intraováricos del ciclo menstrual precedente pueden confundir los estudios de reclutamiento y maduración de los folículos dominantes. Para eliminar cualquier influencia del ciclo anterior, suprimimos el eje HPO de cada sujeto mediante la regulación estándar de agonistas GnRH. Después de documentar la supresión del eje HPO, comparamos la recuperación de la función hormonal, folicular y menstrual en sujetos ovulatorios de edad avanzada en comparación con un grupo de control más joven.

Sujetos y métodos

Sujetos experimentales

Como parte de una serie de estudios sobre el envejecimiento reproductivo normal, reclutamos a mujeres ovulatorias sanas, de 40 a 45 años (n = 16) y de 20 a 25 años (n = 15), para que participaran. Todos los sujetos debían tener ciclos menstruales regulares (intervalos de ciclo de 21-35 días), un índice de masa corporal normal (18-24 kg/m2) y ausencia de trastornos médicos o reproductivos (incluidos los antecedentes de infertilidad) y demostrar niveles séricos medio-lúteos de PRL inferiores a 20 ng/ml, progesterona superior a 10 nmol/litro y testosterona inferior a 3 nmol/litro en un ciclo previo al estudio. Durante la duración del estudio, todos los sujetos se mantuvieron en abstinencia sexual o utilizaron métodos anticonceptivos no hormonales (por ejemplo, método de barrera o dispositivo intrauterino). Se obtuvo el consentimiento por escrito de cada participante y se proporcionó una compensación monetaria a todos los voluntarios. El protocolo fue revisado y aprobado por la junta de revisión de sujetos humanos de la Universidad de Washington.

Materiales y métodos

Protocolo del estudio.

Como ciclo de control, todos los sujetos se sometieron a venopunción diaria y a ultrasonografías transvaginales seriadas para evaluar el desarrollo del folículo dominante en la fase folicular de un ciclo natural espontáneo. Para el ciclo de estudio, se inició el acetato de nafarelina (400 μg, por vía intranasal, diariamente) 7 días después de que los kits de LH en orina detectaran el aumento de gonadotropinas en la mitad del ciclo anterior. Cuando se confirmó la supresión del eje HPO por un nivel de E2 en suero por debajo del límite de detección del ensayo (73 pmol/litro), se continuó con la nafarelina durante 5 días más para asegurar una regulación descendente uniforme del eje HPO. A partir del día siguiente a la interrupción de la nafarelina, se realizó una venopunción diaria para el análisis de E2. Una vez que la concentración sérica de E2 alcanzó o superó los 367 pmol/litro, se realizaron ecografías transvaginales diarias hasta que se observó el colapso del folículo dominante. El ciclo del estudio se inició dentro de los 6 meses del ciclo de control.

Ensayos.

Todas las muestras de suero de un sujeto concreto se analizaron por duplicado en el mismo ensayo para minimizar los efectos de la variabilidad intraensayo. Los niveles de FSH en suero se determinaron utilizando un ELISA monoclonal de dos sitios en fase sólida (DELFIA, Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Los coeficientes de variación (CV) inter e intraensayo fueron del 4,6% y del 2,3%, respectivamente. El RIA para la E2 sérica se realizó utilizando reactivos suministrados por ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA). El CV inter e intraensayo fue del 18% y del 9%, respectivamente. Para medir la inhibina B se utilizó un ELISA en fase sólida tipo sándwich (Serotec, Oxford, Reino Unido), basado en el uso de placas recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para la subunidad β de la inhibina. La inhibina B se detecta utilizando un segundo anticuerpo monoclonal específico para la subunidad α de la inhibina, y el procedimiento de ensayo, según el fabricante, implica el pretratamiento de las muestras con los reactivos suministrados en los kits (dodecil sulfato de sodio y peróxido). La sensibilidad analítica (por ejemplo, la mínima para la subunidad βA de la inhibina) se determinó con un anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de rábano picante específico para la subunidad α utilizada para la detección. El estándar de ensayo proporcionado por el fabricante se calibró utilizando el primer estándar internacional de la OMS para la inhibina (inhibina humana recombinante; lote 91/624), y los resultados se indican como unidades internacionales por mililitro de este material de referencia. El ensayo se controló por duplicado utilizando alícuotas de muestras que contenían 2,00 o 9,56 UI/ml, respectivamente. Sobre la base de estos controles de calidad, el CV entre ensayos fue del 8,7% y del 3,3%, respectivamente, en los 57 ensayos utilizados para obtener los datos aquí presentados.

