HCoV-229E (VR-740) y HCoV-OC43 (VR-1558) se propagaron en fibroblastos humanos diploides de pulmón MRC-5 (CCL-171) y WI-38 (CCL-75), respectivamente (todos de ATCC, Manassas, VA). Ambas líneas celulares humanas se cultivaron en MEM complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). El medio de infección del virus consistió en MEM o RPMI-1640 más un 2% de FBS inactivado por calor para HCoV-229E y HCoV-OC43, respectivamente. Las cepas virales se propagaron mediante la inoculación de frascos que contenían células huésped de 24 horas de edad, que eran confluentes en un 80-90%. Tras una hora de incubación, se lavó la monocapa celular y se incubó en medio de infección fresco durante tres o cuatro días a 35 °C para el HCoV-229E y a 33 °C para el HCoV-OC43. A continuación, se recogió el sobrenadante que contenía el stock viral de trabajo mediante centrifugación (300 g durante 15 minutos). El título del virus se determinó mediante el 50% de la dosis infectiva de cultivo de tejidos TCID50 evaluando los efectos citopáticos (CPE), que se puntuaron en un microscopio de campo brillante (10×) como vacuolización del citoplasma, redondeo de las células y descamación.
Cámara de irradiación de aerosoles de mesa
Se utilizó una cámara de irradiación de aerosoles/virus dinámica de un solo paso para generar, exponer y recoger muestras de aerosoles como se ha descrito previamente23. Los aerosoles virales se generaron añadiendo una solución de virus en un nebulizador de terapia respiratoria de aerosol extendido de alto rendimiento (Westmed, Tucson, AZ) y operando con una bomba de aire con un flujo de entrada de 11 L/min. El virus fluyó hacia la cámara y se mezcló con aire seco y humidificado para mantener la humedad entre aproximadamente el 50-70%. La humedad relativa, la temperatura y la distribución del tamaño de las partículas del aerosol se controlaron durante toda la operación. El aerosol se expuso a la luz UVC lejana y finalmente se recogió utilizando un BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
La lámpara UVC lejana se colocó a unos 22 cm de distancia de la cámara de exposición a los rayos UV y se dirigió a la ventana de plástico transmisora de rayos UV de 26 cm × 25,6 cm × 254 μm (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). En consonancia con nuestros experimentos anteriores utilizando esta cámara23, el flujo a través del sistema fue de 12,5 L/min. El volumen de la región de exposición a la radiación UV era de 4,2 L, por lo que cada aerosol estuvo expuesto durante aproximadamente 20 segundos mientras atravesaba la ventana. Toda la cámara de irradiación estaba contenida en una cabina de bioseguridad de nivel 2 y todas las entradas y salidas de aire estaban equipadas con filtros HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) para evitar que la contaminación no deseada entrara o saliera del sistema.
Desempeño de la cámara de irradiación
La cámara de irradiación personalizada simulaba la transmisión de virus en aerosol producidos a través de la tos y la respiración humanas. La cámara funcionó con una humedad relativa media del 66% y una temperatura media de 24 °C en todas las ejecuciones. La distribución media del tamaño de las partículas fue del 83% entre 0,3 μm y 0,5 μm, del 12% entre 0,5 μm y 0,7 μm, y del 5% >0,7 μm (Tabla 3). Los virus aerosolizados se transmitieron eficientemente a través del sistema, como lo demuestra el control (exposición cero) que muestra una clara integración del virus (Figs. 2 y 3, paneles superiores izquierdos).
Lámpara de UVC lejano y dosimetría
La fuente de UVC lejano utilizada en este estudio fue un módulo de lámpara de excímero KrCl de 12 W y 222 nm fabricado por USHIO America (Artículo #9101711, Cypress, CA). La lámpara está equipada con una ventana de filtrado óptico patentada para reducir las emisiones de la lámpara fuera del pico de emisión de KrCl de 222 nm. La lámpara se colocó a 22 cm de la ventana de la cámara de exposición y se dirigió al centro de la ventana. Las mediciones de la potencia óptica se realizaron utilizando un fotodetector de silicio de baja potencia UV mejorado 818-UV/DB con un medidor de potencia óptica 843-R (Newport, Irvine, CA). La dosimetría se realizó antes de iniciar un experimento para medir la fluencia dentro de la cámara en la posición del aerosol.