Análisis estadístico.

Para los resultados con un único valor de datos de cada individuo (por ejemplo, la longitud de la fase folicular), se compararon las medias de las dos cohortes mediante una prueba t de dos caras. Se seleccionó un α = 0,05 para indicar una diferencia significativa. Para los resultados con varios valores de datos de cada individuo (por ejemplo, niveles de E2 en serie), las medias de las muestras se compararon mediante ANOVA con medidas repetidas. Basándonos en los resultados de estudios anteriores, esperábamos que la variabilidad en el tiempo hasta el inicio de la oleada de LH fuera aproximadamente del 20%. Por lo tanto, asumiendo un coeficiente de variación del 20%, estimamos que tendríamos un 80% de posibilidades de encontrar una diferencia tan pequeña como el 20% con 15 sujetos en cada grupo.

Resultados

Dos mujeres jóvenes y una mayor fueron retiradas del estudio debido a que no se logró la supresión del eje HPO. Las características basales del ciclo de control de los sujetos restantes se muestran en la Tabla 1. Como era de esperar, los sujetos de mayor edad mostraron una fase folicular más corta, así como una FSH elevada y una inhibina B disminuida en el día 3 del ciclo de control, en comparación con los sujetos más jóvenes. Tanto en los ciclos de control como en los del estudio, todos los sujetos de cada grupo de edad desarrollaron un folículo dominante con evidencia ecográfica del posterior colapso del folículo tras el aumento de LH a mitad del ciclo, demostrando un desarrollo del folículo dominante y una ovulación aparentemente normales tanto en los ciclos naturales como tras la interrupción de la supresión de GnRH. La duración de Synarel (Searle, Skokie, IL) necesaria para lograr la supresión definida por el protocolo del estudio fue algo mayor en los controles más jóvenes (rango, 9-20 d; media, 12,8 ± 0,8 d; dosis total, 5,1 ± 0,3 mg) en comparación con los sujetos de mayor edad (rango, 9-13 d; media, 11.0 ± 0,3 d; dosis total, 4,4 ± 0,1 mg; P = 0,05 tanto para la duración como para la dosis).

Duración de la fase folicular

Para los fines de este estudio, dividimos la fase folicular en dos intervalos: fase folicular temprana (definida como el tiempo que transcurre desde el inicio de la menstruación o la interrupción de la supresión con agonistas de la GnRH hasta el pico de FSH de la fase folicular temprana) y tardía (definida como el tiempo que transcurre desde el pico de FSH temprana hasta el aumento de gonadotropinas de la mitad del ciclo). Los intervalos de la fase folicular (total, temprana y tardía) se muestran en la Fig. 1. Tras la liberación de la supresión del eje HPO, la cohorte de mayor edad alcanzó un pico de FSH folicular temprana antes (6,8 ± 0,7 frente a 9,8 ± 0,6 d, respectivamente; P < 0,01), dando lugar a una fase folicular temprana más corta. Además, la cohorte de mayor edad tuvo un tiempo más corto desde la liberación de la supresión hasta el subsiguiente aumento de LH (17,5 ± 0,9 frente a 20,8 ± 0,7 días, respectivamente; P < 0,01), para una fase folicular total más corta. Sin embargo, el tiempo transcurrido desde el pico de FSH en la fase folicular temprana hasta el aumento de LH en la mitad del ciclo (fase folicular tardía) fue similar en los grupos de mayor y menor edad (10,7 ± 0,7 frente a 11,0 ± 0,8 días, respectivamente; P = 0,74). Tanto en los sujetos de mayor edad como en los más jóvenes, el tiempo transcurrido desde la interrupción de la nafarelina hasta el subsiguiente aumento de LH fue más largo que la fase folicular del ciclo de control (mayores, 17,5 frente a 12,9 d; jóvenes, 20,8 frente a 14,8 d).

FSH

Los perfiles de FSH que rodean el pico de FSH de la fase folicular temprana para los ciclos de control y de estudio se representan en la Fig. 2. El nivel máximo de FSH en la fase folicular temprana fue mayor en los sujetos de mayor edad, tanto en el ciclo de control (12,0 ± 1,4 frente a 6,8 ± 0,3 mUI/ml, respectivamente; P < 0,01) como en el del estudio (12,1 ± 1,9 frente a 6,5 ± 0,4 mUI/ml, respectivamente; P < 0,01). No se observaron diferencias en la magnitud del pico de FSH entre los ciclos de control y de estudio dentro de cada grupo de edad (Fig. 2). Por lo tanto, la magnitud del pico de FSH parece ser independiente de la influencia de la fase lútea precedente en ambos grupos de edad.

Secreción de hormonas ováricas

Los productos secretores predominantes del folículo dominante son el E2 y la inhibina A. La figura 3 muestra las concentraciones de E2 en la fase folicular, normalizadas con respecto al pico de LH, para ambos grupos de edad en los ciclos de control y de estudio. El patrón y la cantidad de E2 secretada por el folículo dominante son similares entre los ciclos de estudio y de control en ambos grupos de edad. Aunque la pendiente del aumento de E2 y el tamaño del folículo dominante no fueron diferentes entre los grupos, el pico de E2 a mitad del ciclo fue mayor en las mujeres de más edad tanto en los ciclos de control (1175 ± 73 frente a 973 ± 76 pmol/litro, respectivamente; P = 0,05) como en los del estudio (1351 ± 91 frente a 1061 ± 94 pmol/litro, respectivamente; P < 0,05). En ambos ciclos, los sujetos de mayor edad también mostraron concentraciones normales de inhibina A en la fase folicular, sin que se observaran diferencias entre los ciclos de control y de estudio (Fig. 4). Los sujetos de mayor edad presentaron mayores concentraciones de inhibina A a mitad de ciclo tanto en los ciclos de control (3,44 ± 0,45 frente a 2,50 ± 0,25 UI/ml, respectivamente; P = 0,08) como en los del estudio (3,32 ± 0,37 frente a 2,54 ± 0,26 UI/ml, respectivamente; P = 0,10), pero este aumento no alcanzó significación estadística. Por lo tanto, el folículo dominante de una mujer ovulatoria de edad avanzada secreta concentraciones normales o elevadas tanto de E2 como de inhibina A. La secreción de estas hormonas foliculares no se ve afectada por la supresión previa del eje HPO.

En contraste con la inhibina A, la inhibina B, que es producida predominantemente por los folículos antrales pequeños (<10 mm) (19, 20), fue significativamente menor en la fase folicular temprana en las mujeres mayores tanto en los ciclos de control como en los de estudio (Fig. 5). Obsérvese que no todos los sujetos tenían suficientes alícuotas de suero para realizar los ensayos de inhibina A y/o B; por lo tanto, el número de sujetos analizados se indica en la leyenda de cada figura.

Discusión

Estudios anteriores han demostrado un acortamiento progresivo de la fase folicular con el avance de la edad a pesar de que el tamaño del folículo dominante, la capacidad secretora y la ovulación son aparentemente normales (5, 7, 14). Las posibles explicaciones incluyen una selección más temprana (avanzada) o un desarrollo más rápido (acelerado) del folículo dominante. En cualquiera de los casos, los factores que determinan la duración de la fase folicular incluyen potencialmente alteraciones en la fisiología de la fase lútea (que afectan a los mecanismos de señalización paracrinos y/o endocrinos) o cambios en las interacciones HPO de la fase folicular temprana. El presente estudio fue diseñado para eliminar los efectos de la fase lútea precedente mediante la supresión del eje HPO en un grado similar. De este modo, la fase folicular podría examinarse desde un punto de partida similar.

Los estudios de la fase folicular en mujeres normales han demostrado que la FSH comienza a aumentar en la fase lútea tardía, alcanza un pico en la fase folicular temprana y posteriormente disminuye con la aparición de un folículo dominante (21, 22). La aparición ecográfica del folículo dominante se asocia con un aumento de la E2 sérica que, a su vez, se correlaciona con un descenso de los niveles de FSH (23). Por lo tanto, nos centramos en el pico de FSH de la fase folicular temprana como indicador de la selección del folículo dominante. Tanto en los ciclos de control como en los ciclos que siguen a la supresión del eje HPO, la fase folicular en las mujeres mayores se acorta aproximadamente 2-3 días; concretamente, el pico de FSH de la fase folicular temprana se produce antes. Los resultados del presente estudio sugieren que esta fase folicular acortada en las mujeres mayores se debe a un reclutamiento avanzado (es decir, una selección más temprana del folículo dominante) y no a un crecimiento acelerado (es decir, más rápido) del folículo dominante. Si las mujeres de edad avanzada tuvieran un crecimiento acelerado del folículo dominante, habríamos esperado encontrar una diferencia entre el tiempo transcurrido desde el pico folicular temprano de FSH hasta el aumento de LH entre los grupos.