La distancia entre la lámpara y la cámara de irradiación permitió que una sola lámpara irradiara uniformemente toda el área de la ventana de exposición. Las mediciones realizadas con el fotodetector de silicio indicaron una intensidad de exposición de aproximadamente 90 μW/cm2 en toda el área de exposición. La cámara está equipada con una superficie de aluminio reflectante frente a la ventana de exposición. Al igual que en nuestro trabajo anterior con esta cámara23, la reflectividad de esta superficie era de aproximadamente el 15%. Por tanto, hemos estimado de forma conservadora que la intensidad en toda el área de exposición es de 100 μW/cm2. Con la lámpara colocada a 22 cm de la ventana y dados los 20 segundos necesarios para que una partícula de aerosol atraviese la ventana de exposición, hemos calculado que la dosis total de exposición a una partícula es de 2 mJ/cm2. Utilizamos hojas adicionales de ventanas de plástico transmisor de UV para reducir uniformemente la intensidad en toda la región de exposición para crear diferentes condiciones de exposición. Mientras que en nuestro trabajo anterior con estas láminas medimos una transmisión más cercana al 65%23 , para estas pruebas medimos que la transmisión de 222 nm de cada lámina era de aproximadamente el 50%. Esta disminución de la transmisión se debe probablemente a la fotodegradación del plástico con el tiempo4. La adición de una o dos láminas del plástico que cubren la ventana de exposición disminuye la dosis de exposición a 1 y 0,5 mJ/cm2, respectivamente.
Protocolo experimental
Como se describió anteriormente23, la solución de virus en el nebulizador consistió en 1 ml de medio de Eagle modificado (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) que contenía 107-108 TCID50 de coronavirus, 20 ml de agua desionizada y 0,05 ml de solución salina equilibrada de Hank con calcio y magnesio (HBSS++). La cámara de irradiación se puso en funcionamiento con partículas de virus aerosolizadas fluyendo a través de la cámara y el canal de derivación durante 5 minutos antes de cada muestreo, con el fin de establecer el valor de HR deseado. La recogida de muestras se inició cambiando el flujo de aire del canal de derivación al BioSampler utilizando el conjunto de válvulas de tres vías. El BioSampler se llenó inicialmente con 20 ml de HBSS++ para capturar el aerosol. Durante cada tiempo de muestreo, que duró 30 minutos, el interior de la cámara de irradiación se expuso a la luz UVC lejana de 222 nm que entraba a través de la ventana de plástico. La variación de la dosis de UVC lejana suministrada a las partículas de aerosol se consiguió insertando películas de plástico transparentes a la luz ultravioleta adicionales, como se ha descrito anteriormente, suministrando así las tres dosis de prueba de 0,5, 1,0 y 2,0 mJ/cm2. Los estudios de control de dosis cero se realizaron con la lámpara excimer apagada. Una vez completado el periodo de muestreo, la solución del BioSampler se utilizó para los ensayos de infectividad del virus.
Ensayos de infectividad del virus
TCID50
Utilizamos el ensayo de dosis infecciosa del 50% en cultivo de tejidos para determinar la infectividad del virus28. Brevemente, se sembraron 105 células huésped en cada pocillo de placas de 96 pocillos el día anterior al experimento. Las células se lavaron dos veces en HBSS++ y se superpusieron a las células diluciones seriadas 1:10 en medio de infección del virus expuesto del BioSampler durante dos horas. A continuación, las células se lavaron dos veces en HBSS++, se cubrieron con medio de infección fresco y se incubaron durante tres o cuatro días a 34 °C. Los efectos citopáticos (CPE) se calificaron con un microscopio de campo claro (10×) como vacuolización del citoplasma, redondeo de las células y desprendimiento. El TCID50 se calculó con el método de Reed y Muench28,38. Para confirmar las puntuaciones del CPE, las muestras se fijaron en metanol al 100% durante cinco minutos y se tiñeron con violeta de cristal al 0,1%. Los resultados se informan como la estimación de las unidades formadoras de placas (UFP)/ml utilizando la conversión UFP/ml = 0,7 TCID50 aplicando la distribución de Poisson29.
Inmunofluorescencia
Para evaluar si las dosis crecientes de luz de 222 nm reducían el número de células infectadas, realizamos un protocolo estándar de inmunotinción fluorescente para detectar un antígeno viral en las células humanas del huésped23. Brevemente, se colocaron 2 × 105 células huésped (células MRC-5 para el HCoV-229E y WI-38 para el HCoV-OC43) en cada pocillo de placas de 48 pocillos el día anterior al experimento. Tras pasar por la cámara de irradiación durante 30 minutos, se superpusieron 150 μl de la suspensión de virus recogida en el BioSampler sobre la monocapa de células huésped. Las células se incubaron con el virus durante una hora, se lavaron tres veces con HBSS++ y se incubaron durante toda la noche en medio de infección fresco. A continuación, las células infectadas se fijaron en metanol 100% frío a 4 °C durante 5 minutos y se marcaron con la glicoproteína anti-coronavirus humano (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 en HBSS++ que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave. Las células se lavaron tres veces en HBSS++ y se marcaron con Alexa Fluor-488 antiratón de cabra (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 en HBSS++ con 1% de BSA, a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad con agitación suave. Tras tres lavados en HBSS++, las células se tiñeron con Vectashield que contenía DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se observaron con el objetivo de 10× de un microscopio fluorescente Olympus IX70 equipado con una cámara digital Photometrics PVCAM de alta resolución y alta eficiencia y el software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Para cada dosis de 222 nm y cada género de virus, los resultados representativos se repitieron dos veces. Para cada muestra, se adquirieron hasta diez campos de visión de imágenes fusionadas de DAPI y Alexa Fluor-488.
Análisis de datos
La fracción superviviente (S) del virus se calculó dividiendo la fracción PFU/ml a cada dosis de UV (PFUUV) por la fracción a dosis cero (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Los valores de supervivencia se calcularon para cada experimento repetido y se transformaron en logaritmo natural (ln) para aproximar la distribución de errores a la normalidad39. Se realizó una regresión lineal robusta utilizando mínimos cuadrados reponderados iterados (IWLS)40,41 en el software R 3.6.2 utilizando estos valores ln normalizados como variable dependiente y la dosis de UV (D, mJ/cm2) como variable independiente. Utilizando este enfoque, la supervivencia del virus se describió mediante una cinética de primer orden según la ecuación4:
donde k es la constante de la tasa de inactivación UV o el factor de susceptibilidad (cm2/mJ). La regresión se realizó con el término de intercepción fijado en cero, lo que representa la definición de una supervivencia relativa del 100% a una dosis UV cero, por separado para cada cepa de virus estudiada. Los datos a dosis cero, que por definición representan ln = 0, no se incluyeron en la regresión. Las incertidumbres (intervalos de confianza del 95%, IC) para el parámetro k para cada cepa de virus se estimaron mediante bootstrapping para cada método de regresión porque el bootstrapping puede dar lugar a estimaciones de incertidumbre más realistas, en comparación con la aproximación analítica estándar basada en la normalidad asintótica, en conjuntos de datos pequeños como los utilizados aquí (n = 3 HCoV-229E y n = 4 para HCoV-OC43). La bondad del ajuste se evaluó mediante el coeficiente de determinación (R2). El análisis de los residuos para la autocorrelación y la heteroscedasticidad se realizó mediante la prueba de Durbin-Watson42 y la prueba de Breusch-Pagan (implementada por el paquete R lmtest)43 , respectivamente. Las estimaciones de los parámetros (k) para cada cepa de virus se compararon entre sí basándose en los IC del 95% y directamente mediante la prueba t, utilizando los tamaños de las muestras, los valores de k y sus errores estándar. La sección transversal de inactivación del virus, D90, que es la dosis de UV que inactiva el 90% del virus expuesto, se calculó como D90 = – ln/k. Otros valores D se calcularon de forma similar.