Un mecanismo putativo para la fase folicular acortada en las mujeres de edad avanzada es el aumento más temprano y más alto de FSH en estos sujetos en comparación con los más jóvenes. Este fenómeno se produjo en ausencia de la influencia de la fase lútea precedente, lo que sugiere que el inicio y la magnitud de la elevación folicular temprana de la FSH pueden deberse a diferencias sutiles en las hormonas ováricas de la fase folicular temprana asociadas a la disminución de la reserva ovárica. Por otro lado, observamos que la fase folicular fue más larga en ambos grupos de edad tras la supresión con nafarelina en comparación con la del ciclo de control. Aunque este hallazgo se debe probablemente en parte al tiempo necesario para que la hipófisis recupere la capacidad de respuesta a la GnRH (24), también apoya el concepto de que el reclutamiento folicular dominante se inicia en la fase lútea del ciclo menstrual anterior (25).

Una hormona candidata que probablemente sea responsable de las diferencias observadas en la secreción de FSH en la fase folicular temprana es la inhibina B, una glicoproteína heterodimérica de 32 kDa secretada por los folículos ováricos que inhibe selectivamente la secreción de FSH. Los niveles de inhibina B están correlacionados con el tamaño de la cohorte de folículos antrales tempranos en desarrollo (26). La disminución de los niveles de inhibina B en las mujeres ovulatorias de edad avanzada puede ser el resultado de la atresia folicular progresiva y la correspondiente disminución del número de folículos antrales (10, 27). Las mujeres mayores con elevaciones de FSH tienen menores niveles de inhibina B en la fase folicular temprana, presumiblemente un reflejo de la disminución del número de folículos ováricos (19, 20, 28). Este patrón hormonal persiste después de la regulación hipofisaria, lo que sugiere que los bajos niveles de inhibina B en las mujeres mayores son independientes de la secreción de inhibina o esteroides en la fase lútea.

El tamaño normal del folículo dominante y la secreción normal de E2 e inhibina A en la fase folicular indican que, una vez reclutado, el folículo dominante en las mujeres mayores es sano y responde a la estimulación de FSH. Sin embargo, parece que son necesarios niveles más altos de FSH para reclutar y mantener la función normal del folículo dominante. Los mayores niveles de E2 a mitad de ciclo registrados en mujeres ovulatorias de edad avanzada (14, 29) pueden deberse a una secreción más intensa por parte del folículo dominante y/o pueden ser el resultado de las contribuciones de los folículos secundarios. Nuestros estudios anteriores sobre el contenido de esteroides en el líquido folicular sugieren que el folículo dominante es el principal responsable de los mayores niveles de E2 circulante observados en las mujeres premenopáusicas de más edad (14). Los resultados del presente estudio apoyan una relación entre el aumento monotrópico de FSH y el desarrollo temprano y la ovulación del folículo dominante. Son necesarios más estudios para determinar si existe también una relación entre el aumento de la FSH, los niveles preovulatorios más elevados de E2 y/o la tasa acelerada de atresia folicular observada cerca del final de la cuarta década.

En conclusión, este estudio proporciona pruebas de que la fase folicular acortada observada en las mujeres mayores y ovulatorias se debe al acortamiento de la porción temprana de la fase folicular. La fase folicular tardía permanece inalterada en cuanto a su duración y perfil hormonal. Esto sugiere que el crecimiento del folículo dominante no se acelera, sino que se adelanta su selección. Este estudio también demuestra que la fase folicular acortada de la mujer ovulatoria de mayor edad no depende de las influencias hormonales de la fase lútea precedente.

Agradecemos a la Sra. Gretchen Davis y a la Sra. Laurie Guidry por su ayuda en el reclutamiento de sujetos y la gestión del proyecto, al Sr. Patrick Clarke por su ayuda con las ilustraciones, y a la Sra. Dorothy McGuinness, al Sr. Arlen Sarkissian, al Sr. Joseph Moy y a la Sra. Sheila Mallette por su asistencia técnica experta en los ensayos.

Este trabajo fue apoyado por la subvención RO1-AG-14579 del NIA y la subvención U54-HD29164 del NICHHD.

Abstenciones:

• CV,

  Coeficiente(s) de variación;

• E2,

  estradiol;

• HPO,

  hipotálamo-hipófisis-ovario.